课题背景：课题受国家自然科学基金（39870651）及湖南省自然科学基金（04JJ6048）资助，自1993年始采用脐血输注治疗慢性肝炎，1995年始采用脐血输注治疗重型肝炎肝衰竭，共治疗近千例患者，取得了较好的临床效果，并同时进行了相应的基础实验研究，先后发表相关论文十余篇，其中SCI收录2篇，CSCD收录5篇，分别于1997年及2003年获湖南省医药卫生科技成果奖及湖南省科技进步奖。

应用要点：①直接利用人流胚胎作为干细胞来源，而不是利用细胞株，故试验所用细胞再生及分化能力强。②将胚胎原始生殖细胞直接移植，利用肝衰竭的体内环境促使其定向分化为肝细胞，从而治疗肝衰竭。

偏倚或不足：①如能以同位素标记原始生殖细胞后动态观察其在大鼠体内的分布，更具有说服力，可直接说明原始生殖细胞能在大鼠肝脏内定植。②如能在鼠肝中对已分化的人肝细胞特异基因片段进行检测，则能够直接说明原始生殖细胞可在大鼠肝脏内分化为肝细胞。

1中南大学肝病研究所，中南大学湘雅二医院感染科，湖南省长沙市 410011；2中南大学湘雅三医院感染科，湖南省长沙市 410013；3中南大学湘雅医学院2006级教改实验班，湖南省长沙市 410013；4中南大学湘雅医学院2003级精神卫生 1班，湖南省长沙市 410013

唐晓鹏☆，男，1959年生，湖南省城步县人，汉族，1983年湖南医科大学毕业，博士，教授，主要从事干细胞治疗肝衰竭方面的研究。
xiaopeng1959@
163.com

国家自然科学基金（39870651）*；湖南省自然科学基金（04JJ60
48）*

摘要
目的: 胚胎原始生殖细胞能以原始胚胎状态无限增殖，并可通过异体移植或适宜的体外环境自然分化为胚胎生殖层。实验拟进一步观察体外培养的胚胎原始生殖细胞对急性肝损伤大鼠的治疗效果，及其能否在大鼠体内分化为肝细胞。
方法：实验于2003-09/2005-05在中南大学肝病研究所完成。①细胞及动物：经中南大学湘雅二医院医学伦理委员会批准，取孕4~12周流产人胚胎，其双亲3代内无遗传性疾病，孕妇对流产胚胎用于实验均签署知情同意书。清洁级健康成年SD大鼠50只，随机数字表法分为5组：培养基对照组、单纯人胚原始生殖细胞组、人胚原始生殖细胞+环磷酰胺组、单纯鼠胚原始生殖细胞组、鼠胚原始生殖细胞+环磷酰胺组，10只/组。另选取健康成年SD孕鼠4只用于分离鼠胚原始生殖细胞。动物均由中南大学湘雅二医院动物实验中心提供，实验过程中对动物的处置符合动物伦理学标准。②实验方法：从人胚胎中分离出原始生殖嵴组织，悬浮培养获取人胚原始生殖细胞，用含15%胎牛血清的高糖DMEM基础培养基调节细胞浓度至1×108 L-1。取SD孕鼠胚胎分离生殖嵴，消化离心培养鼠胚原始生殖细胞，浓度1×108 L-1。各组大鼠均于腹腔内注射D-氨基半乳糖建立急性肝损伤模型，造模后48 h，培养基对照组自尾静脉输注基础培养基，其余4组给予对应细胞悬液及免疫抑制剂环磷酰胺。③实验评估：从细胞形态、表面标记及体外分化等方面检测人胚原始生殖细胞的生物学特性；比较各组大鼠肝功能、增殖细胞核抗原阳性率、糖原染色阳性率、肝脏病理改变；检测各组大鼠肝脏病理切片中人白蛋白、甲胎蛋白的表达。
结果：①人胚原始生殖细胞的生物学特性：培养1 d后单个原始生殖细胞形成细胞集落，以后集落逐渐增大并隆起，形成鸟巢状，周边界限清晰，内部细胞排列紧密。传代后原始生殖细胞集落呈自发分化趋势，周边出现成纤维样细胞，最后分化为梭形细胞、多边形细胞等。原代至第3代未分化的人胚原始生殖细胞集落碱性磷酸酶染色均呈阳性，分化的细胞及成纤维细胞呈阴性。②肝功能检测：细胞输注前各组丙氨酸转氨酶、天冬氨酸转氨酶、总胆红素水平均基本相似(t=0.361~1.183，P均 > 0.05)。输注后7 d与培养基对照组比较，单纯鼠胚原始生殖细胞组、鼠胚原始生殖细胞+环磷酰胺组上述3项指标水平均明显降低(t=2.532~8.361，P均 < 0.05)；后两组间比较差异无显著性意义(t=0.340~1.712，P均 > 0.05)。③增殖细胞核抗原阳性率：细胞输注后7d与培养基对照组比较，单纯鼠胚原始生殖细胞组、鼠胚原始生殖细胞+环磷酰胺组的增殖细胞核抗原阳性率均明显升高（t=9.020~10.747，P均 < 0.001）；后两组间比较差异无显著性意义(t=0.752，P=0.462)。④糖原染色：细胞输注后7 d，培养基对照组着色相对浅淡，呈细颗粒状，；单纯鼠胚原始生殖细胞组、鼠胚原始生殖细胞+环磷酰胺组着色相对深粗，呈斑块状聚集。⑤病理检测：细胞输注后7 d，培养基对照组肝索、肝窦结构排列欠规则，坏死区可见少量肝细胞再生，汇管区有大量炎症细胞浸润；单纯鼠胚原始生殖细胞组、鼠胚原始生殖细胞+环磷酰胺组各项病理情况均显著改善。⑥大鼠肝组织人白蛋白、甲胎蛋白的表达：细胞输注后14，21 d，单纯人胚原始生殖细胞组、人胚原始生殖细胞+环磷酰胺组表达人白蛋白及甲胎蛋白阳性细胞，培养基对照组未见表达。
结论：①胚胎原始生殖细胞移植有利于激发急性肝损伤大鼠肝细胞的增殖，改善肝功能，加速受损肝细胞的病理修复。②胚胎原始生殖细胞可在受体肝脏组织中生存，并分化为具有合成白蛋白及甲胎蛋白功能的肝细胞样细胞。
关键词：原始生殖细胞；胚胎干细胞；急性肝损伤；细胞移植

唐晓鹏，陈丽敏，唐元媛，陈丁，张旻.人胚胎原始生殖细胞移植治疗大鼠急性肝损伤[J].中国组织工程研究与临床康复，2008，12(12):2285-2290 [www.zglckf.com/zglckf/ejournal/upfiles/08-12/12k-2285(ps).pdf]

中图分类号: R394.2
文献标识码: A
文章编号: 1673-8225
(2008)12-02285-06

收稿日期：2007-09-26
修回日期：2007-12-27
(07-50-9-5266/ZS·Q)

Human embryonic primordial germ cell transplantation for treating rats with acute liver injury

Abstract

AIM:Embryonic primordial germ cells can proliferate infinitely in the form of primary embryo and differentiate into embryonic germ-layer by heterogeneous cell transplantation or suitable extraorgan condition. This study is planed to further observe the therapeutic efficacy of cultured in vitro primordial germ cells (PGCs) on acute hepatic injury rats and whether PGCs can differentiate into hepatocytes in rats.
METHODS: Experiments were performed from September 2003 to May 2005 in the Institute of Hepatology of Central South University. ①After the agreement of Ethics Committee of Xiangya Second Hospital of Central South University and signature of informed consent by the pregnant woman for the use of aborted embryo in the study, the aborted 4-12 week gestated human embryos were collected. No hereditary disease was found in the pregnant women and their 3-generation parents. Fifty clean healthy adult SD rats were divided into 5 groups by means of random digits table and 10 rats in each group, medium control group, human PGCs group, human PGCs and cyclophosphamide group, rat PGCs group, rat PGCs and cyclophosphamide group. Meanwhile, rat PGCs were isolated from 4 healthy pregnant SD rats. All animals were supplied by the Experimental Animal Center of Xiangya Second Hospital of Central South University. The animals were treated in accordance with ethical standard for animals. ②Human primordial germ tissue was isolated from human embryo. Then human PGCs were collected by suspension culture and the concentration of PGCs was adjusted to 1×108 L-1 with high glucose DMEM medium containing 15% fetal bovine serum (FBS). Rat germ ridge was isolated from pregnant SD rats, and then the rat germ ridge was digested and centrifugated. Rat PGCs were cultured and the concentration of cells was adjusted to 1×108 L-1. An acute liver injury model was constructed by intraperitoneally injecting D-galactosamine into SD rat. After model was established 48 hours, the rats in medium control group were treated with DMEM medium by caudal vein injection. Animals in other groups were treated with suspension of corresponding human/rat PGCs and immunosuppressant cyclophosphamide respectively. ③The biological characteristics of human PGCs were detected in aspects of the appearance, surface marks and differentiation in vitro. The liver function, liver pathology, proliferating cell nuclear antigen (PCNA) and glycogen staining positive rate of rats in each group were compared. Meanwhile, the expression of human albumin (ALB) and alpha fetoprotein (AFP) in rat liver tissue were detected.
RESULTS: ①The biological characteristics of human PGCs: PGC colony was formed from single PGC after 1-day culture, and then increased in size and bird nest shape with clear boundary and the cells arrange tightly inside appeared. The PGCs colony had a tendency of spontaneous differentiation after passage and fibroblasts appeared and finally differentiated into fusiform cells and polygon cells. The colony of the first to third generation of undifferentiated human PGCs were alkaline phosphatase staining positive, but the colony of differentiated human PGCs and fibroblasts were alkaline phosphatase staining negative. ②Liver function determination: Levels of alanine aminotransferase (ALT), aspartate aminotransferase (AST) and total bilirubin (TBil) were similar before PGCs infusion (t=0.361-1.183，P >0.05). The levels of ALT, AST and TBil were obviously decreased in rat PGCs group, rat PGCs and cyclophosphamide group when comparing to the medium control group after 7 days of PGCs infusion (t=2.532-8.361，P < 0.05). The difference between rat PGCs group and rat PGCs plus cyclophosphamide group was not significant (t=0.340-1.712，P > 0.05). ③Proliferating cell nuclear antigen (PCNA) staining positive rate: PCNA positive rate was much higher in the rat PGCs group, rat PGCs and cyclophosphamide group than in the medium control group after 7 days of PGCs infusion （t=9.020-10.747，P < 0.001）. The difference between the rat PGCs group and rat PGCs and cyclophosphamide group was not significant (t=0.752，P=0.462). ④Glycogen staining: The staining was light and fine grain in the medium control group after 7 days of PGCs infusion. However, the staining was dark and en plaque in the rat PGCs group, rat PGCs and cyclophosphamide group after 7 days of PGCs infusion. ⑤Pathology examination: The arrangement of hepatic cord and sinus hepaticus was not regular, and only a few of hepatocyte regeneration presented in zone of necrosis and much inflammatory cell infiltration can be found in the portal zone. The improvement of liver pathology was obvious in the rat PGCs group, rat PGCs and cyclophosphamide group. ⑥The expression of human ALB and human AFP in rat liver tissue: Human ALB and human AFP positive cells were present in the liver tissue of rats in the human PGCs group, human PGCs and cyclophosphamide group after 14, 21 days of human PGCs infusion, but no positive cell was found in the liver tissue of rats in the medium control group.
CONCLUSION: ①Transplantation of PGCs can induce hepatocyte proliferation and improve liver function in acute liver injury rats, and it is beneficial for the recovery of the damaged hepatocyte. ②PGCs can incorporate into the acute injury liver and differentiate into hepatocyte-like cells in the acute liver injury SD rats. These differentiated cells posses the ability to synthesize ALB and AFP.

Tang XP, Chen LM, Tang YY, Chen D, Zhang M.Human embryonic primordial germ cell transplantation for treating rats with acute liver injury.Zhongguo Zuzhi Gongcheng Yanjiu yu Linchuang Kangfu 2008;12(12):2285-2290(China)
[www.zglckf.com/zglckf/ejournal/upfiles/08-12/12k-2285(ps).pdf]

0 引言

干细胞是具有自我复制和多向分化潜能的原始细胞，是形成生命机体各种组织器官的起源细胞。
胚胎生殖细胞是从胚胎原始生殖嵴分离出的原始生殖细胞，是早期胚胎多能干细胞中的一种，具有稳定的二倍体核型，能以原始胚胎状态无限增殖，并可通过异体移植或适宜的体外环境自然分化为三种胚胎生殖层[1]。
本实验采用受精后4~12周人胚胎原始生殖嵴组织分离出人胚原始生殖细胞，初步建立原始生殖细胞体外培养体系，并将分离的原始生殖细胞输入急性肝损伤的SD大鼠体内，观察原始生殖细胞治疗大鼠急性肝衰竭的效果及其在大鼠肝脏微环境中能否分化为肝细胞或肝细胞样细胞。

1 材料和方法

设计：随机对照细胞观察。
单位：中南大学肝病研究所，中南大学湘雅二医院感染科，中南大学湘雅三医院感染科，中南大学湘雅医学院2006级教改实验班。
材料：实验于2003-09/2005-05在中南大学肝病研究所完成。①细胞：经中南大学湘雅二医院医学伦理委员会批准，人胚原始生殖细胞

来自流产的新鲜人胚，孕4~12周，确认其双亲3代内无遗传性疾病，孕妇均书面同意将其流产胚胎用于实验。②动物：清洁级健康成年SD大鼠50只，体质量（360±50）g，雌雄不拘，随机数字表法分为5组：培养基对照组、单纯人胚原始生殖细胞组、人胚原始生殖细胞+环磷酰胺组、单纯鼠胚原始生殖细胞组、鼠胚原始生殖细胞+环磷酰胺组，10只/组。另选取健康成年孕8~12 d的SD大鼠4只，体质量（400±50）g，用于分离鼠胚原始生殖细胞。大鼠均由中南大学湘雅二医院动物实验中心提供，动物质量合格证号：SCXK(湘)2002-0001，实验过程中对动物的处置符合动物伦理学标准。③试剂：原始生殖细胞基础培养基为含15%胎牛血清(Hyclone公司)的高糖DMEM (Gibical公司)；小鼠抗大鼠增殖细胞核抗原(Proliferating cell nuclear antigen，PCNA)单克隆抗体（美国Cell Science公司）；SP-小鼠抗人免疫组化超敏试剂盒，DAB试剂盒（福州迈新生物技术开发公司）；小鼠抗人白蛋白多克隆抗体（DAKO公司）。
设计、实施、评估者：设计、评估为第一作者，实施为第二、三、四、五作者，均经过系统培训，未使用盲法评估。
方法：
人胚原始生殖细胞悬液的制备：将流产胚胎用含有双抗的生理盐水反复冲洗后，在解剖显微镜下分离出含有原始生殖嵴的组织或原始生殖腺，剪成1 mm×1 mm×1 mm大小的组织块，加入消化液0.5 mL，37 ℃消化10~15 min，以原始生殖细胞培养液终止消化，经 1 000 r/min离心15 min后，加入原始生殖细胞培养液，于37 ℃、体积分数为0.05的CO2饱和湿度培养箱内培养。6 h后培养瓶内可见大量贴壁和悬浮细胞，汲取悬浮细胞加入新原始生殖细胞培养基继续培养，每天观察细胞生长状况，更换培养液，根据细胞生长情况3~5 d传代。将原代人胚原始生殖细胞用基础培养基接种于培养瓶中，37 ℃、体积分数为0.05的CO2培养箱中培养，体外扩增。传至第3代时，汲取20 μL细胞悬液，加入160 μL生理盐水，混匀；加入4 g/L锥虫蓝20 μL，用计数板快速计算细胞总数和活细胞数。计算细胞活性和细胞浓度。细胞存活率大于95%时，用基础培养基调节细胞浓度至1×108 L-1，4 ℃保存备用。
鼠胚原始生殖细胞悬液的制备：取SD孕鼠胚胎，无菌条件下分离生殖嵴，至含预先孵育好的无钙镁磷酸盐缓冲液的平皿中剪碎，加入消化液，37 ℃消化10 min，基础培养基中和、离心后，接种于培养瓶中, 37 ℃、体积分数为0.05的CO2培养箱中培养。计数后调节细胞浓度至1×108 L-1。
人胚原始生殖细胞碱性磷酸酶检测：去除原始生殖细胞培养皿内培养基，用磷酸盐缓冲液洗涤2遍，在体积分数为0.8的冷乙醇中固定0.5 h，再用磷酸盐缓冲液洗涤2遍后加入新鲜配制的检测孵育液，37 ℃避光孵育10~15 min后，去除孵育液，加入磷酸盐缓冲液，显微镜下观察结果。
人胚原始生殖细胞体外分化：观察培养的人胚原始生殖细胞形态，挑取未分化的原始生殖细胞集落，分别置含与不含成纤维细胞生长因子的基础培养基悬浮培养，观察细胞形态的变化。
急性肝损伤模型的建立：各组大鼠均造模，于腹腔内一次性注射0.5 g/kg的D-氨基半乳糖，48 h后急性肝损伤模型建立。
细胞干预处理：成功造模后，培养基对照组自尾静脉输注基础培养基1mL；单纯人胚原始生殖细胞组自尾静脉输注人胚原始生殖细胞悬液1 mL；人胚原始生殖细胞+环磷酰胺组自尾静脉输注人胚原始生殖细胞悬液 1 mL后，连续7 d腹腔内注射环磷酰胺2 mg/（100 g·d）；单纯鼠胚原始生殖细胞组自尾静脉输注鼠胚原始生殖细胞悬液1 mL；鼠胚原始生殖细胞+环磷酰胺组自尾静脉输注鼠胚原始生殖细胞悬液1 mL后，连续7 d腹腔内注射环磷酰胺2 mg/（100 g·d）。
宿主抗移植物排斥反应：细胞干预后，观察各组动物有无宿主抗移植物排斥反应发生。
肝功能检测：培养基对照组、单纯鼠胚原始生殖细胞组、鼠胚原始生殖细胞+环磷酰胺组大鼠分别于输注细胞悬液前及输注后7 d，取血检测丙氨酸转氨酶、天冬氨酸转氨酶、总胆红素水平。处死大鼠，取肝脏组织制备切片，作增殖细胞核抗原阳性半定量分析、糖原染色阳性率、肝脏病理检测。
增殖细胞核抗原阳性半定量分析：试验步骤按试剂盒说明操作。
糖原染色阳性率检测：常规方法进行糖原染色，糖原染色阳性反应为细胞浆中出现红色或紫红色的弥漫状、颗粒状的沉淀，细胞核呈蓝色；阴性反应为细胞浆和细胞核均呈蓝色。
肝脏病理检测：苏木精-伊红染色检测肝脏组织病理变化。
人白蛋白及甲胎蛋白免疫组化检测：培养基对照组、单纯人胚原始生殖细胞组、人胚原始生殖细胞+环磷酰胺组于输注细胞悬液后第14天随机处死部分大鼠，第21天处死每组剩余大鼠，取肝脏组织，免疫组化检测鼠肝脏中人ALB、AFP的表达，试验步骤按试剂盒说明操作。
主要观察指标：①人胚原始生殖细胞的生物学特性。②宿主抗移植物排斥反应。③肝功能检测。④增殖细胞核抗原阳性半定量分析。⑤糖原染色阳性率检测。⑥肝脏病理检测。⑦大鼠肝组织人白蛋白、甲胎蛋白的表达。

2 结果

2.1 实验动物数量分析 各组大鼠均成功造模，全部进入结果分析，中途无脱落。
2.2 人胚原始生殖细胞的生物学特性
2.2.1 生长行为 单个的原始生殖细胞体积比较大，核质比高，培养1 d后可见部分细胞逐渐形成细胞集落，以后集落逐渐增大并微微隆起，形成鸟巢状，集落周边界限清晰，内部细胞排列紧密，但界限不清晰，见图1。传代后的原始生殖细胞集落逐渐减少，出现自发分化的趋势。

2.2.2 碱性磷酸酶检测 原代至第3代未分化的人胚原始生殖细胞集落碱性磷酸酶检测均呈阳性，集落被染成黑色。分化的细胞及成纤维细胞碱性磷酸酶检测均呈阴性。
2.2.3 自发分化 传代过程中，不含成纤维细胞生长因子培养基培养的大部分原始生殖细胞集落出现自发分化，集落中央逐渐变黑，出现折光较暗的非细胞结构，集落周边出现成纤维样细胞，最后分化为各种形态的细胞，如梭形细胞、多边形细胞等。加入成纤维细胞生长因子培养基培养的原始生殖细胞多数仍保留未分化状况。
2.3 宿主抗移植物排斥反应 细胞输注后，各组大鼠均未出现脱毛、发热、皮疹、厌食、腹泻等明显的宿主抗移植物排斥反应。
2.4 肝功能检测 细胞输注前，培养基对照组、单纯鼠胚原始生殖细胞组、鼠胚原始生殖细胞+环磷酰胺组的丙氨酸转氨酶、天冬氨酸转氨酶、总胆红素水平均基本相似(t=0.361~1.183，P均 > 0.05)。细胞输注后7 d与培养基对照组比较，单纯鼠胚原始生殖细胞组、鼠胚原始生殖细胞+环磷酰胺组的丙氨酸转氨酶、天冬氨酸转氨酶、总胆红素水平均明显降低(t=2.532~8.361，P均< 0.05)；后两组间比较差异无显著性意义(t=0.340~1.712，P均 > 0.05)。见表1。

2.5 增殖细胞核抗原阳性半定量分析结果 细胞输注后7 d与培养基对照组比较，单纯鼠胚原始生殖细胞组、鼠胚原始生殖细胞+环磷酰胺组的增殖细胞核抗原阳性率均明显升高[（31.9±7.8）%，（68.8±10.3）%，（72.1±8.9）%；t=9.020~10.747，P均 < 0.001]；后两组间增殖细胞核抗原阳性率比较差异无显著性意义(t=0.752，P=0.462)。
2.6 糖原染色阳性率检测 细胞输注后7 d，培养基对照组、单纯鼠胚原始生殖细胞组、鼠胚原始生殖细胞+环磷酰胺组大鼠肝脏病理切片均可见大片糖原染色阳性细胞；培养基对照组着色相对浅淡，呈细颗粒状，分布均匀；单纯鼠胚原始生殖细胞组、鼠胚原始生殖细胞+环磷酰胺组着色相对深粗，呈斑块状聚集。
2.7 病理检测 细胞输注后7 d大鼠肝脏病理切片苏木精-伊红染色结果显示，培养基对照组镜下肝索、肝窦结构排列欠规则，少数肝细胞仍可见较明显的凝固性坏死及水变性，坏死区可见少量肝细胞再生，汇管区有大量炎症细胞浸润；单纯鼠胚原始生殖细胞组、鼠胚原始生殖细胞+环磷酰胺组的肝脏病理组织镜下所见大体一致，肝索、肝窦结构基本排列正常，部分肝细胞可见水变性，再生肝细胞数明显增多，汇管区炎症细胞浸润明显减轻。
2.8 大鼠肝组织人白蛋白、甲胎蛋白表达检测 培养基对照组未见人白蛋白、甲胎蛋白阳性细胞；细胞输注后14，21 d，单纯人胚原始生殖细胞组、人胚原始生殖细胞+环磷酰胺组可见部分人白蛋白及甲胎蛋白阳性细胞，主要分布于汇管区、肝窦和肝小叶中央静脉周围，见图2。

3 讨论

原始生殖细胞是哺乳动物各级生殖细胞的祖细胞，是生殖细胞区别于体细胞的最初形式。42 d的人胚约有 1 000个原始生殖细胞。第12周后生殖嵴的阶段特异性胚胎抗原表达下降，Oct4不表达，表明原始生殖细胞已经大部分分化为精原细胞或卵原细胞，此期生殖嵴已经不能用于培养胚胎生殖细胞[2]。本实验发现孕8、9周时胚胎的原始生殖细胞为相对适宜材料，原代培养获得克隆数较多。再早期的原始生殖细胞理论上说具有很好的发育潜能，但由于取材及分离困难、细胞数过少且易于在操作中丢失和原代克隆形成率低而不利于扩增、培养。
碱性磷酸酶是一种单酯磷酸水解酶，许多研究结果表明碱性磷酸酶的高表达与未分化的多能干细胞相关,如桑椹胚和胚泡细胞中均有碱性磷酸酶的表达，胚胎干细胞中也都含有丰富的碱性磷酸酶,而在已分化的胚胎干细胞中碱性磷酸酶呈弱阳性或阴性。碱性磷酸酶的测定目前常用于鉴定胚胎干细胞分化与否。本实验参照Shamblott等[3]建立原始生殖细胞系的方法，获得的原始生殖细胞从取材部位，细胞形态，生长行为，自发分化成多种细胞及碱性磷酸酶检测阳性等方面初步证实具有原始生殖细胞的特征。原始生殖细胞体外培养一个很大难题就是其存在自发分化的现象，本实验通过添加成纤维细胞生长因子并用碱性磷酸酶检测证明在一定时期内可以保持原始生殖细胞不分化状态。
近年来随着细胞技术的发展及应用，人们已成功分离和培养胚胎生殖细胞。目前国内外均有文献报道在体外一定条件下胚胎干细胞能分化为肝细胞或肝细胞样细胞[4-17]。采用细胞共同培养技术已能将小鼠胚胎干细胞诱导分化为肝细胞，且该肝细胞能表达成熟肝细胞标识物如：酪氨酸转移酶、葡萄糖-6-磷酸酶等。Hamazaki等[18]将分离的小鼠胚胎干细胞加入酸性成纤维细胞生长因子、肝细胞生长因子、制瘤素、地塞米松、胰岛素等，发现这些细胞能表达甲胎蛋白、甲状腺转运蛋白、α抗胰蛋白酶、白蛋白等肝细胞特征性标志，形态上与受体肝细胞无法区分。
本实验将同源的SD大鼠原始生殖细胞输注入急性肝损伤的SD大鼠体内，7 d后观察受体SD大鼠肝细胞核抗原增殖情况。通过与培养基对照组比较发现，单纯鼠胚原始生殖细胞组增殖细胞核抗原半定量阳性率明显升高。通过输注原始生殖细胞前与输注7 d后SD大鼠血清丙氨酸转氨酶、天冬氨酸转氨酶、总胆红素比较发现，单纯鼠胚原始生殖细胞组3种指标含量均明显低于培养基对照组。病理切片糖原染色发现，单纯鼠胚原始生殖细胞组输注7 d后大鼠肝脏糖原染色深染，培养基对照组糖原染色相对浅淡。上述结果提示输注原始生殖细胞有利于急性肝损伤SD大鼠的恢复，能改善大鼠肝脏功能，原因可能是输注的原始生殖细胞能激发受体肝细胞的增殖和功能，加强受损肝细胞的功能修复[19]，以及原始生殖细胞能分化为肝细胞或肝细胞样细胞，对肝脏功能起一定的代偿作用。
病理切片苏木精-伊红染色发现，单纯鼠胚原始生殖细胞组输注后7 d肝脏病理改变严重程度相对培养基对照组明显减轻，肝索、肝窦排列亦相对规则，且再生肝细胞明显增多，其原因可能与输注的原始生殖细胞分化有关，在体内肝脏的微环境中原始生殖细胞不仅能分化为肝细胞或肝细胞样细胞，还有可能分化为胆管上皮细胞[20]、血窦内皮细胞、枯否氏细胞等，这些细胞均有利于受损肝脏结构和功能的修复。
本实验发现单纯鼠胚原始生殖细胞组与输注鼠胚原始生殖细胞后早期使用免疫抑制剂治疗组（鼠胚原始生殖细胞+环磷酰胺组）在处理前后肝功能恢复情况、增殖细胞核抗原半定量阳性率比较、糖原染色阳性情况、显微镜下肝脏病理表现等各方面均基本相似，说明鼠胚原始生殖细胞免疫原性非常低，移植早期不易导致移植物抗宿主病，也无明显不良反应，安全性好。
本实验中将人胚原始生殖细胞经鼠尾静脉移植于急性肝损伤的SD大鼠体内，分别于移植后14，21 d时取出肝脏，进行免疫组织化学染色，所有受体大鼠肝小叶内均成功检测到人白蛋白、甲胎蛋白表达，培养基对照组检测结果阴性。表明输注的人胚原始生殖细胞能通过血液循环迁移至肝脏，并且可以整合入受体肝脏，在受体肝脏中存活，并在肝脏特定微环境中分化为具有合成白蛋白功能的肝细胞样细胞。本实验中早期使用免疫抑制剂环磷酰胺并不能使大鼠表达人白蛋白或甲胎蛋白细胞增多，受植鼠亦未出现明显的宿主抗移植物反应，表明人胚原始生殖细胞的免疫原性非常低，移植早期能在异种动物体内存在并分化，但能否长期存在尚需进一步研究。
原始生殖细胞在特定条件下无限增殖和多向分化的潜能，以及其在肝脏微环境中能分化为具有合成白蛋白、甲胎蛋白功能的肝细胞样细胞，将为肝组织工程、肝细胞移植以及生物人工肝等肝病治疗带来一线曙光。但目前无论在可靠的移植细胞数量、稳定的诱导分化平台，还是明确的细胞分化调控机制、免疫排斥反应、致瘤性等方面尚未完全清楚，这些都有待进一步分析。

4 参考文献

1 Shamblott MJ，Axelman J，Littlefield J，et al. Human embryonic germ cell derivatives express a broad range of developmentally distinct markers and proliferate extensively in vitro. PNAS 2001;98(1)：113-118
2 Toyooka Y, Tsunekawa N, Akasu R,et al. Embryonic stem cells can form germ cells in vitro. Proc Natl Acad Sci U S A 2003;100(20):11457-11462
3 Shamblott MJ，Axelman J，Wang S，et al. Derivation of pluripotent Stem cells from cultured human primordial germ cells. Proc Natl Acad Sci USA 1998；95(23)：13726-13731
4 Kerr DA，Llado J，Shamblott MJ，et al. Human embryonic germ cell derivatives facilitate motor recovery of rats with diffuse motor neuron injury. J Neurosci 2003；23(12)：5131-5140
5 Kumasshiro Y，Asahina K，Ozeki R，et al. Enrichment of hepatocytes differentiated from mouse embryonic stem cells as a transplantable source. Transplantation 2005；79(5)：550-557
6 Ogawa S, Tagawa Y, Kamiyoshi A, et al. Crucial roles of mesodermal cell lineages in a murine embryonic stem cell-derived in vitro liver organogenesis system. Stem Cells 2005; 23(7):903-913
7 Saito K, Yoshikawa M, Ouji Y, et al. Promoted differentiation of cynomolgus monkey ES cells into hepatocyte-like cells by co-culture with mouse fetal liver-derived cells. World J Gastroenterol 2006; 12(42): 6818-6827
8 Chen B, Shi J, Zheng J, et al. Differentiation of liver cells from human primordial germ cell-derived progenitors. Differentiation 2007; 75(5) :350-359
9 Soto-Gutiérrez A, Navarro-Alvarez N, Zhao D, et al. Differentiation of mouse embryonic stem cells to hepatocyte-like cells by co-culture with human liver nonparenchymal cell lines. Nat Protoc 2007;2(2):347-356
10 Imamura T, Cui L, Teng R, et al. Embryonic stem cell-derived embryoid bodies in three-dimensional culture system form hepatocyte-like cells in vitro and in vivo. Tissue Eng 2004;10(11-12):1716-1724
11 Moriya K, Yoshikawa M, Saito K, et al. Embryonic stem cells develop into hepatocytes after intrasplenic transplantation in CCl4-treated mice. World J Gastroenterol 2007;13(6):866-873
12 Ek M, Soderdahl T, Küppers-Munther B, et al. Expression of drug metabolizing enzymes in hepatocyte-like cells derived from human embryonic stem cells. Biochem Pharmacol 2007;74(3):496-503
13 Okamura K, Asahina K, Fujimori H, et al. Generation of hybrid hepatocytes by cell fusion from monkey embryoid body cells in the injured mouse liver. Histochem Cell Biol 2006;125(3):247-257
14 Heo J, Factor VM, Uren T, et al. Hepatic precursors derived from murine embryonic stem cells contribute to regeneration of injured liver. Hepatology 2006;44(6):1478-1486
15 Zhou QJ, Huang YD, Xiang LX, et al. In vitro differentiation of embryonic stem cells into hepatocytes induced by fibroblast growth factors and bone morphological protein-4. Int J Biochem Cell Biol 2007; 39(9):1714-1721
16 Allen KJ, Buck NE, Williamson R. Stem cells for the treatment of liver disease. Transpl Immunol 2005;15(2):99-112
17 Teramoto K, Hara Y, Kumashiro Y, et al. Teratoma formation and hepatocyte differentiation in mouse liver transplanted with mouse embryonic stem cell-derived embryoid bodies. Transplant Proc 2005; 37(1):285-286
18 Hamazaki T，Iiboshi Y，Oka M，et al. Hepatic maturation in differentiating embryonic stem cells in vitro. FEBS Lett 2001；497(1)：15-19
19 Evangelia Y，Evangelia A，Angeliki X，et al. G-CSF-primed hematopoitic stem cells or G-CSF per se accelerate recovery and improve survival after liver injury, predominantly by promoting endogenous repair programs. Experimental Hepatology 2005；33(1)：108-119
20 Hu AB, He XS, Cai JY, et al. Zhonghua Yixue Zazhi 2005；85(36)：2550-2553
胡安斌, 何晓顺, 蔡继业, 等.胚胎干细胞向胆管上皮细胞定向分化的体外实验研究[J].中华医学杂志，2005，85(36)：2550-2553