生物活性玻璃/胶原蛋白/透明质酸/磷酸丝氨酸仿生复合支架的成骨及矿化效应*☆

张梅霞1，姚瑶1，闵少雄2，李妙1，靳安民2

课题背景：骨缺损修复替代的生物材料已从单一的无机物向有机无机复合材料发展，从单一的成分仿生走向功能仿生。本实验将生物活性玻璃与胶原蛋白、透明质酸和磷酸丝氨酸交联制备新型仿生复合支架，期望获得具有良好组织相容性和生物矿化性能的仿生骨组织替代材料。

应用要点：实验结果表明，生物活性玻璃/胶原蛋白/透明质酸/磷酸丝氨酸复合支架在保留生物玻璃优越的生物活性基础上，通过与3种天然有机物的整合，完善了复合支架的仿生与生物矿化性能，为骨组织工程支架材料临床应用奠定实验基础。

同行评价：本文通过动物实验观察了支架材料在植入动物体后诱导成骨和促进矿化方面的能力，并获得了定性和定量的实验结果。实验设计合理，提供的实验结果数据可靠，能够支持作者的结论。

南方医科大学珠江医院，1血液科，2骨科，广东省广州市 510282

张梅霞☆，女，1962年生，山东省牟平市人，汉族，2006年南方医科大学毕业，博士，副主任医师，副教授，主要从事干细胞与组织工程学的研究。
meixiaz88@
yahoo.com.cn

通讯作者：靳安民，主任医师，教授，博士生导师，南方医科大学珠江医院，广东省广州市 510282

背景：研制具有结构与功能化仿生作用的骨修复替代材料，应在模拟体内细胞生长环境中进行。
目的：观察生物活性玻璃/胶原蛋白/透明质酸/磷酸丝氨酸仿生复合支架材料植入体内后诱导成骨和促进矿化的能力。
设计、时间及地点：随机对照动物实验，于2005-06/2006-02在南方医科大学珠江医院血液科实验室完成。
材料：生物活性玻璃/胶原蛋白/透明质酸/磷酸丝氨酸支架、生物活性玻璃/胶原蛋白支架和58S生物玻璃支架为自制。40只健康成年日本大耳白兔制造两侧桡骨10 mm骨缺损模型。
干预：将40只模型兔随机分成4组，生物活性玻璃/胶原蛋白/透明质酸/磷酸丝氨酸组12只、生物活性玻璃/胶原蛋白组12只、58S生物玻璃组12只分别植入相应支架材料，空白对照组4只不植入任何物质。
主要观察指标：检测植入材料2，4，8，12周后缺损部位X射线、硬组织切片、骨形成率和矿化沉积率。
结果：40只模型兔80条桡骨全部进入结果分析。①术后所有动物伤口愈合良好，未发生骨折。②生物活性玻璃/胶原蛋白/透明质酸/磷酸丝氨酸组术后4周硬组织切片可见大量玫瑰红色新骨和绿色骨小梁形成，术后12周支架已基本由新生骨组织替代，哈弗系统形成；术后8周X射线显示骨皮质连接完整，12周缺损完全修复，髓腔基本再通。③生物活性玻璃/胶原蛋白/透明质酸/磷酸丝氨酸组术后4周的矿化沉积率和新骨形成速率比58S生物玻璃组高出了2.85倍和3.16倍，且明显优于生物活性玻璃/胶原蛋白组（P < 0.001）。
结论：生物活性玻璃/胶原蛋白/透明质酸/磷酸丝氨酸仿生复合支架在诱导成骨和促进生物矿化方面性能优越，其矿化机制有待进一步观察探讨。
关键词：仿生；复合支架；生物矿化；硬组织切片；生物材料

张梅霞，姚瑶，闵少雄，李妙，靳安民.生物活性玻璃/胶原蛋白/透明质酸/磷酸丝氨酸仿生复合支架的成骨及矿化效应[J].中国组织工程研究与临床康复，2008，12(14):2611-2614 [www.zglckf.com/zglckf/ejournal/upfiles/08-14/14k-2611(ps).pdf]

Effect of a biomimetic composite scaffold of bioglass/collagen/phosphatidyl serine/hyaluronic acid on induction of bone formation and mineralization

BACKGROUND:By simulating growing environment of cells in the body, a new artificial bone graft substitute material is developed, with structural and functional biomimetic effect.
OBJECTIVE: To observe in vivo effect of the biomimetic composite scaffold of bioglass/collagen/phosphatidyl serine/hyaluronic acid (BG-COL-PS-HYA) on induction of bone formation and mineralization.
DESIGN, TIME AND SETTING: The random controlled animal experiment was conducted in the Hematology Laboratory of Zhujiang Hospital, Southern Medical University from June 2005 to February 2006.
MATERIALS: BG-COL-PS-HYA scaffold, BG-COL scaffold and 58S BG scaffold were all self-made. Forty healthy adult Japan rabbits were used to create 10-mm bone defect models in 80 radiuses.
INTERVENTION: Totally 40 rabbits were randomized into four groups: BG-COL-PS-HYA group (n=12), BG-COL group (n=12), 58S BG group (n=12) and blank control group (n=4). The defect areas were implanted with corresponding grafts, while the blank control group was untreated.
MAIN OUTCOME MEASURES: At weeks 2, 4, 8 and 12 after operation, X-ray examination, hard tissue slicing, determination of bone formation rate (BFR) and mineral apposition rate (MAR) were all performed.
RESULTS: All 40 rabbits (80 radiuses) were involved in the result analysis. ① Intention was well in all animals after operation and there was no fracture. ② Four weeks after operation, a large quantity of rosy newly formed bone and green bone trabecula were showed in the BG-COL-PS-HYA group. At week 12, scaffold materials was substituted by new bone tissues basically, and Haversian system was visible. Eight weeks after operation, the results of X-ray film revealed that cortical bone was fully connected. At week 12, defects were fully repaired and medullary cavity was recanalized. ③ At week 4 after operation, the BFR and MAR in the BG-COL-PS-HYA group was 2.85 times and 3.16 times of that in the 58S BG group, respectively, which was obviously better than that in the BG-COL group (P < 0.001).
CONCLUSION: The BG-COL-PS-HYA biomimetic composite scaffold shows excellent characteristics in induction of bone formation and mineralization. But its biomineralization mechanism still needs further research.

Zhang MX, Yao Y, Min SX, Li M, Jin AM.Effect of a biomimetic composite scaffold of bioglass/collagen/phosphatidyl serine/hyaluronic acid on induction of bone formation and mineralization.Zhongguo Zuzhi Gongcheng Yanjiu yu Linchuang Kangfu 2008;12(14):2611-2614 [www.zglckf.com/zglckf/ejournal/upfiles/08-14/14k-2611(ps).pdf]

利用天然有机物与无机物合成可降解的复合材料作为骨组织工程支架，模拟体内细胞生长条件与环境，使之更适合于成骨细胞生长繁殖，促进骨缺损修复，已成为近年来国内外研究的新方向[1-8]。本文将一种由生物活性玻璃与胶原、透明质酸、磷酸丝氨酸等天然生物分子复合制备而成的新型仿生骨组织工程支架植入兔桡骨节段缺损处，探索其体内生物矿化性能，为多组分、多级结构的功能化仿生支架研制与应用提供实验依据。

设计：随机对照动物实验。
单位：南方医科大学珠江医院血液科。
材料：实验于2005-06/2006-02在南方医科大学珠江医院血液实验室完成。选用一级健康成年日本大耳白兔40只（80条桡骨），雌雄不限，平均体质量1.96 kg，由解放军广州军区总院医学实验动物中心（SCXK（军）2004B018，2004A047）提供。术前1周开始喂饲实验动物中心配制的颗粒饲料和自来水，并在相同条件下饲养。随机分为4组，生物活性玻璃/胶原蛋白/透明质酸/磷酸丝氨酸组、生物活性玻璃/胶原蛋白组和58S生物玻璃组各12只，空白对照组4只。实验过程中动物处置符合动物伦理学标准。
技术路线：制备仿生复合支架生物活性玻璃/胶原蛋白/透明质酸/磷酸丝氨酸、生物活性玻璃/胶原蛋白，方法见参考文献[9]。在植入体内前用γ射线照射消毒。
造模及植入方法：双前腿去毛，速眠新Ⅱ注射液1.5 mL＋盐酸氯胺酮注射液0.1 g＋阿托品1 mg混合液按0.4 mL/kg，肌肉注射麻醉，在前腿桡侧沿桡骨做2.5 cm切口，显露桡骨并剥离骨膜，在距桡骨远端3 cm处截骨，再向近端距第一截骨线10 mm做第2个截骨，连同骨膜去除截除的骨段，然后分别植入生物活性玻璃/胶原蛋白/透明质酸/磷酸丝氨酸、生物活性玻璃/胶原蛋白、58S生物玻璃支架材料，空白对照组不植入任何物质，用肌肉覆盖缺损区，缝合皮肤，放入笼内喂养。术后立即肌注青霉素40 万U/d，连续2 d。不做任何形式的内、外固定。
X射线检查：分别于术后2，4，8，12周用日本岛津400 mA X射线机，在40 kV，3.2 mA·s条件曝光，自动洗片机冲洗胶片后观察。摄片后采用耳缘静脉注射空气处死动物，取出整个尺、桡骨全段，用40 g/L甲醛溶液固定备用；各时间点各取1个标本固定于戊二醛中备用。
硬组织标本制作：四环素双标记的标本固定后逐级上行脱水，纯二甲苯中充分脱水后，甲基丙烯酸甲酯(MMA)包埋。重型雪橇式切片机(Leica SM2500 )切片10 μm、5 μm。四环素双标记切片(10 μm)直接封固。脱水后切片在1∶1的苏木精与氯化铁混合染液中染色25 min→蒸馏水和自来水冲洗→10 min×2→1%丽春红-酸性品红染色液染色17 min→新鲜过滤的橙黄液染色7 min→新鲜过滤的亮绿液染色20 min→体积分数为0.95，1的乙醇脱水→二甲苯冲洗，中性树胶封固。
骨骼荧光标记方法：饲养至4，12周时，分别选取5只兔子进行骨骼荧光标记，具体做法是：兔子处死前13，14 d分别在皮下注射25 mg/kg (1 μL/g)盐酸四环素。处死前第3，4天皮下注射0.5%钙黄绿素(Calcein)5 mg/kg(1 μL/ g)各一次，两次荧光标记间隔时间10 d。在荧光显微镜下，沉积在骨表面的四环素荧光呈黄色，沉积在骨表面的Calcein荧光显绿色。
骨形成率与矿化沉积率测定：荧光显微镜观察，并通过图像分析系统对四环素标记的不脱钙切片用HPIAS-1000高清晰度彩色病理图文报告管理系统作形态计量学测量和分析。

主要观察指标：主要结局：①术后硬组织切片观察。②术后骨形成率与矿化沉积率测定。次要结局：①大体观察。②术后X射线检查。
设计、实施、评估者：设计为第一作者，实施为第二、三、四作者，评估为第一、五作者。
统计学分析：由第一作者采用SPSS 13.0软件对实验数据进行析因设计方差分析，各实验组均数间多重比较采用LSD-t检验。

2.1 实验动物数量分析实验过程中无动物死亡脱失，40只兔子（80条桡骨）全部进入结果分析。
2.2 统计描述
2.2.1 各组大体观察结果所用实验动物手术后当日恢复正常活动。术后手术肢体均出现不同程度的肿胀，3~5 d后消退，伤口愈合良好，未发生伤口化脓感染，活动、进食基本正常，各实验兔体质量均无明显减轻。
2.2.2 各组术后X射线检查结果

缺损处X射线表现—
生物活性玻璃/胶原蛋白/透明质酸/磷酸丝氨酸组：
术后2周：两截骨端有明显致密影，缺损区内均匀低密度影，外层可见骨痂形成，将两断端相连。
术后4周：两截骨端和缺损区见大量骨痂生长,缺损基本消失。
术后8周：缺损处两断端间形成新骨桥接，骨皮质连接完整，可见部分髓腔再通。
术后12周：髓腔基本再通，缺损完全修复。

生物活性玻璃/胶原蛋白组：
术后2周：缺损明显。
术后4周：截骨断端可见低密度影，有少量骨痂形成，缺损处依然清晰可见。
术后8周：两侧骨皮质断端间有少量骨痂形成。
术后12周：中心部位仍可见缺损，周围有部分新骨形成。

58S生物玻璃组：
术后2周：缺损明显，可见絮状阴影。
术后4周：截骨断端可见少量骨痂生长，缺损区絮状阴影较前致密，有颗粒征象。
术后8，12周：缺损区移植材料影清晰可见，有部分降解吸收，骨缺损少部分修复。

空白对照组：
术后2，4周：截骨断端清晰可见。
术后8，12周：两截骨端有少量骨痂和硬化，骨不连征象明显。

生物活性玻璃/胶原蛋白/透明质酸/磷酸丝氨酸组：
2，4，12周X射线表现，见图1。

生物活性玻璃/胶原蛋白/透明质酸/磷酸丝氨酸组：
术后2周：有大量成骨细胞由缺损断端向支架内生长。
术后4周：可见大量新骨和骨小梁形成。
术后12周：支架已基本由新生骨组织替代，骨基质中骨胶纤维规律排列，且与骨盐结晶紧密结合构成骨板，哈弗系统形成。

生物活性玻璃/胶原蛋白组：
各时段新骨形成均明显落后于生物活性玻璃/胶原蛋白/透明质酸/磷酸丝氨酸组。

58S生物玻璃组：
术后12周：支架区内仍可见较多纤维结缔组织增生，残余材料大片存在。

2.2.4 各组术后骨形成率和矿化沉积率的荧光显微镜观察术后4，12周，生物活性玻璃/胶原蛋白/透明质酸/磷酸丝氨酸组：支架植入区内可见四环素荧光标记，每个视野中可见较多条状荧光带，双荧光带之间的距离较宽。生物活性玻璃/胶原蛋白组：同样可见双荧光带的存在, 但数量较少，且双荧光带之间的距离窄。58S生物玻璃组：双荧光带存在但相互重叠，没有间距，见图2。

表1统计学分析显示，矿化沉积率不同实验组间F＝784.375，P < 0.001，不同时间组间F＝119.561，P < 0.001；LSD法两两比较P < 0.001。骨形成率不同实验组F＝1 144.996，P < 0.001，不同时间组F＝163.468，P < 0.001；LSD法两两比较P < 0.001。从表1看出生物活性玻璃/胶原蛋白/透明质酸/磷酸丝氨酸组植入后的4周矿化沉积率和新骨形成速率己很高，比58S生物玻璃组分别高出了2.85倍和3.16倍，且明显优于生物活性玻璃/胶原蛋白组。动态观察发现新骨的生长速率在材料植入后12周有所下降，但仍比其他组高，说明随植入时间的延长，支架材料完全被新骨组织所替代。而58S生物玻璃组的新骨形成速率表现低而平稳。

生物矿化是通过有机大分子和无机矿物离子在界面处的相互作用，从分子水平控制无机矿物相的析出，从而使生物矿物具有特殊的高级结构和组装方式。生物矿化可以分为4个阶段[10-11]：①有机大分子预组织。在矿物沉积前构造一个有组织的反应环境，该环境决定了无机物质成核的位置。②界面分子识别。在已形成的有机大分子组装体的控制下，无机物从溶液中析出，在有机溶液界面处成核。③生长调制。无机相通过晶体生长进行组装得到亚单元，同时在形态、尺寸、取向和结构上受到有机分子组装体的控制。④细胞加工。在细胞参与下亚单元组装成高级结构。研究表明：大多数矿化蛋白都富含天冬氨酸、谷氨酸和磷酸丝氨酸，其羧基（-COOH）和磷酸根基团（-PO4H2）是促发和控制矿化的有利基因，与钙离子具有较强的亲和力。胶原蛋白中的两亲性分子的RGD序列也含有磷酸化丝氨酸残基，能增强与钙离子的相互作用，调控羟基磷灰石结晶的生长[1,12-15]。因而，生物活性玻璃/胶原蛋白/透明质酸/磷酸丝氨酸复合材料植入体内后，在胶原蛋白、透明质酸和磷酸丝氨酸的协同作用下，使材料与宿主骨之间的界面产生局部高钙、磷浓度区域，钙、磷浓度升高引发钙盐沉积并刺激相邻骨组织向材料内生长，而磷酸钙的晶体沉积也可能会刺激破骨细胞的活性，破骨细胞的活化同时会导致成骨细胞活性的提高。钙、磷可被成骨细胞摄取，参与植入区新骨的形成，从而导致新骨的形成速率加快。随植入时间的延长，材料逐渐降解，且降解速率降低，局部钙磷浓度降低，新骨形成速率下降，最终支架材料完全被新生骨组织所替代。本实验将生物活性玻璃与胶原蛋白、透明质酸和磷酸丝氨酸交联制备的新型仿生复合支架，在保留BG优越的生物活性基础上，通过3种天然有机物的整合，完善了支架的仿生与生物矿化性能，特别是磷酸丝氨酸的参与对生物矿化、新骨形成起到积极的促进作用。
本实验结果进一步说明仿生型生物活性玻璃/胶原蛋白/透明质酸/磷酸丝氨酸作为一种骨组织工程支架材料，由于其组成和结构与天然骨及其细胞外基质相似，有较强的生物矿化效能，可引导新生骨组织再生，较快地修复骨缺损。

1 Wahl DA, Sachlos E, Liu C, et al. Controlling the processing of collagen-hydroxyapatite scaffolds for bone tissue engineering. J Mater Sci Mater Med 2007;18(2):201-209
2 Wang XL, Li XD, Wang, XM, et al. Investigation of a Collagen-Chitosan-Hydroxyapatite System for Novel Bone Substitutes. Key Engineering Materials 2007; 330/332(Pt1):415-418
3 Wen GW,Wang J,Li M, et al, Study on Tissue Engineering Scaffolds of Silk Fibroin-Chitosan/nano-Hydroxyapatite Composite. .Key Eng Mater 2007; 330/332(Pt2): 971-974
4 Martinetti R, Dolcini L, Merello L,et al.Biomimetic Bone Graft With Higher Bioactivity. Key Eng Mater 2007;330/332(Pt2): 943-946
5 Simpson RL, Wiria FE, Amis AA,et al.Development of a 95/5 poly(L-lactide-co-glycolide)/hydroxylapatite and beta-tricalcium phosphate scaffold as bone replacement material via selective laser sintering. J Biomed Mater Res B Appl Biomater 2008;84(1):17-25
6 Georgiou G, Mathieu L, Pioletti DP,et al. Polylactic acid-phosphate glass composite foams as scaffolds for bone tissue engineering. J Biomed Mater Res B Appl Biomater 2007;80(2):322-331
7 Homaeigohar SSh, Shokrgozar MA, Khavandi A,et al. In vitro biological evaluation of beta-TCP/HDPE--A novel orthopedic composite: a survey using human osteoblast and fibroblast bone cells. J Biomed Mater Res A 2008;84(2):491-499
8 Liu Y, Wang M.Thermophysical and Mechanical Properties of β-Tricalcium Phosphate Reinforced Polyhydroxybutyrate and Polyhydroxybutyrate-co-hydroxyvalerate Composites. Key Eng Mater 2007;334/335(Pt2): 1217-1220
9 Zhang MX,Jin AM,Min SX,et al.Zhongguo Zuzhi Gongcheng Yanjiu Yu Linchuang Kangfu 2006;10(29):59-62
张梅霞,靳安民,闵少雄,等. 仿生型生物玻璃/胶原蛋白/磷脂酰丝氨酸/透明质酸复合支架修复兔桡骨缺损[J]. 中国组织工程研究与临床康复,2006,10(29):59-62
10 Green D, Walsh D, Mann S, et al. The potential of biomimesis in bone tissue engineering: lessons from the design and synthesis of invertebrate skeletons. Bone 2002;30(6):810－815
11 沈方宏. 胶原蛋白调制碳酸钙晶体生长的研究:[硕士学位论文].北京:清华大学,2002
12 Hartgerink JD, Beniash E, Stupp SI. Self-assembly and mineralization of peptide-amphiphile nanofibers. Science 2001;294(5547):1684-1688
13 Donzelli E, Salvade A, Mimo P, et al. Mesenchymal stem cells cultured on a collagen scaffold: In vitro osteogenic differentiation. Arch Oral Biol 2007;52(1):64-73
14 Wang XL, Li XD, Wang XM, et al,. Investigation of a Collagen-Chitosan-Hydroxyapatite System for Novel Bone Substitutes. Key Eng Mater 2007; 330/332(Pt1): 415-418
15 Fukui N, Sato T, Kuboki Y, et al. Bone tissue reaction of nano-hydroxyapatite / collagen composite at the early stage of implantation. Biomed Mater Eng 2008;18(1):25-33