滨珊瑚及富血小板血浆复合材料修复兔下颌骨缺损★

郑军1，蒋立坚1，吴新中1，李卫国1，刘东光2

课题背景：近年来，国内外学者开始将富血小板血浆与各种骨移植材料复合应用于颌骨缺损的修复，取得了一些肯定的结果，显示了富血小板血浆在骨缺损修复领域良好的应用前景。

应用要点：实验将富血小板血浆与滨珊瑚（天然珊瑚的一种）复合，用于修复兔下颌骨缺损，加入含富血小板血浆材料的缺损区较未加入区有更多的间充质细胞和成骨细胞，并且有更多的新生骨形成。提示富血小板血浆能起到很好的促进骨生长的效果，滨珊瑚与富血小板血浆的复合物能显著促进兔下颌骨缺损的修复。

偏倚或不足：①对血液样本手工血小板计数可能会产生误差，造成实验结果的偏倚。②由于兔骨生长较快，而实验采用的观察时间为2，4，8周，时间间隔较长，造成对兔骨组织生长过程的观察不够连续，对富血小板血浆的加入对骨组织生长所产生的影响也不够明确。

1中山大学附属第三医院口腔科，广东省广州市 510630；2阳江市人民医院骨科，广东省阳江市 529500

郑军★，男，1980年生，江西省于都县人，汉族，2006年中山大学毕业，硕士，医师，主要从事口腔颌面外科的临床工作和相关研究。现工作在广东省江门市中心医院口腔科。
zj-doc@163.com

通讯作者：蒋立坚，副主任医师，副教授，硕士，中山大学附属第三医院口腔科，广东省广州市
510630 jljtf@hotmail.com

背景：近年来的一些研究表明自体来源的富血小板血浆可能对骨缺损修复具有促进作用。
目的：观察复合富血小板血浆的滨珊瑚对兔下颌骨缺损的修复作用。
设计、时间及地点：随机分组设计、对照动物实验，2005-07/2006-03在中山大学附属第三医院动物实验室完成。
材料：采用海南产滨珊瑚，孔径为150~200 μm，孔隙率40%~50%，碾磨及筛选出直径200~400 μm大小颗粒。
方法：选择新西兰兔24只，采用自身对照方法，在每只动物的两侧下颌骨体部分别作1处洞穿型骨缺损，大小15 mm×5 mm，随机选择一侧为实验侧，另一侧为对照侧。植入滨珊瑚/富血小板血浆的复合物作为实验组，植入滨珊瑚/贫血小板血浆的复合物作为对照组。
主要观察指标：术后2，4，8，12周通过大体观察、X射线片、组织学染色观察兔两侧下颌骨愈合情况。
结果：新西兰兔24只均进入结果分析。术后2，4，8周，加入富血小板血浆的材料区比较对照侧可以看到更多的间充质细胞和成骨细胞，并且有更多的新生骨形成。术后12周，两侧缺损区植骨床生长没有区别，骨质均成熟和致密。
结论：富血小板血浆能起到很好的促进骨生长的效果，滨珊瑚与富血小板血浆的复合物能显著促进兔下颌骨缺损的修复。
关键词：滨珊瑚；富血小板血浆；生长因子；骨缺损；生物材料

郑军，蒋立坚，吴新中，李卫国，刘东光.滨珊瑚及富血小板血浆复合材料修复兔下颌骨缺损[J].中国组织工程研究与临床康复，2008，12(14):2619-2622 [www.zglckf.com/zglckf/ejournal/upfiles/08-12/12k-2619(ps).pdf]

Platelet-rich plasma combined with Porites for repairing rabbit mandibular defects

BACKGROUND:Recent researches reveal that autologous platelet-rich plasma (PRP) may promote the repair of bone defect.
OBJECTIVE: To assess the composite graft of PRP and Porites coral in the repair of mandibular bone defect in rabbits.
DESIGN, TIME AND SETTING: It was a randomized grouping, controlled animal study performed in the Animal Experimental Laboratory of The Third Affiliated Hospital of Sun Yat-sen University from July 2005 to March 2006.
MATERIALS: Porites coral, produced in Hainan Province, with the aperture of 150-200 μm and porosity of 40%-50% was milled and filtrated into particles that the diameter was 200-400 μm.
METHODS: Twenty-four New Zealand white rabbits were selected and a 15 mm×5 mm perforated defect of the mandible was made bilaterally in every rabbit. The bilateral defects were randomly immediately grafted with the composite of Porites/PRP (as the experiment group) or the composite of Porites/platelet poor plasma (as the control group).
MAIN OUTCOME MEASURES: The mandibular healing was evaluated by gross observation, X-ray film and histological dyeing at 2, 4, 8 and 12 weeks postoperatively.
RESULTS: Totally 24 rabbits were involved in the result analysis. More mesenchymal cells and osteoblasts, as well as a greater volume of new bone formation were observed in the graft sites that received PRP than the control at 2, 4 and 8 weeks postoperatively. But there was no difference in the graft growth between the two graft sites at 12 weeks, and the newly formed bone was all dense and mature.
CONCLUSION: PRP can promote bone regeneration. PRP/Porites composite can remarkably facilitate the repair of rabbit mandibular defects. .

Zheng J, Jiang LJ, Wu XZ, Li WG, Liu DG.Platelet-rich plasma combined with Porites for repairing rabbit mandibular defects.Zhongguo Zuzhi Gongcheng Yanjiu yu Linchuang Kangfu 2008;12(14):2619-2622
[www.zglckf.com/zglckf/ejournal/upfiles/08-12/12k-2619(ps).pdf]

近年来，一些研究将富血小板血浆(Platelet-Rich Plasma，PRP)应用于骨缺损的修复，取得了一些肯定的结果，显示了PRP在骨缺损修复领域良好的应用前景。本实验将PRP与滨珊瑚复合修复兔下颌骨缺损，术后采用大体观察、X射线及组织学方法，以了解PRP对骨组织修复的影响，评价PRP/滨珊瑚复合材料修复兔下颌骨缺损的治疗效果。

设计：随机分组设计、对照动物实验。
单位：中山大学附属第三医院口腔科。
材料：实验于2005-07/2006-03在中山大学附属第三医院动物实验室完成。选择健康新西兰大白兔24只，体质量2.5~3.0 kg，雌雄不限，分笼饲养，由广州市白云区穗北实验动物养殖场提供（许可证号SCXK(粤)2003-0005,符合GB14922.1-2001、GB14922.2-2001、DB44/63-94普通级标准）。实验过程中对动物处置符合动物伦理学标准。采用海南产滨珊瑚，孔径为150~ 200 μm，孔隙率40%~50%，碾磨及筛选出直径200~400 μm大小颗粒，环氧乙烷消毒，干燥后备用。
设计、实施、评估者：设计为第一作者，实施为全部作者，评估为第二作者，评估者经过正规培训。
技术路线：
PRP的制备：兔大腿外侧区刀片剃毛并消毒后，用5 mL真空采血管（抗凝剂为枸橼酸钠）从兔大腿外侧静脉抽取5 mL血液，混匀后将采血管置入离心机，采用两次离心方法，第1次离心2 400 r/min，离心10 min，离心半径10 cm。离心完成后，将上清液与血小板层转移至一3 mL真空采血管（无抗凝剂），然后将此采血管直接置入离心机中进行第2次离心，3 600 r/min，离心 10 min，离心半径10 cm，移除采血管上清液，保留底层液体约0.8 mL，即为PRP液。移除上清液约0.8 mL转移至另一洁净真空管中，此液体即为贫血小板血浆（Platelet-Poor Plasma，PPP）。
滨珊瑚/PRP复合材料制备：在即将植入动物体内前，将已制备好的0.8 mL PRP与500 U凝血酶、100 g/L氯化钙0.5 mL及15 g制备好的滨珊瑚颗粒充分混合，形成黏性复合物。
动物实验：健康新西兰大白兔24只，采用自身对照方法，在每只动物的两侧下颌骨体部分别作1处洞穿型骨缺损，大小15 mm×5 mm，随机选择一侧为实验侧，另一侧为对照侧。术前肌注20万U青霉素预防感染，肌注速眠新Ⅱ注射液0.2 mL/kg行全身麻醉。麻醉起效后，对兔下颌区及颈部剃毛，消毒铺巾，切开皮肤及皮下组织，显露下颌骨，用涡轮机配合裂钻在双侧下颌骨体部相同位置各造成一个15 mm× 5 mm洞穿型骨缺损，切割同时用无菌生理盐水冷却、冲洗。用干纱布压迫止血后，实验侧骨缺损填入滨珊瑚/PRP复合材料，对照侧骨缺损填入滨珊瑚/PPP复合材料，逐层缝合伤口。术后肌注青霉素20万U，2次/d，连续3 d，均衡标准饲料喂养。
主要观察指标：①血小板计数：在制备PRP时，取0.5 mL全血及PRP样本，高倍光镜下行人工血小板计数。②大体形态观察：术后2，4，8，12周，麻醉后空气栓塞法处死动物，取出双侧下颌骨标本，肉眼观察骨缺损修复情况。③放射学检查：术后2，4，8，12周取出下颌骨标本后立即行X射线检查。③组织学检查：术后2，4，8，12周取出下颌骨标本后，立即切取标本（包括移植材料与周边部分骨质），常规固定，并常规脱钙、脱水、透明及石蜡包埋，连续切片，苏木精-伊红染色，光镜下观察，中山大学附属光华口腔医院病理科协助完成。

2.1 实验动物数量分析纳入动物24只，均进入结果分析，无脱落。
2.2 血小板计数结果全血中，兔血小板计数值最大为290×109 L-1，最小为250×109 L-1，平均为270×109 L-1；PRP中，兔血小板计数值最大为1 330×109 L-1，最小为920×109 L-1，平均为1 070×109 L-1，为全血中的4倍。
2.3 兔骨组织大体观察术后2周：两组材料骨缺损修复区外形保持完好，无明显溶解吸收现象，材料固位良好，实验组材料区略显暗红色，肉眼可见较多类似纤维组织，对照组表面材料仍为材料颜色。术后4周：材料固位良好，两组材料表面颜色均变为暗红色，硬度有所增加，对照组材料边界较清晰，实

验组材料与骨边界不清。术后8周：两组移植材料均与周围正常骨结合紧密，硬度增加，表面为部分新生骨覆盖，实验组较对照组表面新生骨较多。术后12周：两组动物骨缺损区均已愈合，与正常骨组织无明显区别，缺损区生长的骨组织与两端正常骨组织牢固结合，材料硬度、颜色接近正常骨。对照组与实验组相比，骨缺损区中央略有凹陷，骨质与周围正常骨组织相比硬度稍差。
2.4 兔骨组织X射线观察结果术后2周：两组均见移植材料与宿主骨界限清晰。实验组材料区与宿主骨交界处有少量模糊云雾状致密影。术后4周：两组均可见移植材料区密度减低，材料区与宿主骨界线较前模糊。实验组材料区呈现云雾状致密影，部分区域可见带状或不规则成岛状分布的较高密度影；对照组材料区与骨界限较实验组明显，材料区致密影较稀疏，材料区中央可见低密度影。术后8周：两组均见移植材料区大片较高密度影，材料与骨界线较模糊。实验组材料区呈现密度较高致密影，骨缺损中央及边缘区域出现片状骨痂影像，密度增高；对照组可见材料区与宿主骨界限较实验组明显，表现为集中在缺损边缘的骨痂影像，材料中央仍见较低密度影。术后12周：两组均见移植材料与骨融合成片，界线不清晰但密度较周围骨略低，实验组较对照组密度稍高。
2.5 兔骨组织学观察术后2周：实验组和对照组缺损区均可见内有大量纤维结缔组织增生，两组材料均有珊瑚材料脱钙后形成的空隙。实验组纤维组织较对照组粗大并密集，纤维组织中可见大量未分化间充质细胞和成纤维细胞，及少量成骨细胞，核大深染。材料与宿主骨交界面可见有较多的成骨细胞，其周围有较多新生骨质形成，并延伸进入材料区；对照组纤维组织较细较少，细胞增生现象不如实验组明显，材料与宿主骨交界面也可见新生骨质形成，但较实验组少。见图1。

术后4周：实验组和对照组珊瑚颗粒形成的间隙均变小。实验组材料区纤维组织内可见大量成骨细胞，并可见大量类骨质生成，染色较正常骨为浅，形成小块状或条索状；对照组材料间隙仍见大量纤维组织，也出现较多成骨细胞，但纤维组织成骨现象不明显。见图2。

术后8周：对照组和实验组珊瑚材料形成的空隙已经较小，说明珊瑚已基本吸收。实验组材料区纤维组织内可见较多新骨形成，呈大块条索状或片状，并与宿主骨长入的骨组织融合成片，新生骨小梁周围可见大量成骨细胞呈单层紧密排列在表面；对照组材料区仍以纤维组织为主，少量片状或条索状新骨形成，纤维结缔组织内可见散在成骨细胞。见图3。术后12周：两组植骨床均见到成熟的大片骨组织，出现皮质骨和骨髓腔，已分化成致密的皮质骨和骨髓腔，实验组与对照组组织学情况相同。

2.6 可能影响结果的因素分析对血液样本手工血小板计数可能会产生误差，造成实验结果的偏倚。

3 讨论

将生长因子用于骨缺损的修复是目前研究的一个热点。近年来，PRP引起学者的注意。PRP是通过离心自体全血而得到的血小板浓缩物。由于血小板可释放多种生长因子，因而研究者认为PRP可作为生长因子的来源，并认为在安全性和制备方法上比外源性生长因子更具优点。近年一些研究将PRP应用于骨缺损的修复，取得了一些肯定的结果[1-5]。但对于PRP促进骨缺损修复的机制，目前尚未完全阐明。普遍认为PRP中多种生长因子的联合作用刺激成骨，加速了骨修复[6-9]。PRP中含有的生长因子包括血小板衍生生长因子、转化生长因子β、血小板衍生表皮生长因子等[10-13]，对骨组织的再生和修复都有促进作用。
本实验将滨珊瑚与PRP制成复合物修复兔下颌骨缺损，并与珊瑚与PPP复合做对照，观察修复效果，试图进一步验证PRP对骨缺损修复的作用，并寻找一种合适的复合材料用于修复下颌骨的缺损，为临床提供参考。
实验中采用了兔的下颌骨缺损模型作为观察对象，制备方法符合陈系古等[14]提出的制备要求。文献报道在对兔下颌骨缺损造模时，一般采用以下方法：在下颌骨下缘截骨[15]，在下颌体造成洞穿缺损[16]，在下颌骨体造成洞型缺损或非洞穿缺损。本实验采用的造模方法和刘星纲等采用的方法一致[17-18]。
组织学观察显示，术后2周，实验组出现大量前成骨细胞和成骨细胞，反映了PRP对细胞增生、分化及对新骨形成具有明显的促进作用，PRP趋使骨原细胞和成骨细胞增殖并迁移进入骨移植材料中，并诱导各种骨原细胞向成骨细胞分化。术后4周，实验组出现大量成骨细胞及较多类骨质形成，术后8周，实验组见大量片状新生骨形成。证实早期在材料区聚集的未分化细胞已大量向成骨细胞转化且成骨活跃。这一点提示，PRP的植入持续保持了促成骨效应。正常情况下，血小板及其释放的生长因子的作用时间短暂[19]。因此PRP与滨珊瑚制成的复合材料起到了生长因子缓释载体的作用。PRP凝胶的缓释作用已得到证实[9]。而珊瑚的缓释作用体现在其高孔隙的疏松结构能起到非常好的延展PRP凝胶的作用，研究已证实PRP血块收缩对生长因子加速释放的作用，减少PRP凝胶的收缩能起到缓释生长因子的作用[20]。
另外，PRP中多种生长因子可能产生了协同效果，对成骨起着更佳的调控作用。生长因子的协同作用效果已有报道[21-22]。但对于PRP中不同生长因子之间相互影响和调节的机制，研究还很少，这一点需要进一步研究论证。
实验中，滨珊瑚与PRP的复合，同时利用了珊瑚的骨引导性和PRP的骨诱导性，加速了骨缺损的修复，各项观察均发现实验组在新骨形成速度方面有明显优势，证实复合材料取得了满意的效果。

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