课题背景：课题为2006年泸州医学院青年自然科学基金项目，由于骨髓基质细胞取材方便，对机体无害，取自自体，避免免疫排斥反应，因此课题采用骨髓基质细胞体外诱导神经干细胞，为在体修复神经系统损伤奠定实验基础。目前课题项目已完成骨髓基质细胞体外诱导分化为神经干细胞，并将诱导的细胞移植入实验性变态反应性脑脊髓炎大鼠模型。

应用要点：①对于神经系统疾病的神经干细胞移植治疗，需要大量纯化的细胞。课题将骨髓基质细胞在类似诱导神经干细胞的条件下体外诱导分化，以期获得满足条件的神经干细胞，为神经系统疾病的治疗提供种子细胞。②实验所用诱导方法简单易行，在体外即可诱导获得大量纯化神经干细胞供细胞移植。③体外诱导的神经干细胞又可在适宜诱导条件下向某一类神经细胞或胶质细胞的分化。

偏倚与不足：实验仅就体外诱导大鼠骨髓基质细胞向神经干细胞方向分化进行了探讨，还需进一步分析诱导分化所得神经干细胞体内移植治疗某一具体神经系统疾病后，细胞在宿主体内的存活、迁移及分化情况，以及如何促进受损组织重塑和神经功能恢复，从而为多种神经系统疾病的神经干细胞移植治疗提供基础研究资料。

泸州医学院，1神经生物学研究室及解剖学教研室，2教务处，四川省泸州市 646000

高小青，女，1974年生，四川省高县人，汉族，1996年泸州医学院毕业，讲师，主要从事脑缺血性损伤方面的研究。
lygaoxq@163.com

摘要
目的: 已证实骨髓基质细胞可分化为中胚层组织细胞，实验予进一步探讨体外分离培养的骨髓基质细胞向神经干细胞分化的可能性，以及是否能继续定向分化为神经细胞及神经胶质细胞，为神经系统疾病细胞移植治疗提供种子细胞。
方法：实验于2007-02/09在泸州医学院神经生物学研究室进行。①动物：选择5只普通级SD大鼠，由泸州医学院实验动物中心提供，实验过程中对动物的处置符合动物伦理学标准。②实验方法：大鼠戊巴比妥钠腹腔麻醉，取双侧胫骨和股骨，磷酸盐缓冲液冲洗骨髓腔，采用密度梯度离心法从大鼠骨髓中分离培养骨髓基质细胞，胰蛋白酶与EDTA联合消化，传至第4代，用含20 μg/L碱性成纤维细胞生长因子、20 μg/L表皮生长因子、N2辅助因子的DMEM/F12培养液向神经干细胞诱导分化。③实验评估：观察原代、传代培养及诱导分化后的骨髓基质细胞生长情况和形态变化，采用SABC法进行免疫细胞化学检测神经细胞特异性标志的表达。
结果：①骨髓基质细胞形态观察：原代细胞接种1 d后开始贴壁增殖，3 d后多数贴壁，贴壁细胞呈梭形或扁平形；10 d后90%细胞融合，以长梭形为主，突起粗大，形成网状、片状；传代后细胞贴壁速度加快，增殖能力更强，7 d左右达到融合。②诱导分化后细胞生长情况和形态变化：第4代骨髓基质细胞向神经干细胞诱导分化7 d，成球的细胞脱离瓶底，悬浮在细胞液中。将细胞离心弃上清，换成血清分化液后，细胞球逐渐贴壁，球周围很快发出突起，分化为星形胶质细胞样细胞、神经元样细胞及少突胶质细胞样细胞。③神经细胞特异性标志的表达：骨髓源性细胞球表达巢蛋白，呈棕黄色，为神经干细胞；从细胞球分化的细胞抗胶质纤维酸性蛋白、微管相关蛋白2及半乳糖脑苷脂均呈阳性。
结论：骨髓基质细胞能在体外诱导分化出神经干细胞，且骨髓源性神经干细胞可进一步定向分化为神经细胞及神经胶质细胞。
关键词：骨髓基质细胞；神经干细胞；分化

高小青，杜杰，杨朝鲜，吴岩，邓莉，袁琼兰.大鼠骨髓基质细胞体外培养向神经干细胞的诱导分化[J].中国组织工程研究与临床康复，2008，12(12):2305-2308 [www.zglckf.com/zglckf/ejournal/upfiles/08-12/12k-2305(ps).pdf]

中图分类号: R394.2
文献标识码: B
文章编号: 1673-8225
(2008)12-02305-04

收稿日期: 2007-10-10
修回日期：2007-12-28
(07-50-10-5455/ZS·Q)

Differentiation of rat bone marrow stromal cells into neural stem cells in vitro

Abstract

AIM:It has been confirmed that bone marrow stromal cells (BMSCs) can differentiate into mesoblastemic tissue cells. This experiment further investigated the possibility of differentiation of BMSCs in rats into neural stem cells in vitro, and into neural cells and neuroepithelial cells, so as to provide seed cells for cell transplantation of nervous system disease.
METHODS: Experiments were performed at the Department of Neurobiology, Luzhou Medical College from February to September 2007.①Five common SD rats were selected from the Experimental Animal Center of Luzhou Medical College. To handle animals in experiment was accorded with ethical standards. ②The rats were anesthetized with napental. Bone marrow was obtained from the femoral and tibial bones by washing with phosphate buffered solution. BMSCs from rats were isolated by combining density gradient centrifugation, digested with trypsin and EDTA. The fourth passage of BMSCs were induced by DMEM/F12 medium containing 20 μg/L epidermal growth factor (EGF), 20 μg/L basic fibroblast growth factor (bFGF) and N2 factor. ③The growth and the morphological changes of primary, passaged cells and induced BMSCs were observed. Specific markers of neural cells were identified by SABC immunocytochemisty staining.
RESULTS: ①Morphological observation of BMSCs: Firstly inoculated cells began to adhere and proliferate in 1 day. Three days later, most of them attached to the bottom and showed fusiform or flat shape. 90 % cells were confluence on the 10th day. Most cells showed like fusiform with thick and long apophyses that connected each other into network. Generated BMSCs rapidly adhered to wall, and proliferated speed of subculture cells was faster than that of primary culture cells. On the 7th day, subculture cells confluence. ②The growth and the morphological changes of induced BMSCs: The 4th passage BMSCs were induced to neural stem cells. About 7 days, cell clusters attached previously broke away the bottom, floated and became dissociative spheres. Cells were centrifugalized and supernatant was removed. These spheres gradually attached to the wall and became differentiated when they were placed in serum medium, radially protruding processes from the spheres, then they were differentiated into astrocyte-like, neuron-like oligodendrocyte-like cells. ③Expression of specific markers of neural cells: Bone marrow-derived spheres expressed nestin, and differentiated cells from spheres expressed glial fibrillary acidic protein (GFAP), microtubule-associated protein（MAP2）and galactocerebroside (Galc).
CONCLUSION: BMSCs can be induced into neural stem cells and further neural stem cells derived from bone marrow can differentiate into neural cells and neuroglial cells.

Gao XQ, Du J, Yang CX, Wu Y, Deng L, Yuan QL.Differentiation of rat bone marrow stromal cells into neural stem cells in vitro.Zhongguo Zuzhi Gongcheng Yanjiu yu Linchuang Kangfu 2008;12(12):2305-2308(China)
[www.zglckf.com/zglckf/ejournal/upfiles/08-12/12k-2305(ps).pdf]

0 引言

骨髓基质细胞是具有高度自我复制和多种分化潜能的一类干细胞，在不同的诱导条件下不仅可分化为中胚层组织的细胞，如成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞及肌细胞等[1-2]，还可跨胚层分化为外胚层组织的神经细胞和神经胶质细胞[3-4]。本试验将骨髓基质细胞在类似诱导胚胎干细胞和神经干细胞的条件下体外诱导分化出神经干细胞，从而再定向分化为神经细胞及神经胶质细胞，为某些神经系统疾病细胞移植治疗提供种子细胞[5]。

1 材料和方法

设计：细胞观察实验。
单位：泸州医学院神经生物学研究室及解剖学教研室。
材料：实验于2007-02/09在泸州医学院神经生物学研究室进行。①动物：选择5只普通级SD大鼠（由泸州医学院实验动物中心提供，动物质量合格证号：17），雌雄不拘，体质量约100g，实验过程中对动物的处置符合动物伦理学标准。②主要试剂和仪器：低糖DMEM，DMEM/F12培养基（Gibco公司）；胎牛血清（Hyclone公司）；表皮生长因子，碱性成纤维细胞生长因子，N2辅助因子（Sigma公司）；巢蛋白多抗，微管相关蛋白2单抗，胶质纤维酸性蛋白多抗（博士德生物公司）；半乳糖脑苷脂多抗（Chemicon公司）。③主要仪器：倒置相差显微镜（日本OLYMPUS）。
设计、实施、评估者：设计为第一、二作者，实施为全部作者，评估为第四、五作者，均经过系统培训，采用非盲法评估。
方法：
骨髓基质细胞的分离：1%戊巴比妥钠3 mL/kg腹腔注射麻醉大鼠，于体积分数为0.75的乙醇中浸泡3 min，置超净工作台。切皮并沿皮肌层钝性分离，暴露双侧胫骨和股骨，剪下并去除肌组织，置于磷酸盐缓冲液浸泡。将股骨及胫骨两端沿骨骺线剪去，用5 mL无菌注射器抽取磷酸盐缓冲液冲洗骨髓腔2次，离心管收集，以 1 500 r/min离心5 min，弃上清，留取红色沉淀。所获沉淀用DMEM培养液吹打形成细胞悬液，按1∶1比例加入细胞分离液中行密度梯度离心30 min，吸取乳白色膜状细胞层，骨髓基质细胞在该液层中，取双蒸水吹打破坏红细胞，加入DMEM终止红细胞溶解，离心去上清，沉淀物含有骨髓基质细胞，加入DMEM培养液悬浮细胞。
骨髓基质细胞的原代培养及传代：将骨髓基质细胞悬液移入50 mL培养瓶，于37 ℃、体积分数为0.05的CO2培养箱孵育培养3 d，细胞贴壁生长。至细胞长满瓶底，用0.25%胰蛋白酶与0.02%EDTA混合室温消化细胞约 1 min，镜下观察贴壁细胞突起收缩，细胞变圆成簇，开始漂浮，倾去消化液，加入含血清的DMEM培养液终止消化，吸管吹打混匀成单细胞悬液，分装入2个50 mL培养瓶继续培养，每3 d换液1次，每1周传代1次。
骨髓基质细胞的诱导分化：骨髓基质细胞传代4次后，将含胎牛血清的DMEM培养液换成无血清的神经干细胞培养液，即DMEM/F12培养液（含20 μg/L碱性成纤维细胞生长因子、20 μg/L表皮生长因子、N2辅助因子），孵箱内继续培养，倒置显微镜下追踪观察细胞形态变化。当细胞成球漂浮，离心弃上清，加入含10%血清的DMEM/F12培养液，同时撤除碱性成纤维细胞生长因子、表皮生长因子和N2辅助因子。将细胞球种植在内含多聚赖氨酸包被玻片的6孔板。
细胞免疫组化染色：采用SABC法进行免疫细胞化学检测。一抗分别为兔抗巢蛋白、小鼠抗微管相关蛋白2、兔抗胶质纤维酸性蛋白、兔抗半乳糖脑苷脂，二抗为生物素化羊抗兔IgG和羊抗鼠IgG，链酶亲和素-生物素-过氧化酶复合物，细胞经4%多聚甲醛固定， 0.01 mol/L磷酸盐缓冲液冲洗3次。一抗4 ℃孵育过夜，二抗37 ℃孵育1 h，链酶亲和素-生物素-过氧化酶复合物37 ℃孵育1 h，DAB显色剂染色。呈棕黄色的细胞为阳性。设对照组，用磷酸盐缓冲液代替一抗。OLYMPUS光学显微镜拍照。
主要观察指标：①骨髓基质细胞形态观察。②诱导分化后细胞生长情况和形态变化。③诱导分化后神经细胞特异性标志的表达。

2 结果

2.1 骨髓基质细胞形态观察 原代细胞接种1 d后开始贴壁增殖，3 d后多数贴壁，贴壁细胞呈梭形或扁平形，换液去除漂浮细胞。10 d后90%细胞融合，以长梭形为主，突起粗大，形成网状、片状，用胰酶和EDTA消化传代后细胞贴壁速度加快，增殖能力更强，7 d左右达到融合（图1）。

2.2 诱导分化后细胞生长情况和形态变化 传至4代的骨髓基质细胞加入神经干细胞培养液后，第2天即可见少量细胞的胞体变圆变大，突起缩短。随培养时间的延长，圆形细胞增多，折光性增强，聚集成簇、成球（图2）。至7 d左右，成球的细胞脱离瓶底，悬浮在细胞液中，呈圆形，细胞表面有睫状小突起（图3）。将细胞离心弃上清，换成血清分化液后，细胞球逐渐贴壁，球周围很快发出突起。随后细胞从细胞球中移出，分化，突起增多增长，交织成网。可见具有多角形胞体和多个粗长突起的星形胶质细胞样细胞，具有胞体呈圆形或椭圆形和一或两个长突起的神经元样细胞及具有多个细突起且不断分枝的少突胶质细胞样细胞。
2.3 诱导分化后神经细胞特异性标志的表达 骨髓源性细胞球表达巢蛋白，细胞呈棕黄色，为神经干细胞（图4a）；星形胶质细胞样细胞抗胶质纤维酸性蛋白阳性，为星形胶质细胞（图4b）；神经元样细胞抗微管相关蛋白2阳性，为神经元细胞（图4c）；少突胶质细胞样细胞抗半乳糖脑苷脂阳性，为少突胶质细胞（图4d）。对照组以上神经细胞特异性标志均呈阴性表达。

3 讨论

细胞替代治疗为神经系统疾病的治疗提供了新的治疗途径，理想的细胞材料应具备以下三种主要特性：①体外具有较高的自我增殖能力，较少的供体细胞即能扩增产生大量细胞。②体内能很好的控制这种增殖活动。③具有允许分化为神经元和神经胶质细胞的表型可塑性[6]。这种移植入患者体内治疗神经障碍的细胞过去都是来自于胚胎或胎儿的中枢神经系统[7-8],但存在可用的细胞数量有限、移植的患者需要免疫抑制、供体材料不易获得、伦理道德等问题。
骨髓基质细胞作为一类非胚胎或胎儿源性的干细胞，具有间充质-神经组织转化的可塑性[9-10]，这种可塑性与Oct-4转录因子有关[11-12]，Oct-4属于转录因子POU家族，在胚胎干细胞中特异性表达，是胚胎干细胞自我更新和多潜能分化的重要因子。另外，Oct-4通过调控成纤维细胞生长因子FGF4的表达，对胚胎细胞的增殖也有促进作用。最近发现体外无血清培养的人骨髓基质细胞也高表达Oct-4[13]，但当其转化为骨髓源性的神经干细胞后，Oct-4的表达减少[14]。因此认为人骨髓基质细胞是一类与胚胎干细胞相似的成体干细胞，停止在间充质干细胞阶段，当受到外界刺激时便进入特异性分化程序。
Wislet-Gendebien[15]报道了将骨髓基质细胞与小脑颗粒细胞共培养，成熟的骨髓基质细胞能表达神经元抗原。但需要两个条件，一是骨髓基质细胞表达巢蛋白，其次是神经元与骨髓基质细胞间的相互作用，这种直接的作用允许外在信号的整合。同时他们也表明神经元表型是来自骨髓基质细胞的分化而不是细胞融合过程。这些神经元表型的细胞不仅表达神经元抗原N-乙酰神经氨酸和微管相关蛋白等，而且具备相应功能，如提高细胞溶质钙浓度以适应各种神经元特异性兴奋[16]。也表达酪氨酸羟化酶，分泌和合成多巴胺，为具有功能性的多巴胺能神经元[17-18]。
本实验利用密度梯度离心法从成年大鼠骨髓里分离纯化出骨髓基质细胞，经神经干细胞营养因子诱导，即发现细胞突起回缩，胞体变圆，随后细胞成簇成团，脱离瓶底悬浮成细胞球，经免疫组化鉴定表达巢蛋白。进一步将巢蛋白阳性细胞球分化并用神经元标志微管相关蛋白2、星形胶质细胞标志胶质纤维酸性蛋白、少突胶质细胞标志半乳糖脑苷脂行免疫组化检测，发现三者均呈阳性，说明骨髓基质细胞能向神经干细胞方向分化，并且这种骨髓来源的神经干细胞具有向成熟神经分化的潜能。在实验中还发现，除了上述向神经干细胞方向分化外，在诱导2 d后瓶底贴壁有神经细胞样细胞，可能是骨髓基质细胞直接向神经元的分化。
由于骨髓基质细胞取材方便，对机体无害，取自自体，避免了免疫排斥反应。用本实验方法体外获取的骨髓源性神经干细胞，有望作为种子细胞用于细胞移植，在神经损伤修复和退行性疾病的治疗中存在着巨大的应用潜能[19-20]。

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