新型生物复合材料聚乙烯醇/纳米羟基磷灰石+聚酰胺66修复关节软骨及软骨下骨缺损☆

郭涛1，杨天府2，肖杰1，龙浩1，陈艺新1，裴福兴2，李玉宝3

课题背景：聚乙烯醇是由聚醋酸乙烯酯水解而成的一种水溶性聚合物，目前普遍被认为是良好的关节软骨替代材料。具有骨传导特性的纳米羟基磷灰石与有机质高分子聚酰胺66进行共溶而制成的高分子聚合物，是具有中国自主知识产权和国际领先水平的新型纳米粒晶的骨修复替代材料。实验旨在探讨新型生物复合材料聚乙烯醇/纳米羟基磷灰石+聚酰胺66修复关节软骨及软骨下骨缺损的效果。

应用要点：①聚乙烯醇/纳米羟基磷灰石+聚酰胺66生物复合材料在修复关节软骨及软骨下骨缺损时，与周边关节软骨相容性好，周边软骨未见退行性变，Ⅱ型胶原分泌正常，表现出了良好的生物相容性。②聚乙烯醇/纳米羟基磷灰石+聚酰胺66复合材料植入动物体内后，随着周边软骨下骨成分逐渐向下层材料长入，形成牢固的生物自锁固定，对上层材料起到了良好的支撑作用，同时也解决了材料的远期稳定性问题。

同行评价：人工软骨作为替代材料应用于关节软骨缺损的修复目前在临床上仍存在不能高质量地修复关节软骨缺损并达到很好的远期疗效。实验将具有良好的生物力学性能的聚乙烯醇水凝胶、具有骨传导特性的纳米级羟基磷灰石以及具有高强度、高韧性和良好稳定性的聚酰胺66材料复合，形成新型人工骨仿生材料并植入动物体内，考察了复合材料植入兔膝关节后动物的生物学行为及关节腔内的变化，以及关节局部组织形态学变化和材料植入动物体内后的稳定性，得到了很有意义的结果。

1贵阳市第四人民医院骨科，贵州省贵阳市 550002； 2四川大学华西医院骨科，四川省成都市 610041；3四川大学纳米分析测试中心，四川省成都市 610041

郭涛☆，男，1971年生，湖北省老河口市人，汉族，2007年四川大学华西临床医学院毕业，博士，副主任医师，主要从事骨损伤修复及组织工程的研究。
guotao04b@sina.com

背景：聚乙烯醇(Polyvinyl alcohol hydrogel，PVA)水凝胶目前普遍被认为是关节软骨良好的替代材料，纳米羟基磷灰石(nano-hydroapatite，n-HA)修复骨缺损已取得公认，聚酰胺66(PA66)是一种具有高强度、高韧性和良好稳定性的聚合物，在工程和医学领域已获得广泛应用。
目的：实验仿照关节软骨理化特性，制备新型生物复合材料PVA/n-HA+PA66，观察新型生物复合材料PVA/n-HA+PA66修复兔关节软骨及软骨下骨缺损的效果。
设计、时间及地点：随机分组设计的动物对照实验，于2006-07/2007-07在四川大学华西医院骨科组织工程实验室完成。
材料：成年健康新西兰大白兔72只，在兔股骨关节面上打孔（5 mm×5 mm×5 mm）制备兔关节软骨及软骨下骨缺损模型。PVA/n-HA+PA66生物复合材料由四川大学纳米分析测试中心提供，规格：直径5 mm，高5 mm，圆柱体，上层PVA高度为1.5 mm，乳白色，光滑，质韧，下层n-HA+PA66表面粗糙，质硬，高度为3.5 mm。PVA为多孔网状结构，孔径为5~40 μm，孔隙率为75.3%，含水率为71.6%，n-HA+PA66为多孔网状结构，孔径100~400 μm，孔隙率61.7%。
方法：72只模型兔按随机数字表法分为3组，PVA/n-HA+PA66植入组、单纯PVA植入组、空白对照组，每组24只。PVA/n-HA＋PA66植入组在兔关节软骨及软骨下骨缺损处植入PVA/n-HA＋PA66材料，单纯PVA植入组在缺损处植入PVA材料、空白对照组不做任何处理。
主要观察指标：植入4，8，12，24周后观察兔行为形态、兔膝关节局部组织形态学变化，免疫组织化学染色检测Ⅱ型胶原，扫描电镜观察生物材料与周边软骨及软骨下骨连接界面的反应。
结果：72只兔全部进入结果分析。①术后大体形态观察伤口无感染，关节活动度好。②植入后24周，PVA/n-HA+PA66植入组下层材料与周边组织融为一体，周边软骨未见明显退行性变；单纯PVA植入组PVA与部分周边软骨间隙加大，周边软骨部分退行性变；空白对照组缺损部位大部分已钙化。③植入后24周，PVA/n-HA+PA66植入组PVA周边软骨Ⅱ型胶原阳性染色，PVA边缘及表面Ⅱ型胶原阳性染色增多；单纯PVA植入组PVA与周边组织间隙中Ⅱ型胶原阳性染色有少量增加，PVA表面阳性染色减弱，周边软骨阳性染色减弱；空白对照组缺损处表面组织中Ⅱ型胶原染色减低，周边关节软骨染色减低。④植入后24周，扫描电镜见PVA/n-HA+PA66植入组下层材料网孔中充满大量类骨质成分，上层材料PVA与下层材料嵌合紧密；单纯PVA植入组材料周边骨质有部分退缩，间隙加大；空白对照组缺损处下部由骨质充填，上部为纤维瘢痕样组织，组织结构排列紊乱。
结论: 双相生物复合材料PVA/n-HA+PA66具有良好的组织相容性及良好的替代关节软骨及软骨下骨的功能。
关键词:生物复合材料；关节软骨；软骨下骨；修复

郭涛，杨天府，肖杰，龙浩，陈艺新，裴福兴，李玉宝.新型生物复合材料聚乙烯醇/纳米羟基磷灰石+聚酰胺66修复关节软骨及软骨下骨缺损[J].中国组织工程研究与临床康复，2008，12(14):2623-2627
[www.zglckf.com/zglckf/ejournal/upfiles/08-14/14k-2623(ps).pdf]

Repair of articular cartilage and subchondral defects with a new type biological composite material polyvinyl alcohol/nano-hydroxyapatite and polyamide 66

BACKGROUND:Polyvinyl alcohol (PVA) hydrogel has been generally considered as a good substitute material of articular cartilage, nano-hydroxyapatite (n-HA) is widely used to repair bone defect, and polyamide 66 (PA66) polymer has achieved an extensive application in the fields of engineering and medicine owing to its high intensity, strong tenacity and good stability.
OBJECTIVE: Based on physico-chemical characteristics of articular cartilage, this study is designed to prepare a new type of biomaterial composite PVA/n-HA+PA66 and observe the repair of articular cartilage and subchondral defects in rabbit knee joints with PVA/n-HA+PA66.
DESIGN, TIME AND SETTING: The animal controlled experiment was performed according to random grouping in Tissue Engineering Laboratory, Department Orthopedics, West China Hospital, Sichuan University from July 2006 to July 2007.
MATERIALS: Seventy-two healthy adult New Zealand rabbits were used for the models of articular cartilage and subchondral defects by perforating (5 mm×5 mm×5 mm) on the femoral bone joint. PVA/n-HA+PA66 was offered by the Analytical and Testing Center of Sichuan University, its specification was cylinder, diameter 5 mm, height 5 mm; upper layer (PVA) height 1.5 mm, ivory, smooth and tenacious; lower layer (n-HA+PA66) height 3.5 mm, rough and stiff. PVA was porous network, with pore diameter 5-40 μm, porosity 75.3% and water ratio 71.6%; n-HA+PA66 was also porous, with pore diameter 100-400 μm and porosity 61.7%.
METHODS: Seventy-two rabbit models were at random divided into 3 groups (n=24): PVA/n-HA+PA66 implant group, PVA implant group, and control group. Materials were implanted into articular cartilage and subchondral defects in rabbits, while no treatment was given in the control group.
MAIN OUTCOME MEASURES: The macroscopic and histological evaluations of rabbit knee joints were performed at 4, 8, 12 and 24 weeks postoperatively. Ⅱ collagen was measured by immunohistochemical dyeing. The interfaces of biomaterial implants with articular cartilage and subchondral bone were observed by scanning electron microscope.
RESULTS: All 72 rabbits were involved in the result analysis.①No infection was observed in all animals with good motion of joints.②At 24 weeks postoperatively, the lower layer materials of PVA/n-HA+PA66 got well with surrounding cartilage, which did not degenerate obviously; In PVA implant group, the gap was enlarged between PVA and partly of surrounding cartilage, which did degenerate; Most of the defects had been calcified in the control group.③At 24 weeks postoperatively,Ⅱ collagen immunohistochemical dyeing were positive in gaps between PVA and surrounding cartilage, and in PVA surface; In PVA implant group, positive dyeing was a little increased in gaps between PVA and surrounding cartilage, but weakened in PVA surface and surrounding cartilage; Reduced dyeing was observed in both the defect surface and surrounding cartilage in the control group.④At 24 weeks postoperatively, lower layer materials of PVA/n-HA+PA66 were full of bone tissues under scanning electron microscope, and were closely connected with upper layer material PVA; In PVA implant group, bone tissue around the materials receded, and the gap became bigger; The interior defects in the control group were filled with bone tissues, while superior defects with fibrous scar-like tissues that arranged in disorder.
CONCLUSION: The diphase biological composite materials PVA/n-HA+PA66 have good function for replacing articular cartilage and subchondral, with good biocompatibility.

Guo T, Yang TF, Xiao J, Long H, Chen YX, Pei FX, Li YB.Repair of articular cartilage and subchondral defects with a new type biological composite material polyvinyl alcohol/nano-hydroxyapatite and polyamide 66.Zhongguo Zuzhi Gongcheng Yanjiu yu Linchuang Kangfu 2008;12(14):2623-2627 [www.zglckf.com/zglckf/ejournal/upfiles/08-14/14k-2623(ps).pdf]

软骨及软骨下骨损伤或缺损后自身修复能力有限, 常导致关节功能障碍[1-2]。聚乙烯醇(Polyvinyl alcohol hydrogel， PVA)水凝胶目前普遍被认为是关节软骨良好的替代材料[3]，纳米级羟基磷灰石晶体（nano- hydroxyapatite，n-HA）与高分子聚酰胺66（polyamide66，PA66）材料复合，可形成新型人工骨仿生材料（n-HA/PA66）[4]。本实验将PVA与n-HA+PA66有机地结合起来,制备成PVA/n-HA+PA66一体化材料，探讨新型生物复合材料PVA/n-HA+PA66修复关节软骨及软骨下骨缺损的效果。

设计: 随机分组设计、对照动物实验。
单位: 四川大学华西医院骨科。
材料: 实验于2006-07/2007-07在四川大学华西医院骨科组织工程实验室完成。选择成年健康新西兰大白兔72只，雌雄各半，兔龄5~8个月，体质量160~240 g，平均182 g，由四川大学实验动物中心提供（许可证号SCXK(川)2004-14）。将新西兰大白兔按随机数字表法分为3组，PVA/n-HA+PA66植入组、单纯PVA植入组、空白对照组，每组24只。①PVA/n-HA+PA66生物复合材料：由四川大学纳米分析测试中心提供，规格：直径5 mm，高5 mm，圆柱体，上层PVA高度为1.5 mm，乳白色，光滑，质韧，下层n-HA+PA66表面粗糙，质硬，高度为 3.5 mm，见图1。PVA为多孔网状结构，孔径为5~40 μm，孔隙率为75.3%，含水率为71.6%，n-HA+PA66为多孔网状结构，孔径100~400 μm，孔隙率61.7%。②单纯PVA上层材料：规格直径5 mm，高5 mm。
设计、实施、评估者: 设计为第一作者, 实施为全部作者, 评估为第一作者, 评估者经过正规培训。
技术路线：
动物实验：30 g/L戊巴比妥行腹腔麻醉后，消毒，铺巾，经髌旁内侧入路手术暴露髌股关节面，在股骨关节面上打孔，直径5 mm，深度5 mm，包括关节表面软骨和软骨下骨，制成关节软骨缺损的模型。植入双相生物材料，用嵌入器轻轻打压，以维持早期的植入物稳定性。对侧肢体打孔直径5 mm，深度5 mm，作空白对照组或植入单纯PVA，缝合伤口，所有术肢不予固定, 任其自由活动。

大体形态观察:术后观察动物饮食，活动，伤口，关节活动度，死亡情况。分别于术后第4，8，12，24周麻醉后处死动物，打开关节腔，观察周边软骨，对侧关节面，滑膜，材料稳定性。
组织形态学观察: 分别于术后第4，8，12，24周各处死18只动物，取出股骨髁标本，以移植材料为中心，截取长度约为1 cm大小标本，标本经40 g/L多聚甲醛固定后，用质量分数为0.1的EDTA脱钙，常规脱水，包埋，石蜡切片厚度为5 μm，行苏木精-伊红、Masson及甲苯胺蓝染色，显微镜下观察材料周边组织变化。
Ⅱ型胶原免疫组化检测: 术后8，12，24周标本经固定、脱钙、脱水、包埋后，制成厚度5 μm的石蜡切片。行常规Ⅱ型胶原免疫组织化学检测，倒置显微镜下观察Ⅱ型胶原免疫组织化学染色情况。
扫描电镜观察:取术后12，24周标本，修整成0.5 cm× 0.5 cm×0.5 cm大小样本，2.5%戊二醛（pH 7.2~7.4）固定，乙醇梯度脱水，喷金，用扫描电镜观察材料表面，材料与周边软骨及软骨下骨连接界面的情况。
主要观察指标: ①生物材料植入兔膝关节后动物的生物学行为及关节腔内变化。②生物材料植入兔膝关节后局部组织形态学变化。③生物材料植入兔膝关节后关节软骨Ⅱ型胶原免疫组化检测。④扫描电镜观察生物材料与周边软骨及软骨下骨连接界面的情况。

2.1 实验动物数量分析实验选取新西兰大白兔72只, 均进入结果分析，无脱落。
2.2 动物的生物学行为观察术后所有动物均未死亡，伤口无感染，无分泌物，PVA/n-HA+PA66植入组和单纯PVA植入组关节活动度好，有2只空白对照组动物膝关节活动减少，第8周出现膝关节僵硬、强直。
2.3 动物膝关节腔内变化 PVA/n-HA+PA66植入组：关节面平滑、光整，4周时材料周边间隙被纤维组织填塞，材料牢固，不能拔出，8，12，24周后材料周边间隙消失，关节活动良好，周边软骨无明显退行性变，材料与周边软骨及软骨下骨牢固结合。对侧关节面光滑，无磨损。滑膜无增生肥厚。见图2。单纯PVA植入组：4周时材料表面平整、光滑，材料固定不牢固，易脱出。8，12周时部分材料下陷，下陷2.0~3.0 mm，24周时材料周边有少部分软骨出现退行性变（颜色变白，表层剥脱），材料固定不牢固。空白对照组：4周有纤维肉芽组织填充空洞，逐渐接近关节表面，8，12周，钻孔处形成亮白色纤维样软骨，表面不平整，24周钻孔表面纤维样组织变硬，凹凸不平，周边关节软骨退行性变，关节滑膜有不同程度增生、水肿、肥厚。有2例形成严重创伤性关节炎，关节粘连、僵硬、强直。

2.4 组织形态学观察 PVA/n-HA+PA66植入组：4周时，植入材料与周边组织间隙中有纤维组织充填，有少量炎性细胞浸润，嵌合牢固，有纤维组织长入n-HA+PA66材料网孔中；8，12周时下层n-HA+PA66材料网孔中有大量纤维组织长入，出现部分胶原成分，并已形成类骨质成分。上层PVA材料与周边软骨间隙消失，有部分关节软骨朝向PVA材料表面爬行生长。24周时，下层材料与周边组织融为一体，网孔中有大量类骨质，相互连接成网状板层，上层PVA未见磨损，周边软骨排列规则整齐，未见明显退行性变,并有部分关节软骨样成分覆盖PVA表面。见图3。单纯PVA植入组：4周时，材料与周边软骨下骨间隙中有多量炎性细胞浸润,部分纤维组织增生。8，12周时，PVA材料部分下陷，周边间隙由纤维组织填充，但材料极不稳固，易脱落，关节软骨邻近材料部位边缘变钝，有轻度退行性变。24周时PVA与部分周边软骨间隙加大，材料不稳定，周边软骨部分变薄，回缩、退行性变。空白对照组：4周时缺损处有纤维肉芽组织从基底部向上填充，有大量成纤维细胞及炎性细胞。8，12周时，关节缺损处纤维肉芽组织发生部分钙化，缺陷处由纤维肉芽组织逐渐填平，但表面凹凸不平，24周时，缺损部位下部大部分已钙化，形成骨小梁及类骨质结构，上层纤维成分多，且组织排列紊乱，不规则，主要为纤维软骨成分，未形成透明软骨，周边软骨变薄，出现剥脱。

2.5 Ⅱ型胶原免疫组织化学检测结果 PVA/n-HA+PA66植入组：12周时，PVA与周边关节软骨间隙中有阳性染色，呈棕黄色，在PVA表面有阳性染色出现，表明有胶原在PVA表面生成，周边软骨染色明显，呈强阳性。24周时，周边软骨Ⅱ型胶原阳性染色未见减弱，PVA边缘及表面II型胶原阳性染色增多。见图4。单纯PVA植入组：12周时，PVA材料与周边组织间隙中Ⅱ型胶原出现少量阳性染色，阳性率低，在PVA表面有阳性染色出现，周边软骨阳性染色，24周时，PVA与周边组织间隙中Ⅱ型胶原阳性染色有少量增加，但PVA表面阳性染色减弱，周边软骨阳性染色减弱。空白对照组：12周时，缺损处表面组织中有少量Ⅱ型胶原形成，呈弱阳性染色，周边关节软骨阳性染色，24周时，缺损处表面组织中Ⅱ型胶原染色减低，周边关节软骨染色减低。

2.6 扫描电镜观察 PVA/n-HA+PA66植入组：12周时，可见下层材料n-HA+PA66网孔中有大量成骨细胞及类骨质形成，类骨质排列为条状，材料与周边组织间隙中充满成骨细胞及胶原成分；PVA下层材料周边有部分纤维组织并钙化。24周时，下层材料网孔中充满大量类骨质成分，网孔与周边组织贯通，并紧密相连，上层材料PVA与下层材料嵌合紧密。见图5。单纯PVA植入组：12周时，PVA材料与周边组织无连接，界限清楚，PVA上层有部分纤维条索组织覆盖，24周时周边骨质有部分退缩，间隙加大。空白对照组：12周时，缺损处下部由骨质充填，形成软硬的骨质成分，表面为一层纤维组织覆盖，24周时缺损处下部由骨质充填，上部为纤维瘢痕样组织，组织结构排列紊乱。

近年来随着组织工程学技术的发展, 关节软骨缺损的修复取得了一定的进展,但目前在临床上仍不能高质量地修复关节软骨缺损并达到很好的远期疗效[5-6]。目前治疗晚期骨关节病所采用的人工关节置换材料多为金属、陶瓷、超高分子量聚乙烯等硬质材料, 由于磨损、松动等原因而导致的术后并发症日益引起人们的重视，一部分学者开始把目光投向人工软骨替代材料[7]。
3.1 PVA/n-HA+PA66复合材料的组织相容性 PVA水凝胶在物理性质方面比其他任何人工合成材料更像活体组织, 首先其扩展特性和对水分子等的透过性使得生物相容性优良[8]；其次其良好的柔韧性和高弹性能够减少对周围细胞和组织的机械刺激；另外PVA具有良好的生物力学性能, 与软骨弹性模量相似，且表面摩擦系数小。因此, PVA水凝胶目前普遍被认为是关节软骨良好的替代材料[9-11]。PVA水凝胶弹性体具有与人关节软骨相似的力学性能[12-13],其压缩强度> 3 MPa,压缩弹性模量 < 15 MPa,摩擦系数0.05,磨损系数< 5×10-2 mm/（N·m）；人关节软骨压缩强度4 MPa, 压缩弹性模量为14.4 MPa,摩擦系数0.001,磨损系数< 5×10-2 mm/（N·m）,PVA水凝胶的含水率为也接近于人关节软骨的75%。
以具有骨传导特性的HA修复骨缺损已取得公认, n-HA粒子比普通的HA具有更优良的理化性能[14-15]。PA66是一种具有高强度、高韧性和良好稳定性的聚合物 [4]。本实验仿照人骨组织的无机和有机成分，将n-HA与PA66材料复合，形成新型人工骨仿生材料(n-HA/PA66)，将n-HA材料的高强度与PA66的良好韧性相结合，使其结构和性能较更接近天然骨[16-17]。
PVA上层材料具有和人体关节软骨相似的生物力学性质和良好的生物相容性。国内学者对PVA进行了细胞毒性实验、安全性研究、排泄研究。研究表明PVA材料不引起溶血，无皮肤刺激，不引起过敏反应。本实验表明，PVA与周边关节软骨相容性好，PVA植入后，周边软骨未见退行性变，Ⅱ型胶原分泌正常，软骨细胞排列整齐。第4周后，周边软骨有部分软骨细胞向PVA表面生长爬行，并填充了PVA与周边软骨的间隙，第24周时，PVA周边软骨生长良好，未见明显退行性变现象，PVA表面及边缘有Ⅱ型胶原阳性染色，表明有软骨生长迹象,这充分说明PVA与周边软骨具有良好的生物相容性。
3.2 PVA/ n-HA+PA66复合材料植入后的稳定性正常关节软骨下方的软骨下骨和松质骨对保护关节软骨避免高应力损伤起重要作用。Brittberg等[18]指出由于软骨缺损常深达软骨下骨, 使它的正常结构受到破坏, 导致力学性能的改变, 最终使修复组织早期愈合率降低并出现退行性变。因此作为替代关节软骨的PVA水凝胶必须有良好的软骨下骨和松质骨的支撑。
然而PVA水凝胶与底层骨的连接一直是较难解决的问题之一。顾正秋等[19]利用机械-化学连接方法探讨了PVA水凝胶与金属(底层骨)的牢固连接。Oka[20]报道用钛金属网固定法将PVA-H移植于软骨缺损部位，并经钛网微孔长入固定，都取得了一定的效果，但其远期的生物力学性能变化还有待于进一步研究。
本实验将PVA与n-HA+PA66有机地结合起来。制备成PVA/n-HA+PA66一体化材料，上层PVA可以发挥替代关节软骨的作用，下层n-HA+PA66可以发挥替代软骨下骨的作用，同时由于下层材料n-HA+PA66为三维多孔网状结构，其网孔直径为100~400 μm，可适合纤维组织、骨组织长入，形成牢固的生物自锁固定，有效地防止植入体随时间推移而发生移动错位。
本实验证明， PVA/n-HA+PA66复合材料植入动物体内后，早期通过嵌压固定获得材料的即时稳定性，随着周边软骨下骨成分逐渐向下层材料长入，整个复合材料与周边组织连为一体，形成了牢固的软骨下骨支撑作用。第4周时，材料下部已与周边组织初步连接，材料不易拔出，第8周以后，材料下部n-HA+PA66已与周边组织基本连为一体，网孔内有大量纤维组织及类骨质形成，周边间隙消失，由逐渐钙化的骨组织填充，对上层材料起到了良好的支撑作用,同时也解决了材料的远期稳定性问题,使PVA能够有效的发挥替代关节软骨的作用。
总之，PVA/ n-HA+PA66生物复合材料在修复关节软骨及软骨下骨缺损时，表现出了良好的生物相容性，材料植入机体后可能重建平滑的软骨面，减轻磨损，部分替代关节软骨，延缓或防止骨关节炎的发生，为关节软骨的修复提供一种可供选择的替代材料。但PVA材料应用的长期磨损问题有待进一步研究。

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