亚甲蓝磁性明胶微球在外磁场作用下对家兔痛阈及体感诱发电位的影响☆

陶利军1，孙永海2，张宏2

课题背景：人们发现将化疗药物和磁性材料一起包封于载体材料中，进入体内后在外磁场作用下使微球聚集于病变部位，可提高靶区内的药物浓度，从而提高疗效，减少用药剂量，降低全身毒副作用。本文观察在外磁场作用下蛛网膜下腔注射自制的亚甲蓝磁性明胶微球对家兔痛阈及体感诱发电位的影响。

临床应用性：实验表明亚甲蓝磁性明胶微球在外磁场作用下可靶向阻滞脊髓背根神经节，提高家兔的痛阈并延长体感诱发电位，具有“感觉-运动”分离阻滞作用，是一种有效的长效靶向神经阻滞剂。

偏倚或不足：实验微球制剂系根据文献及药典自行制备，非行业标准品，属于探索性实验。

1内蒙古医学院附属医院麻醉科，内蒙古自治区呼和浩特市 010050；2中国人民解放军总医院麻醉科，北京市 100853

陶利军☆，男，1973年生，内蒙古自治区包头市，回族，2006年解放军军医进修学院毕业，博士，主治医师，主要从事疼痛机制与治疗的研究。
tlj0419@gmail. com

背景：靶向给药系统是一种安全高效的药物传递途径和技术，是一种新的制剂技术和工艺，这种制剂能将药品运送到靶器官或靶细胞，而正常部位几乎不受药物的影响。
目的：实验拟观察亚甲蓝磁性明胶微球在外磁场作用下对家兔痛阈及体感诱发电位的影响，探讨其对脊髓背根神经结靶向神经阻滞的可行性。
设计、时间及地点：随机对照动物实验，于2004-03/2005-04在解放军总医院实验动物中心完成。
材料：雄性新西兰兔24只，体质量2.3~2.8 kg；空白明胶微球（自制）；亚甲蓝磁性明胶微球（自制，载药量为9.8%）。微球系院内药理学实验室高级技师协助制备。
干预：24只家兔随机数字表法分为亚甲蓝磁性微球15 mg 组：在外磁场作用下家兔蛛网膜下腔注射亚甲蓝磁性明胶微球15 mg；空白磁性微球15 mg 组注射单纯磁性微球15 mg；假手术对照组：麻醉和手术步骤同其他组，每组8只。
主要观察指标：连续观察注射药物后家兔下肢的电痛阈、运动功能及脊髓体感诱发电位的变化，最后取脊髓腰骶端作病理切片观察。
结果：24只新西兰兔均进入结果分析。①亚甲蓝磁性微球15 mg 组家兔后肢电痛阈值在给药后第1~6天明显升高，与自身给药前及其他组相比，差异显著（P < 0.05）。②亚甲蓝磁性微球15 mg 组家兔体感诱发电位N1波潜伏期第1~11天明显延长，与自身给药前及其他组相比，差异显著（P < 0.05）；术后13 d 恢复正常。③病理观察显示各组脊髓背角结构、形态正常，神经轴索排列正常，灰白质界限清楚，除假手术对照组外其他组背角均有少数未完全降解的微球，各组的脊髓前角可观察到形态正常的前角运动神经细胞及神经轴索，结构完整。
结论：亚甲蓝磁性明胶微球在外磁场作用下可靶向阻滞脊髓背根神经结，提高家兔的痛阈并延长体感诱发电位，具有“感觉-运动”分离阻滞作用，是一种有效的长效靶向神经阻滞剂。
关键词：亚甲蓝；磁性微球；疼痛；诱发电位

陶利军，孙永海，张宏.亚甲蓝磁性明胶微球在外磁场作用下对家兔痛阈及体感诱发电位的影响[J].中国组织工程研究与临床康复，2008，12(14):2631-2634 [www.zglckf.com/zglckf/ejournal/upfiles/08-14/14k-2631(ps).pdf]

Influence of methylene blue magnetic gelatin microspheres under magnetic field on pain threshold and somatosensory evoked potential in rabbits

BACKGROUND: Targeting drug-delivery system is a safe and effective technique to transfer drug and it is a novel drug preparation technique. By this method, the drug can be delivered to targeted organs or cells but not affect normal sites.
OBJECTIVE: To observe the effect of methylene blue magnetic gelatin microspheres (MMGMs) on pain threshold and somatosensory evoked potential in rabbits, and to explore the feasibility of nerve blocking of dorsal root ganglia.
DESIGN, TIME AND SETTING: The randomized controlled animal trial was performed at the Experimental Animal Center of General Hospital of Chinese PLA between March 2004 to April 2005.
MATERIALS: Twenty-four male New Zealand rabbits weighing 2.3-2.8 kg were selected. Empty gelatin microspheres and MMGMs (9.8% of drug-delivery) were self-made assisted by the advanced technicians of Pharmacology Laboratory.
INTERVENTIONS: Twenty-four rabbits were randomly divided into 3 groups (n=8): MMGM group, which was injected with MMGMs (15 mg) in subarachnoid space under the effect of magnetic field; magnetic gelatin microspheres group, which was injected with gelatin microspheres (15 mg) in subarachnoid space; sham operation group (control group), which underwent the same anesthesia and surgery procedure.
MAIN OUTCOME MEASURES: The pain threshold of electronic stimulation, motor function of hind limbs and spinal cord evoked potentials were observed continuously after injection. The pathological section of dorsal root ganglia and Cornu anterius medullae spinalis were made and oberved.
RESULTS: Twenty-four rabbits were included in final analysis. ①The pain threshold of electronic stimulation of hind limbs of MMGMs group significantly increased from the first to sixth days after injection than other groups and before injection (P < 0.05). ②The latency period of N1 wave in spinal cord evoked potentials was significantly extended in MMGMs group compared with other groups and before injection (P < 0.05). The latency period restored to normal condition on postoperative day 13. ③The pathematology of dorsal root ganglia and Cornu anterius medullae spinalis in each group was morphological normal with normal arrangement of neuraxis and clear boundary between gray and white matters. Except for the sham operation group, there were few incompletely degraded microspheres in the dorsal root ganglia.
CONCLUSION: MMGMs play a role of "target nerve block" under the effect of magnetic field and can cause the prolongation of somatosensory evoked potential and dissociation of kineto-sensory function with obvious analgesic effect. So it can serve as a long lasting nerve-blocking drug for the relief of intractable pain.

Tao LJ, Sun YH, Zhang H.Influence of methylene blue magnetic gelatin microspheres under magnetic field on pain threshold and somatosensory evoked potential in rabbits.Zhongguo Zuzhi Gongcheng Yanjiu yu Linchuang Kangfu 2008;12(14):2631-2634
[www.zglckf.com/zglckf/ejournal/upfiles/08-14/14k-2631(ps).pdf]

磁性药物微球是一种较新的靶向制剂，它在足够强的外磁场作用下，能使其所含药物得以定位释放，达到高效、低毒的作用[1-5]。亚甲蓝（methylene blue）对神经组织可产生超长效阻滞作用，在临床用于疼痛治疗已有报道[6-7]。本文就在外磁场作用下蛛网膜下腔注射自制的亚甲蓝磁性明胶微球对家兔痛阈及体感诱发电位的影响进行探讨。

设计：随机对照动物实验。
时间及地点：实验于2004-03/2005-04在解放军总医院实验动物中心完成。
材料：雄性新西兰兔24只，体质量2.3~2.8 kg，由解放军总医院实验动物中心提供，(动物合格证号：SYXK(军2002-2004))。实验前将家兔置于20 ℃ 室温安静环境中，禁食水12 h。
空白明胶微球（自制）；亚甲蓝磁性明胶微球（自制，载药量为9.8%，具体制备方法及其特性参见文后参考文献[8]）。微球系院内药理学实验室高级技师协助制备。
主要试剂及仪器：Axon System Sentinel-4型中枢神经系统监护仪（美国）；聚乙烯醇（PVA-124，日本）。
方法：
干预分组：24只新西兰兔随机数字表法分为亚甲蓝磁性微球15 mg 组：在外磁场作用下家兔蛛网膜下腔注射亚甲蓝磁性明胶微球15 mg（含亚甲蓝1.47 mg）；空白磁性微球15 mg 组注射单纯磁性微球15 mg；假手术对照组：麻醉和手术步骤同其他组，每组8只。
蛛网膜下腔注射磁性微球药物：采用异丙酚复合氯胺酮静脉麻醉，无菌条件下背部L5~7间隙间正中切开，咬除第六腰椎脊突，钻孔暴露蛛网膜；以1%PVA溶液作为分散介质，假手术对照组注射相同容量的分散介质。L5~7背部中线皮下放置2.0 cm×4.0 cm、磁场强度 400 mT薄磁片并固定，然后逐层缝合，术后第1天开始测量后肢电痛阈值、运动功能及运动诱发电位。
痛阈及运动功能检测方法：①痛阈测定应用神经生理仪正负针电极刺激家兔后肢，设定电刺激频率为 400 Hz，刺激持续时间为10 s，从0 mA 开始逐步增加电流强度直到家兔出现后肢逃避或嘶叫为其痛阈值。②运动功能测定：针刺后肢下1/3外侧达骨膜，检查后肢运动功能，按Tarlov标准分为5级：0级：完全性瘫痪；1级：关节能轻微活动；2级：关节有明显活动但不能站立；3级：能站立与行走；4级：能奔走，运动功能正常。
脊髓体感诱发电位测定：用美国Axon System Sentinel-4型中枢神经系统监护仪，按国际10/20系统法安置银针电极，阻抗<2 kΩ，记录参数如下：刺激部位为左下肢胫后神经，刺激强度2.0~4.0 mA，刺激间隔0.2 ms，强度以能引起拇指、足趾跖曲1.0~2.0 cm 为宜；记录电极为2个，位于L7棘突水平居后正中线旁开1 cm，2个参考电极置于垂直记录电极上方第2个棘突水平，F7接地，带通1.0~100.0 Hz，分析时间200 ms，平均叠加次数50次，伪迹抑制电平25 μV，增益40 000。主要测量N1的潜伏期和波幅。
病理检查：术后30 d 用异丙酚＋氯胺酮腹腔注射麻醉动物，快速开胸经左心室插管至升主动脉，先快速灌注生理盐水800 mL，再灌注1 500 mL 含40 g/L 多聚甲醛的0.1 mol/L 磷酸缓冲液(pH=7.4)，时间约60 min。取L5~L7处脊髓，用体积分数为0.1的甲醛固定24~48 h，脱水、石蜡包埋。进行矢状切片，片厚5 μm，进行苏木精-伊红染色，对脊髓前后角进行显微镜观察。
主要观察指标：①后肢痛阈值。②脊髓体感诱发电位N1波潜伏期。③脊髓病理改变。
设计、实施、评估者：实验设计为第一、二、三作者，干预实施为第一、二作者，评估为第一作者。经过正规培训，未采用盲法评估。
统计学分析：由第一、二作者采用SPSS 10.0软件进行单因素方差分析和t检验，实验数据以_x±s表示，P < 0.05为差异有显著性意义。

2.1 实验动物数量分析纳入新西兰兔24只，均进入结果分析，无脱落。
2.2 各组家兔左后肢痛阈值的变化见图1。

各组家兔注药前电痛阈值相比差异无显著性（P > 0.05）；亚甲蓝磁性微球15 mg 组家兔在注药后第1~6天电痛阈值比注药前明显升高，差异有显著性意义（P < 0.05）；与其他组比较痛阈值差异有显著性意义（P < 0.05）。
2.3 家兔的体感诱发电位N1波潜伏期变化见表1。

亚甲蓝磁性微球15 mg 组术后N1波潜伏期明显延长，与其他组比较，差异显著（P < 0.05），术后13 d 恢复正常。其他组体感诱发电位N1波潜伏期在注射微球后无显著变化。
2.4 病理观察注药部位腰骶段脊髓及背根神经节组织结构正常，无神经细胞坏死、神经纤维肿胀或脱髓鞘等神经组织破坏性改变。除假手术对照组外其他两组背角均有少数未完全降解的微球。各组脊髓前角均可观察到形态正常的前角运动神经细胞及神经轴索，结构完整，亚甲蓝磁性微球15 mg 组可见背角神经有亚甲蓝着色及药物微球附着，见图2。

顽固性疼痛特别是神经源性疼痛和癌痛是目前临床的难题，其机制和有效的治疗方法仍在探索中。神经毁损疗法（如蛛网膜下腔酚甘油阻滞、腹腔神经丛乙醇阻滞）通过应用神经破坏剂（如无水乙醇、酚甘油等）损毁神经末梢、神经干、神经节而达到完全止痛的目的，是一种有效的止痛疗法。但目前临床上常用的神经破坏剂毒性大，并发症较重，如组织坏死、肢体运动功能障碍等限制了其在临床上的应用。磁性药物微球是近年来研制的一种靶向给药制剂，它是将药物、磁性超微粒子和骨架材料等经过一定的物理化学过程配制在药物稳定系统中，在足够强的外磁场作用下到达作用部位并定位于靶区，将所载药物定位释放，达到高效低毒的药效作用，而对正常组织无明显影响[9]。
脊髓背角是躯体和内脏感觉的传入重要通路，在神经病理性痛的发生与维持中起着重要作用，疼痛信号经第二、第三级传入神经元换元后投射至大脑皮质引起定位痛觉及情绪反应。如果阻滞破坏脊髓背角就可切断疼痛刺激信号上传，从而达到镇痛的目的。
亚甲蓝是噻嗪染料类化合物，具有氧化还原功能，有较强亲神经性，其止痛作用确切，机制可能是：①亚甲蓝为一受氢体，其色素受氢后可使无髓鞘神经纤维特别是感觉纤维着色，从而阻止感觉冲动的传导。②亚甲蓝参与糖代谢，能促进丙酮酸的继续氧化，改变神经末梢膜内外的酸碱平衡和膜电位，从而使神经冲动的传导受阻。研究表明亚甲蓝不像乙醇、酚类那样使神经组织蛋白凝固及膜发生病理改变，仅引起一过性神经水肿和
周围炎性反应，不影响神经的组织学结构[10-11]；本实验病理结果显示无神经组织破坏性改变。体感诱发电位变化结果表明，15 mg 亚甲蓝磁性微球可引起N1波潜伏期明显延长，术后12 d 恢复正常。病理结果显示，15 mg 以内的亚甲蓝磁性微球对脊髓背角和前角均未显现破坏作用，可能有两方面原因，第一有研究显示亚甲蓝引起神经水肿和周围炎性反应，为一过性，不影响神经的组织学结构，由于病理检查是在注药后30 d 进行，被亚甲蓝破坏的背角轴索已再生；另一原因是微球所包含的亚甲蓝剂量不够，药物浓度不高，神经轴索损害不明显。
诱发电位是检测神经通路功能完整性的电生理检查方法，Hzrada[12]报道所记录到的脊髓诱发电位（SCEP）N1波来自脊髓后部的脊髓浅层、前索中心沟附近、侧索等部位诱发电位的总和，说明SCEPN1反映感觉和运动通路。脊髓诱发电位的波幅代表了脊髓内神经传导通路电位活动的强弱，反映了传导束和神经元的功能状况，动物实验结果显示，亚甲蓝磁性微球15 mg 组家兔后肢电痛阈值在注药后明显增高，其增高在第1~6天与基础值及对照组相比，差异有显著性，而后肢的运动功能并未受到损害，说明药物在外磁场的作用下靶向阻滞了脊髓背根神经节，阻断了疼痛信号的传导，专司运动传导的脊髓腹侧神经根未受到药物的影响。
综上所述，自制亚甲蓝磁性微球可用于脊髓背根神经的靶向阻滞而不影响运动功能，其应用于顽固性疼痛或晚期癌痛等治疗的可行性还需要更广泛和深入的研究。

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