丝素肽/壳聚糖聚合物涂层316L不锈钢的制备★

李晓燕1，蒋容静2，刘建平1，曹梅讯，李胜，郑莺，江柳月

课题背景：选择生物相容性良好的聚合物覆盖在支架表面，可以克服金属支架本身的致血栓性，加速血管的内皮化过程。通过改进涂层支架的方法，还可以在支架表面直接涂层生物活性物质，发挥其抗血栓、抗炎等作用。本实验就是通过静电自组装的作用，在支架材料316L不锈钢表面制备丝素肽和壳聚糖聚合物涂层，对不锈钢进行表面改性。

重要的概念：层层静电自组装利用超分子静电自组装原理，通过静电力的作用依次吸附上带异种电荷的聚电解质，可形成多种功能超薄膜，其工艺简单，厚度可控，适用于具有复杂体型结构的材料，且制备条件温和，可实现多种生物分子的表面固定，实用性较强。

同行评价：实验选择具有良好生物活性的丝肽素和壳聚糖，通过层层静电自组装方法，尝试将这些物质有机地聚合在不锈钢材料上，探索一种制备带有生物活性膜的不锈钢支架材料的新方法，不仅具有一定的理论意义，更具有广阔的应用前景。

1上海交通大学医学院附属仁济医院，上海市 200001；2中国科学院上海生命科学研究院植物生理生态研究所，上海市 200032

李晓燕★，女，1982年生，江苏省建湖县人，汉族，上海交通大学医学院附属仁济医院在读硕士。
Shine19821214@126.com

通讯作者：刘建平，教授，硕士生导师，上海交通大学医学院附属仁济医院心内科，上海市 200001
jpl@medmail.com

摘要
背景：金属支架本身的致血栓性使对其进行表面改性研究极具应用意义。
目的：利用层层静电自组装形成丝素肽壳聚糖聚合物膜。
设计、时间及地点：材料改性体外实验，于2006-07/2007-07在中国科学院上海生命科学研究院植物生理生态研究所实验室完成。
方法：通过层层静电自组装方法将丝素肽和壳聚糖交替涂层至医用316L不锈钢表面，对不锈钢表面进行改性。
主要观察指标：应用扫描电镜观察涂层前后316L不锈钢表面形貌变化，通过傅里叶红外光谱分析涂层前后波谱变化，测定材料表面接触角分析涂层结果，并进行体外降解实验观察涂层的稳定性。
结果：扫描电镜显示涂层后不锈钢表面均匀、致密；傅里叶变换红外光谱测定显示复合膜分子间存在强的离子键结合作用，也存在着强的氢键作用；接触角测定结果显示丝素肽和壳聚糖被交替涂层至不锈钢表面; 体外降解实验证实了涂层不锈钢的降解过程相对稳定。
结论：丝素肽与壳聚糖可通过静电自组装在不锈钢表面形成薄膜。
关键词：丝素肽；壳聚糖；静电自组装；316L不锈钢；生物材料；表面改性

李晓燕，蒋容静，刘建平，曹梅讯，李胜，郑莺，江柳月.丝素肽壳聚糖聚合物涂层316L不锈钢的制备[J].中国组织工程研究与临床康复，2008，12(14):2652-2655
[www.zglckf.com/zglckf/ejournal/upfiles/08-14/14k-2652(ps).pdf]

BACKGROUND: The researches of metal stents' surface modification have a high applicable value for its thrombophilia.
OBJECTIVE: To prepare silk peptide and chitosan polymeric membrane by layer-by-layer electrostatic self-assembly multiplayer.
DESIGN ,TIME AND SETTING: The in vitro experiment of materials modification was performed at Laboratory of Institute of Plant Physiology & Ecology, Shanghai Institutes for Biological Sciences, Chinese Academy of Sciences between July 2006 and July 2007.
METHODS: Silk peptide and chitosan were coated on medical 316L stainless steel alternately by layer-by-layer electrostatic self-assembly multiplayer to modify stainless steel surface.
MAIN OUTCOME MEASURES: We observe the changes of 316L stainless steel surface by scanning electron microscope before and after it was coated, analyze spectra changes before and after 316L stainless steel was coated through Fourier Transform Infrared Spectrum Analysis Technique, analyze results of coatings by measuring surface contact angle and observe the stability of coatings through performing in vitro degradation experiment.
RESULTS: Scanning electron microscope displayed the surface of coated stainless steel was uniform and pyknic. Fourier transform infrared spectrometer measurement results displayed there were strong ion bonds and hydrogen bonds effects between compound membrane molecules. Contact angle measurement results displayed silk peptide and chitosan were coated on stainless steel surface alternately. Experiment of in vitro degradation verifies the process of stainless steel degradation is relatively stable.
CONCLUSION: Silk peptide and chitosan can fom coatings on the surface of 316L stainless steel by electrostatic self-assembly multiplayer.

Li XY, Jiang RJ,Liu JP,Cao MX, Li S, Zheng Y, Jiang LY.Preparation of silk peptide and chitosan polymer-coated 316L stainless steel.Zhongguo Zuzhi Gongcheng Yanjiu yu Linchuang Kangfu 2008;12(14):2652-2655
[www.zglckf.com/zglckf/ejournal/upfiles/08-14/14k-2652(ps).pdf]

2006年ESC大会报道了药物洗脱支架晚期血栓发生率和支架再狭窄率高于裸支架，这一报道使人们更加关注如何降低晚期支架内血栓形成和再狭窄。选择生物相容性良好的聚合物覆盖在支架表面，可以克服金属支架本身的致血栓性，加速血管的内皮化过程，通过改进涂层支架的方法，还可以在支架表面直接涂层生物活性物质，发挥其抗血栓、抗炎等作用。
层层静电自组装利用超分子静电自组装原理，通过静电力的作用依次吸附上带异种电荷的聚电解质，可形成多种功能超薄膜，其工艺简单，厚度可控，适用于具有复杂体型结构的材料，且制备条件温和，可实现多种生物分子的表面固定，已成为医用生物材料表面功能设计的有效手段[1]。通过选择不同的功能分子，已成功地制备了具有抗凝血性、促进细胞黏附及生长和控制释放DNA等功能的生物功能表面[2]。
丝素肽是从蚕丝中提取的天然高分子纤维多肽，在水溶液中带负电荷，能促进表皮细胞增长[3]，并且硫酸化的丝素肽具有抗凝作用[4]。壳聚糖是一种天然的碱性氨基化多糖，在酸性溶液中带正电荷，它也有促进上皮细胞增长[5]、抑制平滑肌细胞增生以及抑制微生物生长的作用[6-7]，对其进行改性以及其硫酸化产物亦有抗凝作用[8-9]，除此之外，壳聚糖还有降胆固醇和降血糖的作用[10-11]。本实验通过静电自组装的方法在316L不锈钢表面形成丝素肽、壳聚糖聚合物涂层膜，对不锈钢进行表面改性。

1.1 材料实验于2006-07/2007-07在中国科学院上海生命科学研究院植物生理生态研究所实验室进行。
医用316L不锈钢片（张家港先科医疗器械有限公司提供，2 cm×2 cm×0.5 cm）；丝素肽 (5 g/L，溶剂为0.14 mol/L的NaCl 并且调节pH 6.0，中国科学院上海植物生态研究所提供）；壳聚糖（5 g/L 溶剂为0.14 mol/L的NaCl 并且调节pH 4.0，浙江省玉环县海洋生物化学有限公司提供）；聚乙烯亚胺（PEI 5 g/L 溶剂为0.14 mol/L的NaCl，Fluka公司生产，d420=1.08，Mr:6×105~ 1×106，50%离子水稀释）。
1.2 方法将316L抛光不锈钢片用超声波清洗30 min，用乙醇、丙酮交替清洗5~10遍，然后用超纯水清洗干净，真空干燥后备用。将不锈钢片放入聚乙烯亚胺溶液浸泡20 min ，在不锈钢表面形成阳离子静电自组装前体，随后将不锈钢交替沉浸在丝素肽溶液和壳聚糖溶液中各10 min，每次涂层后用流动的少量的0.14 mol/L NaCl溶液轻轻清洗不锈钢片表面，每次清洗后真空干燥。
1.2.1 涂层性能表征形貌观察：扫描电镜观察涂层前后不锈钢表面的形貌变化。JSM-6360LVSEM为计算机控制使用的扫描电子显微镜，Smile View图片处理软件。
涂层粒子检测：①光谱测试分析涂层前后波谱变化：在Bio-Rad FTS 185 型傅里叶变换红外光谱仪上进行，扫描次数：64；范围：4 000~400 cm-1。②涂层表面接触角测定：检测不锈钢表面涂层前后亲疏水性变化，根据测定接触角来跟踪交替组装丝素肽和壳聚糖过程。通过测试去离子水在材料表面的接触角可判断其亲水性程度[12]。由 OCA20型视频光学接触角测量仪（德国Dataphysics仪器公司制造）测定。测量精度：±0.1°。测试用水量为3 μL，滴水后待水滴稳定后测试表面接触角，每个样品上随机取4个点测量，最后取平均值。
涂层体外初始降解[12]：将涂层不锈钢放入盛有模拟体液Hank＇s溶液的锥形瓶中降解(Hank＇s溶液组成：NaCl 8.0 g，KCl 0.4 g，CaCl2 0.14 g，MgCl2﹒6H2O 0.1 g， MgSO4﹒7H2O 0.06 g，KH2PO4 0.06 g，Na2HPO4﹒12H2O 0.06 g，H2O 1 000 mL），降解介质用NaOH和HCl调节pH值为7.4，然后置入37 ℃的高低温恒温振荡培养箱中进行体外降解实验，模拟体液每3 d更换一次，同时样品表面用去离子水冲洗，并随时监测pH值变化，使其稳定在7.4左右，在2，7，21 d从锥形瓶中任意取出一个样品，其余的样品继续进行降解实验，取出的样品用去离子水冲洗、干燥后用扫描电镜观察其形貌变化。在第7，21天分别取出最外层为丝素肽和几丁糖不锈钢进行接触角测定。通过这两项检测观察其体外降解情况。

2.1 316L不锈钢表面涂层前后形貌血液接触材料的表面应尽可能光滑, 以减少血栓的

形成。从涂层的电镜照片中可看出未经过涂层的不锈钢，虽经常规清洗，表面仍有部分杂质，表面亦有抛光条纹，见图1a；丝素肽壳聚糖涂层后不锈钢表面均匀致密光滑，布满均匀致密的涂层颗粒，见图1b。

2.2 傅里叶变换红外图像系统分析涂层表面物质光谱在316L不锈钢刚被涂上聚乙烯亚胺时，由于涂层太薄，不能检测聚乙烯亚胺的光谱。图2为单纯壳聚糖图谱。 1 659 cm-1，1 596 cm-1，1 426 cm-1是其特征波谱，对应其酰氨吸收带。而在3 364 cm-1则是O-H的伸缩振动吸收峰与N-H的伸缩振动吸收峰重叠而成的多重吸收峰。

图3为单一丝素肽的红外图谱。丝素肽是一种纤维蛋白质，富含18种氨基酸，其中甘氨酸、丙氨酸和丝氨酸占总组成的80%以上。其主要以多肽健存在， 1 659 cm-1，1 538 cm-1，1 241 cm-1，625 cm-1是其特征谱，对应着酰氨健四带的波谱。
图4与前两张图谱比较而知，壳聚糖和丝素蛋白在 3 000 cm-1左右的吸收峰消失了，表明了丝素肽和壳聚糖溶液中的带电离子发生反应,H+ 、OH-发生中和反应，说明了丝素肽与壳聚糖成膜时的离子化反应。壳聚糖的氨基1 596 cm-1在复合膜中消失了，说明氨基也参与了复合反应。另一方面，丝素肽羟基与壳聚糖的氨基形成氢键使电子云密度平均化，从而使伸缩振动频率降低。同时丝素肽和壳聚糖的酰胺I带(1 659 cm-1)处的C=O伸缩振动峰也向1 657 cm-1处转移，是有可能频率完全相同的振动彼此发生简并，或者因为取代基不同的电负性，通过静电诱导作用，引起分子中电子分布的变化，从而改变了键力常数，使基团的特征频率发生位移。丝素肽酰胺II带从1 538 cm-1向1 542 cm-1移动，主要是可能测试时丝素肽的状态不一样，引起带谱的略微偏移。丝素肽的酰胺III带波峰(1 245 cm-1)与壳聚糖的酰胺III带波峰(1 323 cm-1)向1 255 cm-1波峰移动。红外分析结果表明，复合膜分子间存在强的离子键结合作用，也存在着强的氢键作用。

2.3 接触角测定涂层前后不锈钢表面的亲水性[13] 图5示316L不锈钢表面接触角随组装层数变化曲线。316L不锈钢接触角为（43.2±1.0）°，与文献报道的44°相似[14]，氨基化的不锈钢的接触角为（56.2±1.83）°，吸附第一层丝素肽时接触角降为（30.84±3.13）°，再吸附一层壳聚糖后接触角变为（51.62±5.32）°，随着丝素肽和壳聚糖在316L不锈钢上面交替吸附接触角呈现周期性变化。图上显示出锯齿状变化，说明丝素肽和壳聚糖在316L不锈钢上被成功交替涂上去。
2.4 涂层不锈钢的体外降解不锈钢涂层的体外降解和体内降解有很好的相关性，体外降解结果可以很好预测体内的降解情况。
涂层不锈钢体外降解一段时间后仍保持相对均匀，并且表面颗粒随着时间的增加逐步降解，扫描电镜图片见图6。

丝素肽中存在的羧基、羟基和壳聚糖分子中存在的羟基、氨基等既可以作为质子给体，也可以作为质子受体，其相互间复合膜的形成，因存在诸如离子键和氢键等特殊相互作用，可以降低复合体系中的吉布斯自由能[15]，同时，两种物质均为高分子化合物，在界面的侧链能互相渗透，使得复合膜不会分离成两层膜，这种自组装成膜可以提高膜的稳定性，实现沉积过程及膜结构的分子级控制，实现膜的功能化，从而使各组分之间产生良好的相容性，在不锈钢表面形成具有良好生物相容性的表面涂层膜。自组装复合膜的方法较之利用共价键、配位键等组装方法，其受空间障碍的影响相对较小，对基材的尺寸和拓扑结构要求不高，可以克服因空间障碍引起膜上反应基团不能完全参加反应而出现空位产生结构缺陷的弱点[16]。
通过静电自组装方法来制备阴阳聚电解质的复合膜，其制备技术简单、容易操作、对环境要求也不是很高，实用性较强。但影响多层膜生长的因素很多，如溶液的pH值、溶剂的性质、大分子的浓度及相对分子质量、吸附时间和基材表面电荷密度等。对于高分子成膜，如成膜液浓度偏大，则溶液较为黏稠，不利于成膜；而浓度偏小，则高分子含量少，膜太薄，也不易成膜。但本实验中发现当丝素肽和壳聚糖溶液浓度均为5 g/L时，扫描电镜观察时表面比较均匀致密。另一方面，对于该静电自组装产物的物理力学方面的性能还待进一步研究。但总体来说这种层层静电自组装形成的丝素肽壳聚糖聚合物膜保持了丝素肽和壳聚糖原有的良好的生物相容性，并可加强各自的生物学作用，对制备支架的316L不锈钢表面进行了极大改性，有广泛的应用前景。

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