课题背景：各种基质材料单独应用时成骨能力有限，为增强材料的成骨能力，将支架材料、成骨细胞和生长因子等复合构成复合材料用于骨移植已成为目前植骨材料的研究方向。四环素可吸附在矿物质表面、丙稀酸脂链、可吸收纤维素、交联胶原膜上，并可以持续释放。实验利用四环素吸附在矿物质和胶原膜上发挥作用的特性，将四环素吸附于胶原生物衍生骨复合材料，从而构建新型生物衍生骨材料。

应用要点：①以体外培养的兔成骨细胞为种子细胞，四环素-胶原生物衍生骨缓释材料为支架材料成功构建四环素-胶原生物衍生骨复合材料，提示四环素可用于构建组织工程骨材料。②阳性对照的实验结果提示，四环素能够为骨组织再生提供类生长因子样功能。

偏倚或不足：四环素-胶原生物衍生骨缓释材料，是一种较为理想的类生长因子载体材料。但将其植入机体后可能出现骨沉积反应，对骨形成产生影响。因此，合适剂量的四环素对于四环素-胶原生物衍生骨缓释材料促进骨再生起决定性作用。

天津市天津医院创伤骨科，天津市 300211

梁 军☆，男，1966年生，吉林省白山市人，汉族，2005年四川大学毕业，博士，副主任医师，主要从事创伤骨科的研究。
liangjun9696@ yahoo.com.cn

摘要

背景：各种基质材料单独应用时成骨能力有限，为增强材料的成骨能力，应用复合材料修复骨缺损是组织工程的发展方向。
目的：探讨四环素-胶原生物衍生骨材料植入体内后的成骨能力。
设计、时间及地点：于2004-09/2005-01在四川大学华西医学中心组织工程实验室完成随机分组设计的对照观察实验。
材料：选择新西兰大白兔24只，按随机数字表法分为2组，每组12只。制备兔桡骨中段1.5 cm骨缺损模型。新鲜人骨自行制备四环素-胶原衍生骨材料。
方法：将两种材料分别植入兔桡骨缺损部位。实验组为四环素-胶原生物衍生骨，对照组为胶原生物衍生骨。术后6，12周动物麻醉后处死取材。
主要观察指标：X射线观察和组织学检测缺损部位的成骨情况。
结果：纳入动物24只，均进入结果分析。①X射线结果：术后6周，实验组整个缺损区均可见到骨痂生成，对照组仅在缺损两端有骨痂生成。术后12周，实验组缺损部位已完全被新生成骨组织所填充，与自体骨基本相近，已有骨髓腔出现，对照组骨缺损区可见明显的骨生成影像。②组织学结果：术后6周，实验组在材料内部孔隙区可见到新生类骨质形成，对照组缺损区无骨组织形成。术后12周，实验组可见大量的编织骨样组织，已形成板层骨样结构，骨髓腔已贯通，对照组缺损区可见有骨样组织形成。
结论：胶原生物衍生骨与四环素-胶原生物衍生骨材料均可促进骨再生，四环素-胶原生物衍生骨材料对兔骨缺损修复效果优于胶原生物衍生骨材料。
关键词：四环素；骨缺损；组织工程；生物材料

梁军，辛景义，曹红彬.四环素-胶原生物衍生骨缓释材料修复骨缺损[J].中国组织工程研究与临床康复，2008，12(14):2615-2618
[www.zglckf.com/zglckf/ejournal/upfiles/08-14/14k-2615(ps).pdf]

中图分类号:R318
文献标识码:A
文章编号:1673-8225
(2008)14-02615-04

收稿日期：2007-11-28 修回日期：2008-02-20 (07-50-11-6596/Y·A)

Tetracycline loaded bio-derived bone to repair bone defect

Abstract

BACKGROUND:Compound materials have strong osteogenic ability, which reinforce the substitute materials used alone. Compound material will be commonly used to repair bone defects in tissue engineering.
OBJECTIVE: To explore the osteogenic capacity of tetracycline loaded bio-derived bone in vivo.
DESIGN, TIME AND SETTING: The randomized controlled observation was performed at Tissue Engineering Laboratory (State Key Laboratory) of West China Center of Medical Sciences, Sichuan University from September 2004 to January 2005.
MATERIALS: Twenty-four New Zealand white rabbits were randomly divided into 2 groups (n=12). Rabbit models of radial middle segment defect (1.5 cm) were established. Tetracycline collagen bio-derived bone was made of fresh human bone.
METHODS: The tetracycline collagen bio-derived bone was implanted into radial defects of experimental group, and collagen bio-derived bone was implanted into control group. All rabbits were executed 6 and 12 weeks after operation.
MAIN OUTCOME MEASURES: Osteogenic condition in all specimens was examined by X-ray and histological methods.
RESULTS: Twenty-four animals were included in final analysis. ①X-ray results showed that osteotylus was seen in the whole defect area of the experimental group in postoperative 6 weeks, while only in the defect ends of the control group. In 12 weeks after surgery, new bone tissue filled all defect area of the experimental group, which was basically consistent with normal bone, even medullary canal was formed. Osteogenic images were found in the control group. ②Histological results suggested that new osteoid formation was observed in internal pore zone in the experimental group in 6 weeks, while no bone tissue was found in the control group. In 12 weeks, much woven bone was seen in the experimental group, and lamellar bone structure had formed and medullary cavity of bones had transfixed. Osteoid formation was observed in the control group.
CONCLUSION: Both tetracycline collagen bio-derived bone and collagen bio-derived bone can promote bone formation, but tetracycline loaded bio-derived materials show superior effect in repairing defects.

Liang J, Xin JY, Cao HB.Tetracycline loaded bio-derived bone to repair bone defect.Zhongguo Zuzhi Gongcheng Yanjiu yu Linchuang Kangfu 2008;12(14):2615-2618 [www.zglckf.com/zglckf/ejournal/upfiles//08-14/14k-2615 (ps).pdf]

0 引言

骨缺损的修复是几个世纪以来不断深入研究的重要课题，植骨术是矫形外科治疗骨缺损的重要方法之一。骨组织工程的研究重点是构建类似人体骨组织结构和性能的支架材料，然后将其移植到体内修复或改善损伤组织的功能。同种异体骨与自体骨具有相同的成分和结构，一直以来都是替代自体骨移植的首选材料，以同种异体骨为支架材料，复合生物因子和干细胞等材料应用于骨移植，已经取得了相当的进展[1]。大环内酯类（四环素族、土霉素族等）促进骨愈合的机制，可能源于初始阶段的抗菌作用；也可能通过抑制胶原酶的活性使骨的形态正常，可能通过降低破骨细胞的活性抑制骨吸收, 增强成骨细胞的活性刺激胶原的产生，从而促进骨再生[2]。将支架材料、成骨细胞和生长因子等复合构成复合材料用于骨移植已成为目前植骨材料的研究方向。

1 材料和方法

设计：随机分组设计、对照动物实验。
单位：天津市天津医院创伤骨科。
材料：实验于2004-09/2005-01在四川大学华西医学中心组织工程实验室（国家重点实验室）完成。选择无菌级新西兰大白兔24只，雌雄不拘，体质量2.5~3.0 kg，由四川大学动物中心提供。实验用材料：新鲜人骨（患者自愿捐献，并对实验知情同意），Ⅰ型胶原（美国Sigma公司）。仪器：深低温冰箱（日本SANYO公司），真空低温冷冻干燥机（德国Heto公司）。
设计、实施、评估者：设计为第一作者，实施为全部作者，评估为第一作者，评估者经过正规培训。
技术路线：
WO-1生物衍生骨支架材料的制备：取新鲜人骨剔除周围软组织、骨膜和关节软骨，保留一侧皮质，制成1.5 cm×0.5 cm×0.5 cm骨条，生理盐水反复冲洗，去除骨髓和残血，经过系列脱脂、脱细胞和脱蛋白过程，-80 ℃深低温冰箱预冻，最后经真空低温冷冻干燥机冻干备用。将冻干的生物衍生骨浸入Ⅰ型胶原溶液中1 h，真空吸附法使胶原充分涂于材料的表面，将复合材料取出，用蒸馏水冲洗，-80 ℃深低温冰箱预冻，经真空冷冻干燥机冻干备用。取冻干备用的胶原生物衍生骨复合材料，放入WO-1溶液中30 min后取出，重复上面冻干过程，制得WO-1复合生物衍生骨材料，环氧乙烷灭菌备用。
动物模型制备：新西兰大白兔24只，按随机数字表法分为2组，每组12只。体积分数为0.1的水合氯醛腹腔内麻醉，双前肢消毒，铺无菌巾。取兔桡骨中段切口，切开皮肤，从肌间隙进入，切取桡骨中段包括骨膜 1.5 cm。将消毒备用的3种材料植入骨缺损，术中不予固定，逐层缝合。术后未予外固定，兔自由活动。
主要观察指标：①大体标本观察：术后6，12周动物麻醉后处死，取材。取动物前肢，观察植入材料与宿主的连接情况。②放射学检查：术后 6，12周取动物前肢拍片，观察缺损部位成骨情况，Ｘ射线评分标准参考Lane-Sanhu[1]。③组织学检查：术后6，12周取骨缺损部位标本，40 g/L多聚甲醛固定，然后乙二胺四乙酸脱钙8周，乙醇梯度脱水，石蜡包埋，切片制成5 μm厚，常规苏木精-伊红染色观察。
统计学分析：由第一作者采用SPSS 11.5进行数据处理，数据以_x±s表示，组间分析应用配对t检验，P < 0.05为差异有显著性意义。

2 结果

2.1 实验动物数量分析 纳入动物24只，均进入结果分析，无脱落。
2.2 大体标本观察 术后6周，实验组缺损部位骨形成明显，质地较硬，直径较正常尺骨略小。对照组缺损部位周围有软组织包裹，有骨痂形成，有一定强度。术后12周，实验组缺损部位新生骨的形态基本与正常尺骨一致，质地较硬，而对照组缺损部位周围有软组织包裹，有骨痂形成，缺损部位完全为类骨样组织充填，有一定强度。
2.3 X射线拍片观察 术后6周，实验组整个缺损区均可见到骨痂生成，已明显形成骨缺损区的桥接，而对照组仍仅在缺损两端有骨痂生成，缺损区中央部分无明显骨生成影像。术后12周，实验组可观察到缺损区已完全被新生成骨组织所填充，影像学自体骨基本相近，已有骨髓腔的出现，见图1a，而对照组的骨缺损区可见明显的骨生成影像，呈云雾状，见图1b。

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2.4 组织学标本观察 术后6周，对照组缺损区没有骨组织形成，在支架材料的孔隙内有大量的纤维结缔组织充填，支架材料已部分降解，有大量新生血管形成，少量炎性细胞浸润。实验组在材料内部孔隙区可见到新生的类骨质形成，类骨质内成骨细胞大量存在，细胞肥大，细胞排列紧密，并有骨陷窝形成，血管形成明显。术后12周，对照组缺损区可见有骨样组织形成，支架材料已绝大部分降解，血管丰富，见图2a。实验组可见大量的编织骨样组织，已形成板层骨样结构，骨髓腔已贯通，有典型的同心圆排列的哈佛氏系统形成，见图2b。

3 讨论

骨缺损的广泛性和植骨材料研究的重要性促进了骨组织工程的发展，近10年发展起来的组织工程学，为骨缺损的修复开辟了新途径。生物衍生骨材料的天然网状孔隙未受到明显破坏，与化学合成材料比，有其固有的优越性[2]。人骨生物衍生材料脱蛋白骨和脱钙骨可作为理想的支架材料应用于组织工程[3]。四环素是大环内酯类的抗生素，对大多数革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌都有抗菌作用，在局部组织中有缓释和鳌合的双向作用，有促进成骨细胞分化和增殖的作用，并有诱导异位成骨的能力[4]。四环素可负载于矿物质表面、丙稀酸脂链、可吸收纤维素、交联胶原膜和可降解聚乳酸内植物等，并可以持续释放[5-8]。本实验利用四环素可以吸附在矿物质和胶原膜上发挥作用的特性，将WO-1吸附于胶原生物衍生骨复合材料，从而构建出新型生物衍生骨材料。
大体观察可见四环素胶原生物衍生骨材料植入到动物体内后，四环素胶原生物衍生骨材料组在术后表现出良好的成骨性能。
术后X射线检查证实实验组骨缺损区范围内均可见骨痂生成，而对照组仅在植入材料与宿主结合部位可见骨痂。
组织学发现，实验组材料表面和孔隙内均可见骨样组织、编织骨和板层骨形成，而对照组仅在材料与宿主骨的桥接部形成骨样组织和新生骨。对照组术后12周骨缺损愈合明显低于实验组，研究表明四环素的复合增加了材料的生物相容性，促进了骨缺损愈合的速度,四环素对复合支架材料修复骨缺损具有重要意义[9-14],四环素在骨组织再生过程中起重要作用[15-18]。
各种基质材料单独应用时成骨能力有限，为增强材料的成骨能力，应用复合材料修复骨缺损是组织工程的发展方向。梁军等[19]研究表明WO-1生物衍生骨缓释材料植入骨缺损中既能持续维持局部有效的抗生素浓度，又能作为骨移植材料促进骨组织再生，可作为预防骨感染，同时修复骨缺损的理想材料。赵子义等[20]研究证明组织工程骨明显提高骨生成的速度。
本实验构建的四环素-胶原生物衍生骨材料，具有天然骨的骨小梁、小梁间隙及骨内管腔系统，研究证明胶原修饰后的单纯生物衍生骨材料植入兔桡骨临界骨缺损后，未见明显免疫反应，明显促进了骨组织再生，表现出良好的生物相容性，是一种理想的组织工程骨材料。

4 参考文献

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