壳聚糖-小干扰RNA纳米粒对U251细胞增殖及凋亡的影响*★

姚鹏飞，柯以铨，王建奇，许刚，周振军

课题背景：本课题受广东省自然科学基金资助，基金编号为O5004763。RNA干扰技术是一项高效率高特异性的基因沉默技术，随着siRNA 合成、转染方法的极大改进，RNA干扰快速成为基因功能研究及其治疗应用的强有力工具。但是siRNA不稳定，容易被血清酶降解，难以到达靶器官而发挥治疗作用。国内外广泛展开siRNA载体系统的研究，壳聚糖纳米粒载体系统是热点之一，旨在寻找一种能够应用于临床的治疗系统。

应用要点：①将纳米技术与RNA干扰技术相结合，应用于治疗脑恶性胶质瘤，为脑恶性胶质瘤的综合治疗建立新的技术平台。②通过吐温-80对脑肿瘤的靶向性，制备靶向性纳米粒。③初次将壳聚糖-siRNA纳米粒应用于脑恶性胶质瘤细胞的治疗研究，从方法和技术上进行探索。

同行评价：纳米材料可以作为RNA干扰的载体系统。高级别恶性胶质瘤手术后复发率高，化疗效率低，且高表达端粒反转录酶。所以在恶性胶质瘤中进行RNA干扰具备良好前景。本实验采用RNA干扰技术，针对端粒反转录酶(hTERT)-mRNA构建壳聚糖（CS）-siRNA纳米粒，转导入胶质瘤U251细胞，发现CS-siRNA-hTERT对胶质瘤U251细胞有抑制作用，作用机制可能与促使肿瘤细胞凋亡，干扰细胞进入S期等。本实验对RNA干扰在恶性胶质瘤中应用有一定意义。

南方医科大学珠江医院神经外科，广东省神经外科研究所，广东省广州市 510280

姚鹏飞★，男，1975年生，甘肃省天水市人，汉族，南方医科大学在读硕士，主治医师，主要从事脑胶质瘤的研究。
yaopf1@21cn.
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目的：预防胶质瘤术后复发采取化学疗法和放射治疗，因敏感性低及胶质瘤对其产生抵抗，并未提高恶性胶质瘤患者的预后。目前广泛开展的基因治疗研究，有望取得突破。观察靶向端粒反转录酶(human telomerase reverse transcriptase，hTERT)基因的壳聚糖(chitosan,CS)- 小干扰RNA（small interferening RNA,siRNA）纳米粒在体外进行RNA干扰对胶质瘤U251细胞增殖及凋亡的影响。
方法：实验于2006-09/2007-07在广东省神经外科研究所（重点实验室）完成。制备针对hTERT基因的CS-siRNA纳米粒，原子力显微镜观察纳米粒的形态及大小。按转染试剂的不同分为8组。空白对照组(不含转染试剂及siRNA)，阳性对照组(LipofectamineTM 2000转染siRNA)，阴性对照组(含30 nmol/L阴性对照siRNA的纳米粒)，裸siRNA对照组(含30 nmol/L siRNA)，空白CS纳米粒对照组，10，30，90 nmol/L siRNA纳米粒组。取对数生长期的U251细胞转染后，采用CCK-8法绘制细胞增殖曲线并计算抑制率；Hoechst 33342/碘化丙啶双荧光染色后，荧光显微镜下观察细胞核形态；流式细胞仪检测细胞周期；反转录-聚合酶链反应法检测hTERT-mRNA表达变化。
结果：①原子力显微镜下CS-siRNA纳米粒，呈球形，形状一致，大小约87 nm。②阳性对照组、30，90 nmol/L siRNA纳米粒组细胞增殖明显受抑制，与其余各组比较差异有显著性（P < 0.05）。③Hoechst 33342/碘化丙啶双染荧光显微镜下可见空白对照组、阴性对照组、裸siRNA对照组和空白CS纳米粒对照组大多为低蓝色的正常细胞；阳性对照组、10，30，90 nmol/L siRNA纳米粒组以高蓝色的凋亡细胞为主。④阳性对照组、10，30，90 nmol/L siRNA纳米粒组与空白对照组、阴性对照组、裸siRNA对照组、空白CS纳米粒对照组相比，G0/G1期细胞显著增加，S期细胞明显减少，阳性对照组最为明显(P < 0.05)，G2/M期细胞变化不明显(P > 0.05)。⑤阳性对照组、10，30，90 nmol/L siRNA纳米粒组hTERT mRNA表达明显下调，30，90 nmol/L siRNA纳米粒组表达下调较10 nmol/L siRNA纳米粒组更明显。
结论：CS-siRNA在体外明显抑制了胶质瘤U251细胞增殖并促进其凋亡。
关键词：壳聚糖;纳米粒;胶质瘤;端粒酶反转录酶;RNA干扰;生物材料

姚鹏飞，柯以铨，王建奇，许刚，周振军. 壳聚糖-小干扰RNA纳米粒对U251细胞增殖及凋亡的影响[J].中国组织工程研究与临床康复，2008，12(14):2640-2644 [www.zglckf.com/zglckf/ejournal/upfiles/08-14/14k-2640(ps).pdf]

Proliferation and apoptosis of U251 cells induced by chitosan-small interference RNA nanoparticle

AIM: Current chemotherapy and radiotherapy are doomed to prevent glioblastoma recurrence, but don't improve the prognosis of patients with malignant gliomas due to low sensitivity and easy induction for drug resistance in glioma cells. However, the widespread gene therapy may bring the breakthrough in this field. This study was designed to investigate cell proliferation and apoptosis of glioblastoma U251 by RNA interference with chitosan (CS)-small interference RNA (siRNA) nanoparticle targeted human telomerase reverse transcriptase (hTERT) gene in vitro.
METHODS: The experiment was carried out in the Neurosurgery Institute of Guangdong Province (Key Laboratory) between September 2006 and July 2007. CS-siRNA nanoparticle targeting hTERT gene was prepared. The morphology and size of the nanoparticle were observed with atomic force microscope. The transfected neurogliocytoma cells U251 were divided into 8 groups: blank control group (without transfection reagents or siRNA), positive control group (LipofectamineTM 2000 transfected siRNA), negative control group (30 nmol/L controlled siRNA nanoparticle), bare siRNA control group (30 nmol/L siRNA), blank CS nanoparticle control group, siRNA nanoparticle groups (10, 30, 90 nmol/L). U251 cells at logarithmic growth phase were detected to draw the curve of cell proliferation and calculate inhibition ratio by means of CCK-8 method. The morphology of the nucleus was observed by Hoechst 33342/propidium iodide double staining under fluorescence microscope. Flow cytometry results showed the cell cycle. Reverse transcription-polymerase chain reaction was used to detect the expression changes of hTERT-mRNA.
RESULTS: ①Under atomic force microscope, CS-siRNA nanoparticles were spherical and uniform, and the mean particle diameters were 87 nm.②The cell proliferation was obviously inhibited in positive control group and siRNA nanoparticle groups (30 and 90 nmol/L), with significant differences compared with other groups (P < 0.05).③The results of Hoechst33342/propidium iodide double staining under fluorescence microscope revealed that, the blank control group, negative control group, bare siRNA control group and blank CS nanoparticle group contained low blue normal cells, while positive control group and siRNA nanoparticle groups (10, 30, 90 nmol/L) represented high blue apoptotic cells.④Compared with blank control group, negative control group, bare siRNA control group and blank CS nanoparticle group, the cells at S phase remarkably decreased, while those at G0/G1 phase increased in siRNA nanoparticle groups (10, 30, 90 nmol/L). And the changes were the most obvious in positive control group (P < 0.05). Cells at G2/M phase were not changed (P > 0.05).⑤The mRNA level of hTERT was obviously decreased in positive control group and siRNA nanoparticle groups, especially in 30 and 90 nmol/L siRNA nanoparticle groups.
CONCLUSION: CS-siRNA effectively inhibits cell proliferation and promotes apoptosis of U251 in vitro.

Yao PF, Ke YQ, Wang JQ, Xu G, Zhou ZJ. Proliferation and apoptosis of U251 cells induced by chitosan-small interference RNA nanoparticle.Zhongguo Zuzhi Gongcheng Yanjiu yu Linchuang Kangfu 2008;12(14):2640-2644(China)
[www.zglckf.com/zglckf/ejournal/upfiles/08-14/14k-2640(ps).pdf]

恶性胶质瘤是最常见的颅内恶性肿瘤，其高度弥漫性、浸润性生长的特性，决定了手术无法彻底切除；尽管新的化学疗法药物不断出现和放射治疗技术不断提高，却并没有改善恶性胶质瘤患者的预后。RNA干扰技术(RNA interference, RNAi)的发现为胶质瘤治疗提供了新的思路。人端粒酶反转录酶(human telomerase reverse transcriptase，hTERT)是端粒酶的催化亚单位，控制着端粒酶的活性，在所有高级别胶质瘤细胞中均阳性表达，且肿瘤恶性程度越高表达水平越高；而在大多数体细胞中几乎不表达[1]，并且其表达在转录水平被调控[2]。本实验依据RNAi原理，以恶性胶质瘤特异性靶基因hTERT mRNA为靶点，应用纳米技术制备壳聚糖(chitosan,CS)-小干扰RNA（small interferening RNA,siRNA）纳米粒，观察其在体外对hTERT mRNA及恶性胶质瘤细胞增殖及凋亡的影响，为进一步体内研究提供依据。

设计：对照观察。
单位：南方医科大学珠江医院神经外科。
材料：实验于2006-09/2007-07在广东省神经外科研究所（省重点实验室）完成。实验用材料：CS（脱乙酰度95%，Mr 150 000，Fluka公司）；三聚磷酸钠（Fluka公司）；吐温-80、冰醋酸均为分析纯（Sigma-Aldrich公司）；hTERT基因特异性siRNA由Ambion公司设计、合成(siRNA ID:4521)，正义链：5’-GGA ACA CCA AGA AGU UCA Utt-3’；反义链 5’-AUG AAC UUC UUG GUG UUC Ctg-3’，经基因库检索确认与hTERT以外的基因序列无同源性；阴性对照siRNA（Ambion 公司）； LipofectamineTM 2000（Invitrogen 公司）；人恶性胶质瘤细胞系U251（上海生物细胞研究所）；RPMI 1640、新生牛血清（海克隆公司）；RNeasy Mini Kit、一步法反转录-聚合酶链反应试剂盒（Qiagen公司）；引物由Invitrogen公司合成；CCK-8试剂盒（Dojindo Laboratories公司）；Hoechst 33342染料、碘化丙啶(Sigma公司)。仪器：SPM-9500原子力显微镜（日本岛津公司）；流式细胞仪（Chemicon公司）。
设计、实施、评估者：设计、实施、评估均为全部作者，均经过正规培训。
技术路线：
CS-siRNA纳米粒的制备：参考Katas等[3]采用的离子凝胶法，加以改动。①将50 μmol/L siRNA三蒸水溶液3 μL加入到0.84 g/L三聚磷酸钠溶液1.2 mL中。②持续磁力搅拌下，采用5号针头依次将体积分数为0.02的吐温-80 0.05 mL、siRNA-三聚磷酸钠溶液点滴状滴入到CS醋酸溶液3 mL中, 滴速为40~50滴/min，滴入后持续搅拌2 min，室温孵育30 min。同法备空白壳聚糖纳米粒作为对照。
纳米粒形态学观察：采用原子力显微镜对纳米微粒进行观察。取1 μL纳米粒混悬液滴至新鲜的云母片表面，氮气展平、风干。成像在大气环境下进行,方式为轻敲模式。扫描频率为1 Hz。成像结果通过原子力显微镜附带三维截面测定分析软件对纳米粒的大小进行测量和三维构图。
实验分组：按转染试剂的不同共分为8组。空白对照组(不含转染试剂及siRNA)，阳性对照组(LipofectamineTM 2000转染siRNA)，阴性对照组(含 30 nmol/L阴性对照siRNA的纳米粒)，裸siRNA对照组(含30 nmol/L siRNA)，空白CS纳米粒对照组，10，30，90 nmol/L siRNA纳米粒组。
细胞转染及增殖检测：对数生长期的U251细胞，在含体积分数为0.1的新生牛血清的RPMI 1640培养基中重悬后按每孔5×107 L-1，接种于96孔板中培养1 d。次日换无血清培养基，并按不同分组（每组3个复孔）加入相应转染试剂进行转染，4 h后去除无血清培养基及转染试剂，加入含血清培养基，继续培养。分别于转染后24，48，72 h，每孔中加CCK-8试剂10 μL，继续培养 3 h，用WellScan MK22型酶标仪450 nm波长测定各孔的吸光度值（A），以时间、吸光度值绘制细胞增殖曲线；并计算siRNA转染后48 h时对细胞增殖的抑制率；细胞增殖抑制率=（空白对照组吸光度值-实验组吸光度值/空白对照组吸光值）×100%。
凋亡细胞的细胞核形态学检测：对数生长期的U251细胞按每孔1×107 L-1，接种于24孔板中培养24 h，各组均按上法进行转染，48 h后弃去培养液，磷酸盐缓冲液(pH 7.4)洗两遍。分别在每孔中加入荧光染料Hoechst 33342至终浓度10 mg/L，37 ℃下染色15 min。弃去染液，加入碘化丙啶至终浓度50 mg/L，4 ℃避光染色15 min。染色后磷酸盐缓冲液洗涤1次。荧光显微镜下观察并拍照。
流式细胞仪检测细胞周期的变化：转染48 h后，分别收集各组U251细胞（1.0×106个），用4 ℃预冷的体积分数为0.7的乙醇固定24 h，磷酸盐缓冲液洗去固定液，加5 g/L RNase A 100 μL 37 ℃水浴1 h，然后冰浴终止酶作用，加碘化丙啶(终浓度50 mg/L)，4 ℃避光染色 30 min，流式细胞仪检测，用Cell Modifit软件分析细胞周期，实验重复3次。
反转录-聚合酶链反应检测各组细胞中hTERT mRNA的表达：RNA提取试剂盒提取各组U251细胞总RNA，以此为模板，进行反转录-聚合酶链反应。hTERT引物，上游：5’-GGC TCC AGG CAC AAC GAA CG-3’；下游：5’-CGA TGC TGC CTG ACC TCT GC-3’。反应条件：50 ℃ 30 min，95 ℃ 15 min，然后94 ℃ 30 s，62 ℃ 45 s，72 ℃ 50 s，25个循环，再72 ℃延伸8 min。以β-actin作为内参。18 g/L琼脂糖凝胶电泳进行聚合酶链反应产物鉴定。
主要观察指标：CS-siRNA纳米粒的形态及大小，CS-siRNA转染后对U251细胞增殖活性的影响，凋亡细胞形态，CS-siRNA纳米粒对U251细胞周期的影响，CS-siRNA抑制U251 hTERT mRNA的表达。
统计学方法：由第一作者采用SPSS 13.0进行数据处理，数据以_x±s表示，组间比较采用单个重复测量因素的方差分析和One-Way ANOVA检验；以P < 0.05表示差异有显著性意义。

2.1 CS-siRNA纳米粒的形态及大小原子力显微镜结果表明，可以看到在2.22μｍ×2.22μm云母表面散在分布CS-siRNA纳米粒，呈球形，形状一致，分布均匀，大小约87 nm，见图1。

2.2 CS-siRNA转染后对U251细胞增殖活性的影响
CCK-8法检测96孔板细胞在不同时间的吸光度值，根据存活细胞数量与吸光度值呈正比的原理，绘制细胞增殖曲线，见图2。

图2中曲线可以看出，阳性对照组、30，90 nmol/L siRNA纳米粒组细胞增殖明显受抑制，与其余各组比较差异有显著性（P < 0.05）。根据公式计算48 h细胞增殖抑制率，空白对照组、阴性对照组、裸siRNA对照组、空白CS纳米粒对照组与阳性对照组、30，90 nmol/L siRNA纳米粒组间差异有显著性(P < 0.05)，10 nmol/L siRNA纳米粒组与30，90 nmol/L siRNA纳米粒组间差异有显著性(P < 0.05)，30，90 nmol/L siRNA纳米粒组间差异无显著性(P > 0.05) ，见图3。图3结果表明，30 nmol/L CS-siRNA纳米粒对U251细胞有显著抑制作用。
2.3 凋亡细胞形态学观察 Hoechst 33342/碘化丙啶双染荧光显微镜下观察，染成红色荧光的细胞为坏死细胞；细胞核染色质凝集、分布不均的高蓝色细胞为凋亡细胞；染色质分布均匀的低蓝色细胞为正常细胞。镜下可见空白对照组、阴性对照组、裸siRNA对照组和空白CS纳米粒对照组大多为低蓝色的正常细胞；偶见高蓝色的凋亡细胞和红色的坏死细胞。阳性对照组、10，30，90 nmol/L siRNA纳米粒组以高蓝色的凋亡细胞为主，其中阳性对照组、30 nmol/L siRNA纳米粒组凋亡细胞明显多于10，90 nmol/L siRNA纳米粒组，见图4。

2.4 CS-siRNA纳米粒对U251细胞周期的影响经流式细胞仪检测，阳性对照组、10，30，90 nmol/L siRNA纳米粒组与空白对照组、阴性对照组、裸siRNA对照组、空白CS纳米粒对照组相比，G0/G1期细胞显著增加，S期细胞明显减少，阳性对照组最为明显(P < 0.05)，G2/M期细胞变化不明显(P > 0.05)，见表1。
表1结果表明细胞由G0~G1期进入到S期受到阻滞，细胞增殖速度下降。
2.5 CS-siRNA抑制U251 hTERT mRNA的表达半定量反转录-聚合酶链反应检测结果以琼脂糖电泳条带的亮度来判断hTERT mRNA表达高低。空白对照组、阴性对照组、裸siRNA对照组、空白CS纳米粒对照组hTERT mRNA表达无明显变化；阳性对照组、10，30，90 nmol/L siRNA纳米粒组hTERT mRNA表达明显下调，30， 90 nmol/L siRNA纳米粒组表达下调较10 nmol/L siRNA纳米粒组更明显，见图5。

胶质瘤根据恶性程度分为4级，低级别胶质瘤很难检测到端粒酶活性，而大多数高级别胶质瘤高度表达端粒酶活性，并且由低级别发展而来的高级别胶质瘤端粒酶活性重新被激活[4]。端粒酶激活后不仅能够刺激细胞分化，抑制凋亡发生，最终导致细胞永生化；而且能使细胞周期缩短、生长变快，发生转移。人端粒酶由hTERT、RNA模板、端粒酶相关蛋白三部分组成，其中hTERT是决定端粒酶活性的关键因素，在端粒酶激活过程中发挥着限速作用。抑制hTERT的表达可以抑制端粒酶的活性，端粒酶活性的降低独立于端粒的缩短而影响肿瘤的生长[4]，而且更早地抑制细胞分裂、促进细胞凋亡，从而达到治疗肿瘤的目的，因此，hTERT是恶性胶质瘤基因治疗的靶点之一。
RNA干扰是双链RNA降解特异性靶基因转录的mRNA、从而抑制靶蛋白表达的现象[5]。与传统的反义技术相比，RNAi能够更高效、更特异的抑制靶基因表达，产生类似基因敲除的效果[6]，成为最有发展潜力及临床应用价值的生物学发现[7]。但是，发挥RNAi作用的siRNA长度为21~23个核苷酸[8]，直接向细胞内导入siRNA存在基因沉默维持时间短、体内转运难和转染效率低下等问题[9]；对于脑胶质瘤来说，还存在血脑屏障，siRNA更难导入肿瘤细胞内。因此限制了该技术的应用。而利用载体介导的RNAi技术将有望克服上述困难[10-13]。
CS是从甲壳类生物的贝壳中提取出来的一种可生物降解的多糖,具有良好的生物相容性、生物降解性[14] 和抗肿瘤活性[15], 作为药物载体得到广泛应用[16]。它也是自然界中惟一的阳离子多糖，对siRNA有很好的结合和保护作用，而且还很容易改性制成不同途径给药的基因治疗载体，体内外实验已初步显示出良好的应用前景[17]。在表面覆盖吐温-80的纳米粒，能很好地透过血脑屏障[18]，对颅内肿瘤细胞具有靶向性[19]。借助CS所具有的多种生物学活性，制备了CS-siRNA纳米粒，既保护siRNA的完整性，又递送siRNA到肿瘤细胞[20]。原子力显微镜显示纳米粒粒径均一，大小合适，适合用作基因载体。根据Ambion公司使用说明，使用3种浓度CS-siRNA及对照组作用于体外培养的U251胶质瘤细胞，结果表明：CS-siRNA纳米粒明显抑制了U251 hTERT mRNA的表达，导致hTERT蛋白合成减少，引起端粒酶活性下降，从而使细胞增殖能力降低，细胞周期停滞于G0/G1期，凋亡细胞明显增多，显著抑制了胶质瘤细胞的增殖。但抑制率并不高，未超过20%，可能是转染率仍较低的原因，且抑制程度没有明显剂效关系，30 nmol/L作用效果较好。其疗效略低于阳性对照组，可能与CS包裹后siRNA的转染效率较低有关。
CS-siRNA纳米粒能够抑制hTERT mRNA的表达，而裸siRNA无抑制作用，可能是因为裸siRNA被培养基中的血清酶降解，进一步说明siRNA要发挥RNAi作用必须借助能够保护其结构完整的载体系统。另一方面，阴性对照CS-siRNA纳米粒也没有发挥抑制作用，是由于siRNA发挥RNAi作用依赖于靶序列的特异性，而阴性对照siRNA与靶序列无相关性，而且只有少数siRNAs才能够以特异序列的方式高效地诱导靶基因沉默。
本实验采用RNAi技术，针对hTERT mRNA构建了CS-siRNA纳米粒，通过实验观察到转染到细胞内的siRNA可以有效抑制U251细胞中hTERT的活性，引起U251细胞增殖速度减慢，生长抑制。CS-siRNA纳米粒成功地将RNAi从有效地研究工具转化为可行的治疗策略，有望为肿瘤基因治疗提供一种新的思路。

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