纳米双相磷酸钙陶瓷组织工程支架复合大鼠自体骨髓基质干细胞修复极量颅骨缺损***☆

王涛1，田卫东2，李声伟2，廖运茂2

课题背景：课题受四川省科技厅科技攻关资助项目（03GG0092027, 03SG022200321）及国家教育部优秀青年教师教学科研奖励计划资助项目(2003682)资助。在骨组织工程研究领域，对支架材料的研究虽然报道甚多，但一直没有非常理想的选择。纳米陶瓷材料具有小尺寸效应和表面或界面效应，使其呈现出与传统陶瓷显著不同的独特性能。由于比表面积的增加，其引导组织细胞的能力和生物降解性增强。实验旨在探讨纳米双相磷酸钙陶瓷作为替代骨细胞外基质支架材料的可行性。

应用要点：实验将自体骨髓基质细胞与纳米双相磷酸钙陶瓷复合后直接进行颅骨缺损修复，植入后16周有大量新骨生成，X射线片显示陶瓷中央部已有高密度骨形成，表明骨髓基质细胞/纳米双相磷酸钙陶瓷复合物能够有效修复颅骨缺损，可作为支架材料用于组织工程骨组织的构建。

重要的概念：建立极量骨缺损的实验模型是进行骨缺损修复动物实验研究必要的前提。极量骨缺损的目的是最大限度在骨缺损修复的动物实验研究中减少因动物种系、年龄、骨缺损部位不同对骨缺损愈合的混杂因素影响。有学者认为极量骨缺损定义为在某一特定动物的生命周期内，在某一特定的骨上，不能自行愈合的最小骨缺损。另外有学者认为在动物生命周期内愈合小于所造成缺损10%的骨缺损。或者如果1年内修复未达到缺损的10%，就认为此缺损符合极量骨缺损的标准。

1海南省人民医院口腔科，海南省海口市 570003； 2四川大学口腔生物医学工程教育部重点实验室，四川省成都市 610041

王涛☆，男，1968年生，海南省海口市人，汉族，2005年四川大学华西口腔医学院毕业，博士，副主任医师，主要从事颌面部创伤及修复重建的相关研究。
wang_tao20001@yahoo.com.cn

通讯作者:田卫东，教授，博士生导师，四川大学口腔生物医学工程教育部重点实验室，四川省成都市 610041 dentisttian@
hotmail.com

四川省科技厅科技攻关资助项目(03GG0092027,03SG022200321)**；国家教育部优秀青年教师教学科研奖励计划资助项目(2003682)*

背景：传统生物陶瓷材料作为组织工程支架材料的脆性大，不易加工成形且在体内降解困难，影响新骨的长入和后期的改建，故其应用受到一定限制。
目的：观察纳米双相磷酸钙陶瓷(Biphasic calcium phosphate nanocomposite,NanoBCP)用于组织工程支架修复颅骨缺损的成骨性能。
设计、时间及地点：随机分组、动物对照实验，于2004-09/2005-05在四川大学口腔生物医学工程教育部重点实验室完成。
材料：选择2月龄雄性体健SD大鼠48只，体质量180~200 g，在颅骨上制成直径为8 mm的颅骨全层缺损区为极量骨缺损模型。实验用孔径100~400 μm，含孔率为60%~80%的NanoBCP陶瓷及SD大鼠自体骨髓基质细胞(bone marrow stromal cells,BMSCs)由四川大学口腔生物医学工程教育部重点实验室提供。
方法：按随机数字表法将模型大鼠分为3组，NanoBCP/BMSCs组16只，BMSCs经含地塞米松、抗坏血酸、β-甘油磷酸钠的诱导液培养后与NanoBCP复合植入SD大鼠颅骨缺损区；单纯NanoBCP组16只，仅在相同部位单纯植入NanoBCP支架材料；空白对照组16只不植入任何材料。
主要观察指标：植入后4，16，24周取材，通过X射线片分析、大体和组织学观察评价其成骨性能。
结果：SD大鼠48只均进入结果分析。①植入后4，16周，NanoBCP/BMSCs组新生骨组织逐渐增多，Ⅰ型胶原免疫组织化学染色阳性。植入后24周，NanoBCP/BMSCs组SD大鼠颅骨缺损完全修复，单纯NanoBCP组部分修复，空白对照组未修复。②植入后4，24周，NanoBCP/BMSCs组骨缺损区X射线阻射影像密度逐渐增加，新骨充填，接近于正常骨；单纯NanoBCP组骨缺损区亦见X射线阻射影像，与颅骨邻接区的环形透光影密度逐渐增加，骨缺损中央部密度不均匀。
结论：NanoBCP与BMSCs复合物能够有效地修复颅骨缺损。
关键词：骨髓基质细胞；纳米双相磷酸钙陶瓷；组织工程；支架

王涛，田卫东，李声伟，廖运茂.纳米双相磷酸钙陶瓷组织工程支架复合大鼠自体骨髓基质干细胞修复极量颅骨缺损[J].中国组织工程研究与临床康复，2008，12(14):2606-2610 [www.zglckf.com/zglckf/ejournal/upfiles/08-14/14k-2606(ps).pdf]

Biphasic calcium phosphate nanocomposite loaded with bone marrow stromal cells for repair of critical cranial defect in rats

BACKGROUND:Traditional bioceramics materials, as the carrier for tissue engineering, have been limited to certain application due to their unsatisfactory performances, such as great fragility, difficult shaping process and in vivo degradation, which will affect the new bone formation and later reconstruction.
OBJECTIVE: To observe the osteogenesis ability of biphasic calcium phosphate nanocomposite (NanoBCP) served as tissue engineered carrier for repairing cranial defect.
DESIGN, TIME AND SETTING: The animal controlled experiment was carried out according to random grouping in the Key Laboratory of Oral Biomedical Engineering, Ministry of Education, Sichuan University from September 2004 to May 2005.
MATERIALS: Forty-eight male SD rats, two months old and weighing 180-200 g, were prepared into critical-size defect models in the full-thickness cranial bone. The porosity of NanoBCP scaffold was 60%-80% and the pore size was 100-400 μm. Both NanoBCP and autogenous bone marrow stromal cells (BMSCs) were offered by the Key Laboratory of Oral Biomedical Engineering, Ministry of Education, Sichuan University.
METHODS: All rat models were randomly divided into three groups, and each group contained 16 animals. In NanoBCP/BMSCs group, BMSCs were cultured in inducing liquid containing dexamethasone, antiscorbic acid and β-sodium glycerophosphate, then the defects were filled with the NanoBCP/BMSCs composites; In pure NanoBCP group, the defects were filled only with NanoBCP; and blank control rats were filled with nothing.
MAIN OUTCOME MEASURES: At 4, 16 and 24 weeks after implantation, the osteogenesis activity was evaluated by radiographic analysis, gross observation and histological examination.
RESULTS: All of 48 SD rats were involved in the result analysis.①At 4 and 16 weeks postoperatively, more newly formed bone was found in NanoBCP/BMSCs group, and they were positive for type I collagen immunohistochemical staining. At 24 weeks, cranial defects were completely healed in NanoBCP/BMSCs group, and partly healed in pure NanoBCP group. Blank controls showed no detectable signal of bone defect repair.②At 4 and 24 weeks postoperatively, the density of shadow image in cranial defect areas was increased gradually in NanoBCP/BMSCs group, and newly formed bone was close to normal bone; In pure NanoBCP group, the ring low-density was presented in cranial defects and increased along the periphery of the skull, the central domain showed uneven density image.
CONCLUSION: The NanoBCP/BMSCs composites can repair cranial defects effectively.

Wang T, Tian WD, Li SW, Liao YM.Biphasic calcium phosphate nanocomposite loaded with bone marrow stromal cells for repair of critical cranial defect in rats.Zhongguo Zuzhi Gongcheng Yanjiu yu Linchuang Kangfu 2008;12(14):2606-2610
[www.zglckf.com/zglckf/ejournal/upfiles/08-14/14k-2606(ps).pdf]

由于创伤及病理原因造成的上下颌骨缺损一直是临床治疗难点，尽管临床已用自体骨和异体骨移植以及其他生物材料来修复缺损，但各自的缺点限制了它们的应用。近年来随着组织工程学和纳米材料技术的发展，利用组织工程原理与纳米材料技术来构建一种理想的生物性植骨材料即纳米材料组织工程化骨，正在成为跨学科的国际前沿的研究热点与方向。
组织工程学是利用工程学和生命科学的原理和技术，在体外预先构建一个有生命的细胞-生物材料复合体[1]，用于修复骨组织缺损。本实验应用组织工程技术，将经过诱导的大鼠骨髓基质细胞(bone marrowstromal cells,BMSCs)与新型多孔纳米双相磷酸钙陶瓷(Biphasi ccalcium phosphate nanocomposite,NanoBCP)支架材料复合培养后植入SD大鼠颅骨缺损，探索其作为组织工程化骨在行极量骨缺损修复中的可行性，为进一步的临床应用提供理论和实验依据。

设计：随机分组设计、对照动物实验。
时间及地点：实验于2004-09/2005-05在四川大学口腔生物医学工程教育部重点实验室完成。
材料：选择清洁级、2月龄雄性体健SD大鼠48只，体质量180~200 g，由四川大学华西医学中心实验动物中心提供（质量合格证：川实动管质第122号）。实验用NanoBCP陶瓷（孔径100～400 μm，含孔率为60%~80%）及SD大鼠自体BMSCs的获得和培养由四川大学口腔生物医学工程教育部重点实验室提供。
技术路线：
含孔NanoBCP陶瓷预备：将含孔NanoBCP制备为 8.0 mm×8.0 mm×1.5 mm大小，超声净化，高压灭菌。
细胞生物陶瓷复合体的构建：大鼠BMSCS经骨向诱导培养14 d后，用2.5 g/L胰酶消化、离心、计数，制成2×109 L-1的细胞悬液，与处理过的NanoBCP生物陶瓷一同置入10 mm× 50 mm带胶塞试管中，用注射器抽成负压以使细胞渗入陶瓷孔隙，室温放置一两小时后再一同置于35 mm培养皿中，加入完全培养基在 37 ℃、体积分数为0.05的CO2孵箱中培养。
SD大鼠极量颅骨缺损的修复:在腹腔注射10 g/L戊巴比妥钠（35 mg/kg）麻醉动物。在SD大鼠眼眶上方沿前额作一长约三四厘米的“U”形切口，钝性分离皮肤与骨膜，在不损伤硬脑膜的情况下，切开皮肤、皮下至骨膜表面，向后翻起“U”形瓣，充分暴露额骨和顶骨。切开、掀起颅骨表面骨膜并予以切除，用电钻、骨凿在颅骨上制成直径为8 mm的颅骨全层缺损区，注意保护好硬脑膜。生理盐水冲洗后按分组植入移植物。48只大鼠按随机数字表法分为3组。NanoBCP/BMSCs组16只，植入BMSCs复合NanoBCP支架材料，缝合皮肤。术后保持伤口区清洁，每只动物每天肌注庆大霉素8万单位，连续3 d。单纯NanoBCP组16只，仅在相同部位单纯植入NanoBCP支架材料。空白对照组16只，不植入任何材料。
主要观察指标：植入后4，16，24周，行大体观察并摄X射线片，取材，标本大体观察后。以体积分数为0.7的乙醇固定，经顺序脱水后，以甲苯透明，经甲基丙烯酸甲酯浸泡后包埋，行硬组织切片。Lieca硬组织切片机以50 μm厚度连续切片，苏木精-伊红染色、Ⅰ型胶原免疫组织化学染色及Masson氏三色法染色，光镜及X射线影像下观察新骨形成情况。GENDEX X射线机（DEN S-O-MAT, Milano, Italy）上投照颅骨片，X射线管距标本距离为10 cm，投照条件为70 kV，7 mA， 0.06 s，底片为Kodak牙片。免疫组织化学采用SA2010型SABC试剂盒(武汉博士德生物工程有限公司) ,按SABC法进行染色。Ⅰ型胶原多克隆抗体(武汉博士德生物工程有限公司)以1∶100稀释。操作过程严格按照试剂盒说明进行。最后用DAB呈色,苏木精衬染,常规封固观察。阳性产物为棕黄色片状或颗粒状染色。
设计、实施、评估者：设计为第一作者，实施为全部作者，评估为第一、三作者，评估者经过正规培训。

2.1 取材标本组织学及大体观察实验大鼠48只均成活，无感染及其他并发症发生。

不同时间点用不同染色方法观察颅骨组织学和大体形态变化—
NanoBCP/BMSCs组：
植入后4周，材料表面及孔隙内见新生骨组织，见图1。部分新骨围绕材料边缘形成，距材料较远处的孔隙内可见纤维组织，在新生骨组织区域可见血管形成，见图2。材料密度均匀降低，呈虫蚀状，见图3。植入后16周，可见更多的新骨形成，见图4。部分区域融合成片，可见骨髓腔和骨髓形成，见图5。Ⅰ型胶原免疫组织化学染色阳性，见图6；证实新骨生成，SD大鼠颅骨缺损基本修复。植入后24周，颅骨缺损完全修复，缺损均为骨性愈合，见图7a。

单纯NanoBCP组：
植入后24周，颅骨缺损部分修复，缺损中央部呈纤维愈合，见图7b。

不同时间点X射线观察颅骨影像学变化
NanoBCP/BMSCs组：
植入后4周，骨缺损区有圆形X射线阻射影像，材料密度均匀降低，见图8a，呈虫蚀状，与颅骨邻接区有环形透光影。
植入后24周，骨缺损区阻射影像密度明显增加，表现为高密度的新骨充填，陶瓷中央部已有高密度骨形成，接近于正常骨，见图8c。

单纯NanoBCP组：
植入后4周，骨缺损区亦见X射线阻射影像，密度降低不均匀，见图8b，阻射密度低于周围骨质，邻接区也有环形透光影。
植入后24周，与颅骨邻接区的环形透光影密度明显增加，但骨缺损中央部密度不均匀，见图8d。

在骨缺损修复的动物实验研究中，建立极量骨缺损的实验模型是必要的前提。Schmitz等[2]将极量骨缺损定义为：在某一特定动物的生命周期内，在某一特定的骨上，不能自行愈合的最小骨缺损。而Hollinger等[3]认为在动物生命周期内愈合小于所造成缺损10%的骨缺损。或者如果1年内修复未达到缺损的10%，就认为此缺损符合极量骨缺损的标准。极量骨缺损的目的是最大限度在骨缺损修复的动物实验研究中减少因动物种系、年龄、骨缺损部位不同对骨缺损愈合的混杂因素影响。
颅骨与颌面区骨很类似，在胚胎学上均通过膜内成骨的方式成骨；在解剖学上颅骨为两层皮质骨间隔松质骨，与下颌骨类似；在生理上颅骨的皮质骨类似于萎缩的下颌骨。因此，颅骨是考察植骨材料骨修复能力的常用部位。有研究表明300~350 g的SD大鼠顶骨直径5 mm的缺损，术后135 d缺损处为纤维组织愈合[4]。Sweeney等[5]则认为大鼠的颅骨直径8 mm的缺损为极限骨缺损，综合以上，本实验将SD大鼠颅骨制备成直径8 mm的缺损作为实验模型。
理想的骨组织工程种子细胞应具备以下特点：取材容易，损伤小；既能定向分化为成骨细胞，传代繁殖力强，而且传代后仍能保持成骨能力；适应性强，植入体内后能保持成骨活性。BMSCs获取简便，体外培养条件不高，细胞分裂增殖快，通过原代和传代培养,其数量可呈指数扩增[6-7]，矿化液诱导后可表达成骨细胞表型。同时由于BMSCs属于未分化的前体干细胞，其细胞表型的分化尚不成熟，因此即使是同种异体，BMSCs移植的排斥反应也较弱，因此BMSCs被认为是良好的骨组织工程的种子细胞[8-10]，并且最有可能作为自体细胞构建的组织工程化骨组织应用于临床。本实验中BMSCs-NanoBCP陶瓷复合体成功的修复了SD大鼠的颅骨极限骨缺损证实了这一点。
目前用于组织工程支架材料主要有两类，一类是有机高分子材料，另一类为无机材料。在高分子材料中，目前应用较多支架材料有胶原、纤维蛋白、聚乳酸、壳聚糖和藻酸盐等[11-13]。它们在许多方面符合骨组织工程的要求，但存在力学性能较低，在体内降解时有酸性降解产物释放以及可引起无菌性炎症反应等缺陷，从而影响细胞和组织的生长与繁殖。无机材料中主要是生物陶瓷类[14]，这些生物陶瓷材料作为组织工程支架材料的效果是肯定的，但其脆性大不易加工成形并且体内降解困难，影响新骨的长入和后期的改建，故其应用受到一定限制。
纳米陶瓷材料具有：①小尺寸效应。②表面或界面效应使其呈现出与传统陶瓷显著不同的独特性能，由于比表面积的增加，其引导组织细胞的能力和生物降解性增强。也有研究表明组织工程支架材料表面的微观和亚微观结构对细胞的粘附与生长有很重要的影响[15]，而支架材料作为细胞载体，良好的细胞黏附性和生物相容性对进一步的组织形成具有重要意义[16-17]。
NanoBCP是一种新型支架材料，具有三维立体多孔结构、孔隙率可达60%~80%，其孔径为100~400 μm。羟基磷灰石/β-磷酸三钙（HA/β-TCP）比为7/3，其中NanoHA占70%。这种良好的三维互通的孔隙结构为成骨细胞的贴附、增殖提供了较大空间，而且有利于营养成分的渗透和血管化形成[18]。前面结果已证实经过诱导的BMSCs可以在该载体上良好增殖、细胞表型可稳定表达。Kurashina等[19]认为HA/β-TCP比为7/3 的多孔BCP陶瓷较其他比率的BCP陶瓷有较好的骨诱导性，多孔BCP陶瓷中HA/β-TCP比率影响材料的性质，他将不同比率的多孔BCP陶瓷植入兔子肌肉内，6个月后观察其成骨作用，发现只有HA/β-TCP比为7/3的样品中有新骨形成。

本实验中将自体BMSCs在经过体外诱导的情况下与NanoBCP陶瓷复合后直接进行颅骨缺损的修复，结果显示在不添加外源性生长因子的情况下，NanoBCP与BMSCs复合植入4周就发现有新生骨出现；术后16周发现大量的新骨生成，某些部位可以见到血管长入，形成骨髓样结构。术后X射线片显示作颅骨修复的两组陶瓷在术后4周已有吸收，16周NanoBCP/BMSCs组陶瓷中央部已有高密度骨形成，对标准的颅骨缺损有良好的修复效果。单纯NanoBCP组24周骨缺损部分愈合，骨缺损中央部密度不均匀。这是由于其成骨方式为骨引导方式，周围的细胞及纤维长入，材料中央部成骨较弱。而NanoBCP/BMSCs组除骨引导成骨外，BMSCs发挥成骨作用。可见NanoBCP作为支架材料，用于组织工程骨组织的构建是可行的。

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