浙江省医学科学院生物工程研究所，浙江省杭州市 310013

蒋玉燕，女，l954年生，浙江省宁波市人，汉族，l988年杭州大学毕业，副研究员，主要从事病原生物学的研究。
jiang-yuyan@163.com

浙江省科技厅重点计划资助项目（2006F12037）*；浙江省科技厅重大计划资助项目（2005F1101）*

摘要：实验于2006-07/2007-06在浙江省医学科学院生物工程研究所完成。壳聚糖（脱乙酰度为87.85%，黏度为195 mPa·s，水分7.13%，灰分0.82%，批号：050621160）由浙江金壳生物化学有限公司提供。运用化学酸解、60Co γ射线辐照、高压、超声波及稳定剂等综合理化手段制备壳聚糖纳米粒子。透射电镜观察制备的壳聚糖纳米粒子为类圆球形；激光动态光散射仪检测壳聚糖纳米粒子平均粒径25.3 nm，占总粒子数99.1%，粒径分布图形较窄，表明颗粒大小均匀。实验结果表明运用以60Co γ射线辐照为主要手段进行壳聚糖纳米混悬剂的制备，是一种简便、快速、无污染、重复性好的方法，具备可行性。
关键词：壳聚糖；纳米粒子；制备；表征

蒋玉燕，毕忆群，房国坚，蒋建国.壳聚糖纳米混悬剂的研制和表征[J].中国组织工程研究与临床康复，2008，12(14):2628-2630 [www.zglckf.com/zglckf/ejournal/upfiles/08-14/14k-2628(ps).pdf]

中图分类号:R318
文献标识码:B
文章编号:1673-8225
(2008)14-02628-04

收稿日期：2008-01-18 修回日期：2008-03-21 (08-50-1-494/WL·Y)

Preparation and characteristics of chitosan nanosuspensions

Abstract:The experiment was performed in the Institute of Bioengineering, Zhejiang Academy of Medical Sciences from July 2006 to June 2007. Chitosan (87.85% deacetylation degree, 195 mPa·s viscosity, 7.13 % moisture content, 0.82% ash content, and batch number 050621160) was offered by Zhejiang Golden-shell Biochemical Co.,Ltd. Chitosan nanoparticles were produced by means of physico-chemical methods, such as chemical acidolysis, 60Co γradiation, autoclave, ultrasonic wave and stabilizing agent. Transmission electron microscopy revealed that chitosan nanoparticles were sphere, and laser dynamic light scattering instrument showed that the average diameter of the prepared nanoparticles was 25.3 nm, accounting for 99.1% of the total particles, and narrow distribution indicated consistent size of the particles. It is feasible to prepare chitosan nanosuspensions by the primary method of 60Co γradiation, which is convenient, fast, pollution-free, and reproducible.

Jiang YY, Bi YQ, Fang GJ, Jiang JG.Preparation and characteristics of chitosan nanosuspensions.Zhongguo Zuzhi Gongcheng Yanjiu yu Linchuang Kangfu 2008;12(14):2628-2630 [www.zglckf.com/zglckf/ejournal/upfiles/08-14/14k-2628(ps).pdf]

0 引言

壳聚糖是一种天然的高分子多糖，系甲壳素脱乙酰化产物，在自然界储量非常丰富，是仅次于纤维素的第二大可再生的天然资源，也是迄今为止发现的惟一天然碱性多糖。其来源丰富，广泛存在于虾、蟹和昆虫外壳及藻类、菌类细胞壁中，据推测目前地球上年产量约为(0.1~1.0)×1011吨。壳聚糖是分子链由β- (1-4)-2-乙酰胺基-D-葡糖单元和β- (1-4)-2-氨基-D-葡糖单元组成的共聚物，以相对分子质量和脱乙酰化度来表征。作为一种生物相容性好、可降解、安全性高的天然高分子材料，目前已在工业、农业、医药、环保等领域得以广泛研究和应用，在生物医学方面也显示诸多功效和活性，如抗菌、促免疫、降血脂、促伤口愈合等[1-4]，壳聚糖虽然具有独特的理化特性及生物学功效，但由于其相对分子量大、水溶性差，应用领域和生物利用度受到限制，因此开展壳聚糖纳米材料的相关研究，是医药领域的研究热点和重点[5-9]。
纳米材料是纳米科技的基础，功能纳米材料是纳米材料科学中最富有活力的领域，它对生物、信息、能源、环境、宇航等高科技领域将产生深远的影响。开展壳聚糖纳米材料的研究与制备，可在医药领域中展示广阔的应用前景。如药物的载体，增加药物的生物利用度，降低药物的毒、副作用，提高药物稳定性，增强药物的缓释、控释等作用[9-12]。并可以此为技术平台，负载某些免疫蛋白、抗肿瘤蛋白等进行肿瘤预防、免疫调节、环境去突变剂等多领域研究和开发，对推动甲壳素资源开发和再利用起到积极作用。
本文主要以60Co γ射线辐照为手段，结合化学酸解、高压、超声波及稳定剂等综合理化手段制备了壳聚糖纳米粒子，并应用透射电镜和激光动态光散射仪表征纳米颗粒的形态、大小及分布。现将研究结果报告如下。

1 材料和方法

设计：重复测量观察。
单位：浙江省医学科学院生物工程研究所。
材料：实验于2006-07/2007-06在浙江省


医学科学院生物工程研究所完成。壳聚糖（浙江金壳生物化学有限公司提供），脱乙酰度为87.85%，黏度为 195 mPa·s，水分7.13%，灰分0.82%，批号：050621160。
仪器：JZ-HS超速离心机（BEDKMAN公司）；Jy92-Ⅱ超声波细胞粉碎机（上海新芝生物技术研究所生产）；H-600A透射电镜(日本日立公司)；动态光散射仪(Zetasizer3000HS)，浙江大学中心实验室提供等。
设计、实施、评估者：实验设计为第一作者，干预实施为全部作者，评估为第一、四作者。参与者均为专业技术人员，经过专业标准化培训，采用盲法评估。
方法：
壳聚糖纳米混悬剂的制备：取2.5 g 壳聚糖于 100 mL 1%醋酸溶液中，酸解至黏度约100 mPa·s，高温高压，60Co γ射线辐照（动态），辐照总剂量24 KGy，辐照时间36 h，然后进行中和至pH 6.5、梯度离心 （5 000，15 000 r/min，分别离心30 min）和超声 （600 W，超声3 s，间隔2 s，重复180次）等综合手段，制备壳聚糖纳米混悬剂，备用。
壳聚糖纳米颗粒分布及尺寸、形貌的表征：透射电镜观察法是一种颗粒观察的绝对方法，具有可靠性和直观性。首先将上述制备的壳聚糖纳米悬液滴在带有碳膜的电镜用铜网上，待悬液中载液挥发后，放入电镜观察台，在80 000倍下进行尺寸和形貌的表征，应用Image-proplus程序对拍摄的电镜照片进行粒径测量和统计学计算处理，获得粒径尺寸和形貌表征。同时将上述制备的壳聚糖纳米悬液对半稀释后，进行激光动态光散射仪（波长=633 nm，25 ℃）颗粒尺寸及分布的表征，验证两种方法的吻合性和评价方法的可靠性。
壳聚糖纳米颗粒稳定性实验：制备的壳聚糖纳米粒，在室温放置一定时间，观察粒径变化及分布，考核其稳定性。
主要观察指标：壳聚糖纳米粒粒径尺寸及分布。
统计学分析：由第四作者采用SPSS 13.0软件完成统计处理，P < 0.05为差异有显著性意义。

2 结果

2.1 透射电镜观察纳米颗粒形貌及尺寸表征 研究制备的壳聚糖纳米混悬剂，经80 000倍透射电镜观察，大小均匀，拍摄的实物底片应用Image-proplus程序处理，计算结果为：n=109，平均粒径=20.18 nm，s=1.23(n为颗粒样本数，s为标准差)，壳聚糖纳米粒径（95%可信限）=（20.18±1.96）×1.23 nm，上限为23.59 nm，下限为16.77 nm，形貌为类球型，见图1。

2.2 动态光散射仪测定纳米颗粒尺寸和分布的表征 经动态光散射仪分析测定，不同尺寸纳米混悬剂在颗粒总数中分布及所占体积情况见表1及图2。

表1说明制备的壳聚糖纳米粒，99.1%的颗粒粒径分布于19.9~31.5 nm 之间，平均粒径=25.3 nm，与透射电镜观察的绝对方法较吻合（平均粒径=20.18 nm），其余0.9%的颗粒粒径为99.6~198.7 nm。图2也表明，受检样品只有一个较窄的峰值，说明粒径分布均匀。

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2.3 壳聚糖纳米混悬剂稳定性阶段性比较(室温) 将制备的样品在室温条件下存放9个月，再进行动态光散射仪颗粒粒径大小及分布表征，见图3。分析放置前后的粒径分布图（图2和图3），峰图形状基本一致，未出现多个峰，从实测数据显示（见表2），粒径大小、数量亦接近，说明壳聚糖纳米混悬剂在室温条件存放近9个月基本是稳定的。

2.4 可能影响结果的因素分析 本实验主要以60Co γ射线辐照为主要手段进行壳聚糖纳米混悬剂的制备，因此影响结果的主要因素是掌控合适的辐照剂量，根据实验结果表明，壳聚糖浓度为2.5%时，γ射线辐照剂量以20~24 KGy（动态）为合适，大于或小于该剂量都会直接影响纳米混悬剂的颗粒大小。因此根据壳聚糖的黏度和浓度，设计合适的辐照剂量是实验的关键。

3 讨论

壳聚糖纳米技术的研究与应用，目前已引起国内外学者的高度重视，制备的方法有凝聚法、共价交联法、离子交联法及乳滴凝结法等，但以离子交联法为常规[13]。本实验探索主要以60Co γ射线幅照为主要手段，结合化学和超声等综合方法，制备了壳聚糖纳米颗粒，表征了其形貌、大小及分布状况。研究表明，壳聚糖纳米混悬剂颗粒呈类圆形球体，粒径分布较窄，大小均匀，99.1%的颗粒分布于19.9～31.5 nm之间，平均粒径为25.3 nm，尺寸进入纳米量级（<100 nm）。放置9个月后，分析粒径分布图，前后峰图形状基本一致，未出现多个峰，从实测数据显示，粒径大小亦接近，说明壳聚糖纳米混悬剂在室温条件存放近9个月基本是稳定的，下一步研究方向，对制备的壳聚糖纳米混悬剂进行体外阳性致癌诱变剂抗突变效应的研究。
γ射线是一种电磁波，一次作用就把它们全部或部分能量传递给介质中束缚电子，具有较强穿透性，对于壳聚糖来说，其γ射线辐射降解主要机制为[14]：溶液中羟基自由基，通过氢原子吸引，与壳聚糖分子反应在碳原子处形成自由基，从而使糖苷键断裂发生重排，生成低聚壳聚糖。Choi等[15]研究证实用不同剂量60Co γ射线辐照醋酸溶液壳聚糖，可得到壳聚糖低聚物。
透射电镜观察法是一种颗粒观察的绝对方法，具有可靠性和直观性，可形貌观察，但计算测定比较复杂。动态光散射仪方法简便，快速，可显示粒径分布图和表，人为误差小，数据覆盖面广，分析较全面。建议采用两种方法结合评价和表征纳米颗粒，即可形貌观察，又能颗粒大小的测定和分布表征。
研究表明，辐射降解成本低、反应易控、不使用有机溶剂、无污染、产品品质高，降解后能得到均一性较好的壳聚糖纳米颗粒，结果表明此方法可靠，具有重复性，建议多种方法联合使用，可缩短反应时间，提高效率，值得进一步应用研究。目前医药领域对壳聚糖纳米（纳米壳聚糖）的应用研究比较广泛，研究的方向有：药物载体，免疫佐剂等，发现其具有良好的生物相容性和生物可降解性，可提高药物的稳定性，改变给药途径，增加药物的吸收、提高生物利用度和降低药物的毒副作用等特点，并具有缓释、控释、靶向等作用，因此具有广阔的应用前景。

4 参考文献

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