基因修饰骨髓间充质干细胞复合珊瑚羟基磷灰石支架材料修复骨质疏松性下颌骨缺损**☆

唐尤超1，王远勤1，汤炜2

课题背景：课题为广东省自然科学基金资助项目(06301417)；广东省卫生厅资助项目(A2006726)。本实验拟通过基因工程与组织工程的有机结合来获得新生骨组织。实验结果表明转染人骨形态发生蛋白2较未转染在体内形成新骨能力明显增强，人骨形态发生蛋白2基因修饰的自体细胞复合支架材料，改善成骨环境促进骨愈合，加速了组织工程化骨的形成。

同行评价：联合应用基因工程和组织工程技术研制具有较强生物诱导活性的组织工程骨是近5年来引人注目的研究方向。文章采用转染人骨形态发生蛋白2基因的组织工程化骨修复骨质疏松症下颌骨缺损，具有一定创新性，对相关领域研究具有一定指导意义和参考价值。

偏倚或不足：实验中虽然人骨形态发生蛋白2基因修饰的组织工程化骨植入绝经后骨质疏松症大鼠下颌骨骨缺损区，增强了其骨再生能力，但8周时的结果显示仍未达到完全的骨性愈合。究竟是在体内相关细胞外环境的改变，还是脂质体介导的基因转移效率不高所致，尚待深入观察。

1惠州市口腔医院颌面外科，广东省惠州市 516001；2四川大学华西口腔医学院颌面外科，四川省成都市 610041

唐尤超☆，男，1971年生，江西省九江市人，汉族，2005年四川大学毕业，博士，副主任医师，主要从事颌面部整型及创伤修复重建的研究。
yctang0808.360@163.com

广东省自然科学基金资助项目(06301417)*；广东省卫生厅资助项目(A2006726)*

背景：近年来基因修饰干细胞与支架材料复合形成组织工程化骨为修复骨缺损提供了骨组织重建的全新思路。
目的：实验拟观察转染人骨形态发生蛋白2基因转染骨髓间充质干细胞复合珊瑚羟基磷灰石支架材料修复骨质疏松症下颌骨缺损的效果。
设计、时间及地点：随机对照动物实验，于2005-06/2006-10在教育部口腔生物医学工程重点实验室完成。
材料：6月龄未孕雌性SD大鼠24只，SPF级，体质量250~300 g，构建绝经后骨质疏松症动物模型。含人骨形态发生蛋白2基因的pcDNA3.1-hBMP-2重组质粒由解放军第三军医大学提供；支架材料珊瑚羟基磷灰石由卫生部口腔生物医学工程重点实验室提供。
方法：24只SD模型大鼠随机数字表法分为实验组和对照组，每组12只。3个月后分别取其骨髓间充质干细胞培养。实验组骨髓间充质干细胞通过脂质体Lipogen介导转染pcDNA3.1-hBMP-2质粒，对照组细胞未作处理。3 d 后将每只大鼠骨髓间充质干细胞与珊瑚羟基磷灰石支架材料复合，再分别对应地植入取材动物的自体下颌骨极限性骨缺损区。
主要观察指标：术后第4，8周组织切片行免疫组织化学染色，观察新骨形成情况。术后8周进行成骨量的半定量检测。
结果：24只SD模型大鼠均进入结果分析。①术后4周实验组在珊瑚羟基磷灰石材料边缘有新生骨质形成，8周时见相互连接的层板状成熟骨基质形成，对照组4周时只在材料边缘有少量骨基质形成，8周时新生骨质数量上明显少于实验组，且材料边缘及中央处有脂肪样结构形成。②对照组术后8周新生骨所占面积百分比为（0.046±0.004）%，实验组为（0.233± 0.015）%，各组成骨量差异具有显著性意义（P < 0.01）。
结论：人骨形态发生蛋白2基因修饰的骨髓间充质干细胞复合珊瑚羟基磷灰石支架形成的组织工程化骨修复骨质疏松症下颌骨的成骨量较无基因修饰明显增加。
关键词：骨形态发生蛋白2；骨质疏松症；细胞分化；基因治疗

唐尤超，王远勤，汤炜.基因修饰骨髓间充质干细胞复合珊瑚羟基磷灰石支架材料修复骨质疏松性下颌骨缺损[J].中国组织工程研究与临床康复，2008，12(14):2601-2605 [www.zglckf.com/zglckf/ejournal/upfiles/08-14/14k-2601(ps).pdf]

Repairing mandibular defect by gene-modified bone marrow mesenchymal stem cells combined with coral hydroxyapatite scaffold in osteoporotic rats

BACKGROUND: In recent years, tissue engineered bone by gene-modified stem cells compounded with scaffold materials in repair of bone defect has provided a novel thought for the bone tissue reconstruction.
OBJECTIVE: To explore the effect on repairing mandibular defect with human bone morphogenetic protein-2 (hBMP-2) gene transfected bone marrow mesenchymal stem cells (BMSCs) compounded with coral hydroxyapatite (CHA) scaffolds in osteoporotic rats.
DESIGN, TIME AND SETTING: A randomized control animal experiment was completed at the Key Laboratory for Oral Biomedical Engineering by the State Ministry of Education from June 2005 to October 2006.
MATERIALS: Twenty-four unpregnant female Sprague-Dawley rats, 6 months old, SPF gradem weighing 250-300 g, were used to establish models of postmenopausal osteoporosis. The pcDNA3.1-hBMP-2 recombinant plasmid carrying hBMP-2 was offered by the Third Military Medical University of Chinese PLA; CHA scaffolds was offered by the Key Laboratory for Oral Biomedical Engineering by the State Ministry of Education.
METHODS: Twenty-four SD rats were divided into experimental group and control group at random, each containing 12 animals. Three months later, BMSCs harvested from osteoporotic rats were transfected by pcDNA3.1-hBMP-2 recombinant plasmid, and control group leaved untreated. Three days later, the transfected and untransfected autogenous BMSCs were seeded into CHA scaffolds, respectively. Then the cell/scaffolds composites were implanted into the critical-size defect area in the mandible bone of osteoporotic rats.
MAIN OUTCOME MEASURES: At the 4th and 8th weeks after implantation, immunohistochemical analysis was performed to evaluate the new bone formation, and the amount of newly formed bone was detected semi-quantitatively at the 8th weeks.
RESULTS: All 24 SD rats were involved in the result analysis.①Newly formed bone was found at the margin of the defect area treated with the BMSCs modified by BMP-2 gene transfer at 4 weeks after implantation. The lamellar bone matrix was visible at 8 weeks. In the control group, only a little bone matrix was observed at the margin of CHA material at 4 weeks after implantation, however, the amount of newly formed bone was much less than the experimental group, and there was some adipose-like tissues at defect margins and central part at 8 weeks after implantation.②The percentage of newly formed bone area was (0.046±0.004)% and (0.233±0.015)% in the control group and the experimental group, respectively. There were significant differences in the amount of newly formed bone between two groups (P < 0.01).
CONCLUSION: Tissue engineered bone formed by hBMP-2 gene-modified BMSCs in conjunction with CHA scaffolds, can allow large bone formation for treatment of mandibular defect in osteoporosis rats.

Tang YC, Wang YQ, Tang W.Repairing mandibular defect by gene-modified bone marrow mesenchymal stem cells combined with coral hydroxyapatite scaffold in osteoporotic rats.Zhongguo Zuzhi Gongcheng Yanjiu yu Linchuang Kangfu 2008;12(14):2601-2605
[www.zglckf.com/zglckf/ejournal/upfiles/08-14/14k-2601(ps).pdf]

骨质疏松症患者由于骨显微结构破坏，骨形态发生蛋白2（Bone morphogenetic protein，BMP-2）等生长因子表达下降，易导致骨愈合不良[1-2]。骨髓颗粒骨或带血管的自体骨移植是临床上常用的治疗骨缺损方法[3-4]，然而它最大的缺点是自体骨源有限，二次手术造成供区创伤。
近年来骨组织工程及基因治疗的发展为骨缺损的修复重建提供了全新思路[5-7]。将hBMP-2基因转染的绝经后骨质疏松症(Postmenopausal osteoporosis，PMO)大鼠骨髓间充质干细胞(Bone mesenchymal stem cell，BMSCs)与良好的支架材料复合，经过一段时间的体外扩增培养，将这种组织工程化骨植入到缺损部位以达到修复骨缺损的目的。植入的种子细胞在体内增殖的同时，持续高效的在体表达骨生长因子。同时基因转染细胞后合成的蛋白经过自身细胞翻译后修饰，能更有效地同细胞表面受体结合，调控靶细胞的生长分化[8-9]。

设计：随机对照动物实验。
时间及地点：实验于2005-06/2006-10在教育部口腔生物医学工程重点实验室完成。
材料：6月龄未孕雌性SD大鼠24只，SPF级，体质量250~300 g，由四川大学华西医学中心实验动物中心提供（许可证号：川实动管第2005年10号)。随机数字表法分为实验组和对照组，每组12只。
主要试剂及仪器：含hBMP-2基因的pcDNA3.1-hBMP-2重组质粒由解放军第三军医大学提供；支架材料珊瑚羟基磷灰石(Coral porous hydroxyapatite，CHA)由卫生部口腔生物医学工程重点实验室提供；α-MEM培养基、胎牛血清、HEPES、EDTA、胰蛋白酶（GIBCO，美国）；阳离子脂质体转染试剂LipoGen（INVITROGEN，美国）；其余均为国产分析纯试剂。SP免疫组织化学染色试剂盒、DAB显色液（北京中杉）；无内毒素型超纯质粒DNA纯化试剂盒（杭州V-GENE）；BMP-2抗体、BMP-2原位杂交检测试剂盒（武汉博士德生物工程有限公司)；Nikon TE2000-U倒置显微镜（日本）；Image-Pro Plus专业图像分析软件系统（美国）。
方法：
绝经后骨质疏松症动物模型的建立及BMSCs的培养：将大鼠以10 g/L 戊巴比妥钠按30 mg/kg 行腹腔内注射麻醉，建立绝经后骨质疏松症动物模型[10]；术后3个月分别于无菌条件下取双侧卵巢切除大鼠的右下肢，冲出骨髓腔内容物培养BMSCs，隔日换液，当细胞达80%以上融合时按2×108 L-1 的密度接种于6孔板中。
脂质体LipoGen介导的基因转染PMO动物BMSCs：6孔板中传代细胞达80%以上融合时，实验组12只PMO大鼠的BMSCs，按阳离子脂质体LipoGen说明书每孔中加入质粒DNA应改成0.25 g/L LipoGen转染BMSCs，将pcDNA3.1-hBMP-2导入BMSCs内；对照组12只PMO大鼠的BMSCs未作处理，按hBMP-2免疫组织化学及原位杂交试剂盒要求进行免疫组织化学及原位杂交观察。
支架材料的制备：将块状的CHA材料制备成直径4 mm、厚度1 mm 的圆盘状薄片，经超声清洗，高温高压消毒，使用前无血清培养基浸泡24 h 备用。
体外构建珊瑚羟基磷灰石组织工程化骨：
hBMP-2基因转染后3 d 将两组BMSCs消化后制备成浓度为5×109 L-1 的细胞悬液，分别滴加于96孔培养板中备用的CHA上，使细胞自然沉降在材料表面，1 h 后再加入适量的培养基，在37 ℃、体积分数为0.05的CO2恒温培养箱中培养48 h，构建24个组织工程化骨。另各取一孔按免疫组织化学及原位杂交试剂盒说明书染色。
下颌骨极量骨缺损模型的建立及缺损修复：10 g/L 戊巴比妥钠按30 mg/kg 剂量行腹腔注射麻醉，无菌条件下暴露两组大鼠左下颌骨颊、舌侧骨面，以球钻在下颌升支前缘去除直径4 mm 的圆形全厚下颌骨，造成下颌骨的极限性骨缺损，分别植入自体细胞组织工程化骨，见图1，术后将动物分笼饲养。

组织学观察：术后4周及8周时两组分别处死半数动物，左下颌骨标本经40 g/L 多聚甲醛溶液固定24 h， 15 g/L 的EDTA常规脱钙5周，石蜡包埋后制成5 μm 切片。切片脱蜡至水，行常规苏木精-伊红染色及改良Masson新三色染色，观察新骨形成情况。
组织形态学观察：每一个标本随机选取5个视野，通过Image-Pro Plus计算机图像分析系统在20倍物镜下观察，分别计算每一视野中新骨形成所占面积百分比，术后8周进行成骨量的半定量检测。
主要观察指标：术后第4，8周组织切片行免疫组织化学染色，观察新骨形成情况。术后8周进行成骨量的半定量检测。
设计、实施、评估者：实验设计为第一作者，干预实施为第二作者，评估为第三作者。均经过正规培训，采用盲法评估。
统计学分析：由第三作者采用SPSS 10.0软件包完成统计处理，实验数据以_x±s表示，两组间比较用t检验，P < 0.05为差异有显著性意义。

2.1 实验动物数量分析纳入SD大鼠24只，均进入结果分析，无脱落。
2.2 阳离子脂质体LipoGen介导hBMP-2基因转染BMSCs 转染后72 h 内，实验组细胞形态与对照组相比未见明显改变，但细胞代谢产物增多，细胞间可见基质堆积。透射电镜下显示实验组细胞核内染色质分布均匀，胞质中见较丰富的粗面内质网及核糖体。
2.3 hBMP-2免疫组织化学及原位杂交染色结果实验组大鼠BMSCs，免疫细胞化学染色显示在胞质中有棕黄色颗粒的阳性信号，见图2；hBMP-2原位杂交结果显示在胞质及胞核中有阳性信号，表明BMP-2在转染的PMO大鼠BMSCs中呈阳性表达，对照组为阴性表达。

2.4 免疫组织化学染色结果术后4周及8周时实验组与对照组均未见明显的炎症反应，大体标本形态无显著差别：材料边缘与下颌骨缺损交界处分界不明显，但CHA外形仍清晰可辨，见图3。

术后4，8周实验组及对照组苏木精-伊红染色及改良Masson 3色染色结果—

苏木精-伊红染色：
4周时在自体组织工程化骨边缘有新生骨质形成，呈平行层板状排列，中央处有大量的致密纤维结缔组织，其内可见类骨基质沉积，有大量胞浆丰富的成骨细胞。
4周时只在材料边缘有少量骨基质形成。

Masson 3色染色：
8周时材料仍未吸收完全，CHA边缘及中心部位的孔隙内有成熟的骨基质形成，呈相互连接的层板状，部分区域可见血管长入，形成不规则的骨髓样组织结构。
8周时亦有少量新生骨具有骨髓样结构，但数量上少于实验组，且CHA材料边缘与正常骨交界处及材料中央处有脂肪样结构形成，偶见软骨样细胞存在。

2.5 成骨量的半定量检测结果在20倍物镜下Image-Pro Plus计算机分析显示，对照组术后8周新生骨所占面积百分比为（0.046±0.004）%，实验组为（0.233±0.015）%，各组成骨量差异具有显著性意义（P < 0.01）。

骨质疏松症是影响骨重建重要的全身因素之一。女性绝经后，随着雌激素水平下降，白细胞介素1等促进骨吸收因子产生增加，破骨细胞的数量增多、活性增强[11-12]，骨重建加快，骨形成和骨吸收均加速，但骨吸收的速度超过骨形成，导致骨量的丢失。
BMP-2位于骨形成过程级联反应的上游[13-15]，调控胞核内相关基因的表达，诱导细胞的成骨向分化，且成骨过程中间充质细胞、成软骨细胞、成骨细胞等又不断合成、分泌BMP，通过正反馈机制不断促进成骨。Park等[16]的研究表明在阳离子脂质体介导hBMP-2基因瞬时转染BMSCs后，ELISA检测其培养上清液中的BMP-2蛋白量在第14天时仍可达到36 μg/L，这足以促进细胞的增殖及分化。而且阳离子脂质体介导的hBMP-2基因转染后，G418筛选稳定表达外源性基因的细胞量难以满足骨组织工程对种子细胞数量上的要求，因此本实验中使用脂质体瞬时转染后的BMSCs，经免疫细胞化学及原位杂交检测基因转染细胞已具有胞质表达及分泌表达外源性BMP-2的能力。
在本实验中，从PMO大鼠获取的BMSCs经过体外培养、扩增，并经hBMP-2基因修饰，再将其与良好的支架材料复合后植入下颌骨缺损部位，4周时有新生骨质形成，8周时材料内有成熟骨质形成，形成不规则的骨髓样组织结构。与未转染的BMSCs相比，4周及8周时的组织学及组织形态学结果均证实转染hBMP-2显著增加了在体内的骨形成量，促进骨修复作用效果明显。Turgeman等[17]研究也表明转染hBMP-2基因的骨质疏松症患者BMSCs在体外及裸鼠体内增殖能力增强，成骨活性恢复，与本实验结果相吻合。
实验中发现对照组8周时成骨量不仅较实验组减少，在骨修复区特别是在边缘处可见到脂肪样组织形成，但在体外细胞培养中未发现此种情况，且在实验组中的体内成骨中也未发现。究其原因，可能与BMSCs的多向分化潜能有关。骨髓中成骨细胞及脂肪细胞的分化调控途径是相互联系的，骨质疏松症患者髓腔中骨量减少伴随脂肪形成增加的现象已得到公认。而骨髓中的脂肪细胞和成骨细胞均是由具有多向分化潜力的BMSCs分化而来的。不仅脂肪细胞是雌激素应答细胞，而且雌激素对调控BMSCs分化为成骨细胞或脂肪细胞具有一定作用，能通过上调runx mRNA的表达促进BMSCs分化为成骨细胞，在增加细胞的碱性磷酸酶活性及矿化结节形成的同时抑制脂肪细胞的形成[18-19]。本实验中BMSCs植入PMO大鼠骨缺损部位后，细胞受体内雌激素分泌减少等因素的影响，对照组部分细胞分化为脂肪细胞是个合理现象，这也充分证实了本实验培养的BMSCs具有成体干细胞特征。而BMP在促进BMSCs向成骨细胞方向分化的同时，还可抑制其向脂肪细胞等方向的分化[20]，因此实验组的BMSCs植入PMO大鼠骨缺损部位后未见此种情况发生。
实验中虽然hBMP-2基因修饰的组织工程化骨植入PMO大鼠下颌骨骨缺损区，增强了其骨再生能力，但8周时的结果显示仍未达到完全的骨性愈合。究竟是在体内相关细胞外环境的改变，还是脂质体介导的基因转移效率不高所致，尚待深入观察。

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