骨髓间充质干细胞复合异种骨基质明胶修复大鼠桡骨缺损*★

田志逢，秦书俭，王瑞芳，柏永刚，谷学静

课题背景：目前骨组织工程中对种子细胞与支架材料复合体修复骨缺损的研究较多，但仍无构建复合体的成熟技术，本课题已取得的成果：①骨髓间充质干细胞与骨基质明胶复合体体外构建时细胞的理想浓度；②复合体构建的骨缺损的修复效果。

应用要点：实验结果证实异种骨基质明胶与骨髓间充质干细胞复合构成的复合体，对骨节段性缺损有较好的修复作用，而且其抗原反应不明显，但在实验中发现材料吸收过快，如果进一步能改善异种骨基质明胶的性状，此材料与骨髓间充质干细胞的复合体可以为临床提供较好的植骨材料。

偏倚或不足：在实验室骨缺损模型制备的过程中，为了减少手术对实验动物的创伤，虽然严格按照骨缺损临界值要求造模，但每只动物骨缺损的位置仍不太一致，降低了实验的完整性。

田志逢★，男，1981年生，河南省濮阳市人，汉族，辽宁医学院在读硕士，主要从事骨组织损伤与修复方向。
zhifeng07@sina.
com

通讯作者：秦书俭，教授，博士生导师，辽宁医学院解剖教研室骨研究所，辽宁省锦州市
121001

摘要
目的: 在骨组织工程学领域内，主要集中种子细胞、支架载体和细胞支架复合体的构建3个方面的研究，在干细胞方面大多数学者认为骨髓间充质干细胞较为理想，支架材料虽然种类繁多，但却没有一种理想的载体。实验拟通过观察骨髓间充质干细胞/骨基质明胶复合体植入骨缺损处成骨性细胞的变化以及钙化情况，认识同种骨髓间充质干细胞复合异种骨基质明胶修复大鼠桡骨节段性骨缺损的可行性。
方法：实验于2006-10/2007-08在辽宁医学院解剖学试验室与科学实验中心完成。①骨髓间充质干细胞体外培养、纯化、扩增、Brd-U体外标记后并在体外与骨基质明胶复合培养，制成骨髓间充质干细胞/骨基质明胶复合体。②60只SD大鼠采用随机数字表法分为骨髓间充质干细胞/骨基质明胶复合体治疗组、单纯骨基质明胶治疗组和单纯骨髓间充质干细胞治疗组，每组20只；每组分2，4，8，12周4个时间段，每个时间段5只。实验过程中对动物处置符合动物伦理学要求。③制备同种异体SD大鼠桡骨骨干5 mm节段性骨缺损模型。骨髓间充质干细胞/骨基质明胶复合体治疗组缺损处植入骨髓间充质干细胞/骨基质明胶复合体，单纯骨基质明胶治疗组缺损处植入单纯骨基质明胶（骨基质明胶由完全培养液同等条件下培养7 d），单纯骨髓间充质干细胞治疗组缺损处植入单纯骨髓间充质干细胞（Brd-U标记的第3代骨髓间充质干细胞，密度1×109个/L）。④大体观察大鼠的术肢活动情况；X射线放射学、组织学对比观察各组大鼠骨缺损的修复情况。
结果：除骨髓间充质干细胞/骨基质明胶复合体治疗组有1例动物因麻醉过深死亡外，其余59只大鼠进入结果分析。①各组术后各时间段骨缺区X射线片表现：骨髓间充质干细胞/骨基质明胶复合体治疗组：2周桡骨缺损处略见骨痂形成，8周可见明显形成骨缺损区的桥接，12周骨缺损区完全被新生骨组织填充，已有骨髓腔出现。单纯骨基质明胶治疗组：12周骨缺损区骨痂形成增多，但未出现桥接，并可见两端有骨质硬化现象。单纯骨髓间充质干细胞治疗组：12周可见两断端有骨质硬化现象，最后形成骨不连。术后 2，4，8，12周复合体治疗组与单纯治疗组放射学检查评价新骨生成差异有显著性意义（P < 0.01）。②组织学检测结果：术后 2，4，8，12周复合体治疗组与单纯治疗组组织学检查新骨生成速度、生成量差异均有显著性意义（P < 0.01）。
结论：骨髓间充质干细胞/骨基质明胶复合体有较强的成骨能力，对节段性骨缺损有较好的修复作用，有望成为骨组织工程中可以选择的植骨材料。
关键词：骨髓间充质干细胞；骨基质明胶；异种；细胞培养；骨缺损；组织构建

田志逢，秦书俭，王瑞芳，柏永刚，谷学静.骨髓间充质干细胞复合异种骨基质明胶修复大鼠桡骨缺损[J].中国组织工程研究与临床康复，2008，12(15):2801-2805 [www.zglckf.com/zglckf/ejournal/upfiles/08-15/15k-2801(ps).pdf]

中图分类号:R329.471
文献标识码:A
文章编号:1673-8225
(2008)15-02801-05

Bone marrow mesenchymal stem cells combined with heterogeneous bone matrix gelatin for the repair of segmental radial defects in rats

AIM:In bone tissue engineering domain, seed cells, scaffold and cell-scaffold composite are three focuses in the study. Bone marrow mesenchymal stem cells (MSCs) are generally considered ideal seed cells, but there is not an ideal scaffold. In this study, we investigated the feasibility of MSCs combined with heterogeneous bone matrix gelatin (BMG) to repair the segmental radial defects in rats by observing the change and calcification of osteogenic cells.
METHODS: Between October 2006 and August 2007, the experiment was performed at in the Anatomic Laboratory and Scientific Experiment Center of Liaoning Medical University. ①MSCs were cultured in vitro, purified, expanded and marked by Brd-U, then cultured with heterogeneous BMG in vitro to prepare MSC/BMG composite. ②Sixty SD rats were randomly divided into MSCs/BMG group, BMG group and MSCs group with 20 animals in each group. Moreover, each group was subdivided into four time points: 2, 4, 8 and 12 weeks with 5 animals at each time point. The animal disposal was consistent with the ethical requirements. ③A bone defect (5 mm in length) was created at the left radial backbone in each rat. The composite of MSCs/BMG were implanted into MSCs/BMG group; BMG was implanted into BMG group (the BMG was cultivated in the same condition for 7 days); MSCs were implanted into MSCs group (the MSCs of the 3rd generation were marked by Brd-U at density of 1×109 L-1). ④The activity of the operated limb was evaluated by gross observation; radiographic examination and histological analyses were performed to observe the bone defect repair after surgery.
RESULTS: Except one rat died of overdose of anesthesia, the rests all entered the result analysis. ①Radiographic examinations of each group: In the MSCs/BMG group, there were few callus formations in the radial defects in 2 weeks; evident bridges grafting was observed in the defects in the 8th week; the defects were filled with newly formed bone completely and cavitas medullatis appeared in 12 weeks. In the BMG group, there were more callus formations in 12 weeks, but no bridges grafting was observed and there was osteosclerosis in the two ends. In the MSCs group, the osteosclerosis in the two ends in 12 weeks resulted in bone nonunion eventually. There were significant differences in new bone formation between experimental groups and control group in 2, 4, 8 and 12 weeks after operation (P < 0.01). ②The histological analyses tests showed that the rate and quality of new bone formation were significantly different (P < 0.01).
CONCLUSION: The composite of MSCs/BMG has strong osteogenic ability. It can well repair segmental bone defects, and is promising to serve as grafting material in bone tissue engineering.

Tian ZF, Qin SJ, Wang RF, Bai YG, Gu XJ.Bone marrow mesenchymal stem cells combined with heterogeneous bone matrix gelatin for the repair of segmental radial defects in rats.Zhongguo Zuzhi Gongcheng Yanjiu yu Linchuang Kangfu 2008; 12(15):2801-2805(China) [www.zglckf.com/zglckf/ejournal/upfiles/08-15/15k-2801(ps).pdf]

骨缺损的修复仍然是临床骨科面临的难题之一。治疗骨缺损最理想的材料就是自体骨，但是自体骨来源有限，同时增加了患者的痛苦，不能满足临床需要。骨组织工程学的出现，为这一难题提出了新思路，随着研究的深入，大多数学者认为种子细胞与支架材料的复合体有望成为理想的植骨材料，但是目前对复合体的构建尚无成熟的技术，故本实验选用同种异体大鼠骨髓间充质干细胞（bone marrow mesenchymal stem cells， MSCs）作为种子细胞，与作为细胞支架的异种骨基质明胶（bone matrix gelatin，BMG）体外复合培养构建成MSCs/BMG复合体来修复大鼠桡骨干节段性缺损，为骨组织工程中植骨材料的研究提供实验依据。

设计：随机对照动物实验。
单位：辽宁医学院解剖教研室骨研究所。
材料：实验于2006-10/2007-08在辽宁医学院解剖学实验室与科学实验中心完成。4周龄雄性SD大鼠4只，体质量80~100 g，8周龄雄性SD大鼠60只，体质量200~220 g，均由辽宁医学院实验动物中心提供（医动字第SCXY(辽)2003-2007号）。将8周龄SD大鼠60只，用随机数字表法随机分为MSCs/BMG复合体治疗组、单纯BMG治疗组和单纯B-MSCs治疗组，每组20只；每组分2，4，8，12周4个时间段，每个时间段5只；所有动物均选取左侧桡骨为实验部位。实验过程中对动物处置符合动物伦理学要求。
Brd-U标记物及一抗，购于北京中杉公司。SABC试剂盒，购于武汉博士德生物公司。L-DMEM培养基及胎牛血清等细胞培养试剂购于Sigma公司。骨基质明胶由本实验室制备。
设计、实施、评估者：实验由第一、二作者设计，所有作者参与实验的实施与结果的评估。
方法：
骨基质明胶的制备：取牛股骨下端松质骨去除骨髓、软组织和关节软骨，用大量蒸馏水清洗,参照Urist[1]的BMG 制备方法制备牛松质骨BMG。4 ℃冻干，环氧乙烷消毒，–20 ℃保存备用。
种子细胞的获取：①大鼠骨髓间充质干细胞的分离与培养：取4周龄SD大鼠，100 g/L水合氯醛麻醉，750 mL/L乙醇浸泡20 min，无菌条件下取出两侧肱骨和股骨，刮除软组织、骨膜和干骺端的软骨部分，剪去骨骺端，参照Yao等[2]的实验方法进行原代培养。②骨髓间充质干细胞的标记：取第3代72 h MSCs，吸除旧培养液，用PBS冲洗2次，加入Brd-U终浓度为10 μmol/L的完全培养基继续培养72 h。③细胞-支架材料复合体的体外构建：参照王涛等[3]的实验方法，取出Brd-U标记的第3代MSCs，弃去培养液，PBS洗3次，尽量将多余的Brd-U洗掉。0.25%胰酶-EDTA消化液消化并收集细胞，以1×109 /L接种到BMG（5.0 mm×1.5 mm×1.5 mm）材料上，体外培养7 d，制备成B-MSCs/BMG复合体。
骨缺损模型的制备与修复：100 g/L水合氯醛腹腔麻醉后（3 mL/kg），无菌暴露左侧桡骨中段按照长骨缺损临界值[4]制成5 mm节段性缺损[实验过程中测量其桡骨中段直径为（2.0±0.5）mm]，MSCs/BMG复合体治疗组缺损处植入MSCs/BMG复合体，单纯BMG治疗组缺损处植入单纯BMG（BMG由完全培养液同等条件下培养7 d），单纯B-MSCs治疗组缺损处植入单纯MSCs（Brd-U标记的第3代MSCs，密度1×109 /L），均不做内外固定，逐层缝合伤口。术后每日观察动物情况并肌注2万U庆大霉素，连续3 d。
评估方法和标准：①放射线检测：术后2，4，8，12周麻醉下行左侧前肢正侧位X射线检查。X射线片按照文后参考文献[5]的评分标准评分。②组织学检测：术后2，4，8，12周截取修复部位标本，40 g/L多聚甲醛固定，脱水透明、石蜡包埋、每个标本前、中、后部均连续做5张厚度为0.5 μm切片（MSCs/BMG复合体治疗组与单纯BMG治疗组的8，12周标本固定后脱钙）。行苏木精-伊红染色，光学显微镜下观察组织结构与细胞形态并按照Nilsson等[6]组织学评分标准对各组标本进行组织评分。③免疫组织化学检测：2，4，8周标本采用免疫组织化学方法检测修复组织细胞中Brd-U的表达以此鉴定新生骨组织的细胞来源。
主要观察指标：①实验动物大体观察。②大鼠骨髓间充质干细胞体外培养情况。③各组术后各时间段骨缺损区X射线片观察结果。④组织学检测结果。
统计学分析：由第一作者使用SPSS 13.0软件包彩用多个样本均数的两两比较的q检验件进行方差分析。数据均用_x±s来表示。

2.1 实验动物数量分析除MSCs/BMG复合体治疗组有1只大鼠因麻醉过深死亡外，其余大鼠于术后2 h完全清醒，术肢跛行，饮食比先前稍有减少；1 d后术肢跛行减轻，饮食基本恢复正常。伤口无红肿、渗出现象，一周后均Ⅰ期愈合，饮食及活动完全恢复正常。59只大鼠进入结果分析，其中MSCs/BMG复合体治疗组术后2周大鼠为4只。
2.2 大鼠骨髓间充质干细胞体外培养情况倒置显微镜下观察，原代MSCs：刚接种到培养瓶时，培养液中悬浮大量的圆形细胞。48 h首次换液弃去未贴壁细胞，所留下的贴壁细胞大多为MSCs，其数量较少，细胞呈短梭形、椭圆形；培养5 d时，瓶底有大量的细胞集落形成，贴壁细胞数量明显增多，逐渐融合成片，细胞形态呈较为均一的长梭形，生长活跃，细胞核及核仁清晰；10 d时细胞间融合基本铺满瓶底，呈单层细胞片，细胞呈漩涡状排列。传代细胞形态与原代细胞没有明显变化，融合成单层的时间平均为7.0~8.0 d，较原代细胞快。第3代MSCs培养24 h时，细胞数量未见增加，此期为细胞的适应期。48 h细胞数量开始增多，72 h细胞进入快速生长期。到8 d时细胞进入平台期，细胞增殖速度减慢。
2.3 各组术后各时间段骨缺损区X射线片表现 ①MSCs/BMG复合体治疗组：术后2周桡骨缺损处略见骨痂形成，影像呈薄云雾状（图1a）。术后4周缺损区两端可见明显的新生骨痂（图1b）。术后8周整个缺损区均可见新生骨痂且新骨密度增高，明显形成骨缺损区的桥接（图1c）。术后12周骨缺损区完全被新生骨组织填充，影像基本与自体骨一致，已有骨髓腔出现。②单纯BMG治疗组：术后2周骨缺损区无明显变化（图2a）。术后4周仅在两断端有少量的云雾状骨痂形成（图2b）。术后8周缺损区仍然是仅在两断端有少量的云雾状骨痂形成，缺损区中央部分仍无明显骨形成影像（图2c）。术后12周骨缺损区骨痂形成增多，但仍未出现桥接，并可见两端有骨质硬化现象。单纯MSCs治疗组：术后2，4周骨缺损处未见骨性修复，术后8周骨两断端有云雾状表现，术后12周可见两断端有骨质硬化现象，最后形成骨不连。各组放射学评分见表1。

2.4 组织学检测结果苏木精-伊红染色：术后2周：各组组织内均可见充血水肿、大量的淋巴细胞与中性粒细胞浸润等明显的炎性反应现象，但MSCs/BMG复合体治疗组大部分MSCs还未向成骨细胞转化，仍呈成纤维样细胞，与材料相接处有少量的成骨细胞出现（图3）。术后4周：MSCs/BMG复合体治疗组移植物内开始有新生微血管生成，材料部分已经降解，材料空隙内可见新生的类骨质形成，类骨质内存在大量的成骨细胞，细胞肥大，细胞排列紧密，并出现骨陷窝，炎性反应明显减轻（图4）。而单纯治疗组缺损处除有结缔组织长入外，没有明显的成骨痕迹。术后8周：缺损区材料大部分已经降解，血管丰富，几乎看不到炎性反应。单纯BMG治疗组出现少量的骨样组织，大部分仍为纤维组织，单纯MSCs治疗组缺损处几乎全部被纤维组织填充。MSCs/BMG复合体治疗组可见大量的编织骨样组织，形成小梁样结构，含有大量的成骨细胞、骨细胞，出现较完整的成熟骨组织结构（图5）。

术后12周：材料已完全降解，单纯BMG治疗组部分出现小梁样结构，但大部分仍是纤维组织，单纯MSCs治疗组缺损处仍无成骨组织；MSCs/BMG复合体治疗组已经形成板层骨样结构，髓腔已形成。各组组织学评分见表2。
Brd-U的免疫组织化学检测结果：MSCs/BMG复合体治疗组：术后2，4，8周Brdu免疫组织化学染色可见组织内有细胞核呈棕黄色的细胞（图6），但随着时间的延长阳性细胞数量有所减少。单纯BMG治疗组呈阴性；单纯MSCs治疗组术后2周可见大量阳性细胞，术后4周阳性细胞明显减少，但是在两断端附近阳性细胞数明显多于缺损处，术后8周几乎看不到阳性细胞表达。

3.1 骨髓间充质干细胞的研究 MSCs具有多向分化潜能，在特定的诱导条件下可以定向分化为多种间质细胞，实验已证实BMP可以增强MSCs向成骨细胞分化[7]。但鉴定MSCs，目前尚无特异性的标志物，通常采用其特征形态以及分化为其他间质细胞系的功能来鉴别[8]。从本实验培养的细胞形态和植入后实验组的成骨性能看与其他报告一致，证实为MSCs。为了减少移植免疫排斥反应，在构建骨组织化骨时目前大都采用自体MSCs作为种子细胞。本实验选择异体MSCs作为种子细胞，在实验过程中未发现明显的免疫排斥反应，这可能与MSCs的免疫耐受有关[9]。Brd-U免疫组织化学结果显示，移植后的MSCs成活率高，加之MSCs取材方便，易于培养等优点，异体MSCs可作为骨组织工程中的种子细胞的来源。
3.2 BMG的选择本实验采用牛松质骨制成的完全脱钙骨基质明胶作为细胞支架，是因为BMG不但具备良好的骨传导性和骨诱导能力而且经过一系列的物理化学处理,其抗原性降低到极点[10]。本文实验组和对照组均未见明显的免疫排斥反应。本实验室曾对BMG的孔径以及孔隙率作了体式学的测量，孔径为（214.5±47.3）μm，孔隙率约为80%，根据Dennis等[11]的实验结论，这个范围最适宜细胞生长。本实验结果证实异种BMG免疫排斥反应弱，组织相容性良好，加上其来源不受限制，制备经济，因此可作为骨组织工程化骨的载体。
3.3 组织工程化骨的修复作用本实验采用了3种不同的形式对大鼠桡骨缺损进行了修复，为了保证实验的科学性，尽量排除多因素的干扰。如：为了排除培养液对成骨的影响，我们采用实验组和对照组都用完全培养液同等条件下孵育同等时间。从本实验的结果来看，MSCs/BMG复合体治疗组修复效果最好，单纯BMG治疗组次之，单纯B-MSCs治疗组最差。这说明单纯的MSCs虽然有成骨能力，但不能修复节段性骨缺损，这与Tsuchida等[12]报道一致；单纯的BMG虽然可以修复骨缺损，但是效果远没有MSCs/BMG复合体好。
早在1977年Green等[13]就预言有可能在一种新型的生物相容性材料上种植细胞并形成能够被移植成骨的新组织。Vacanti等[14]用成骨细胞与PDA复合培养构建工程化骨，发现有新骨生成。Perka等[15]发现这种工程化骨对骨缺损有很好的修复作用，Orii等[16]在实验中证明，β-TCP复合骨髓基质干细胞诱导的成骨细胞可以形成完整的骨块。这是因为三维载体材料可以为植入细胞提供并保持一个生长的空间微环境，促使细胞的增殖分化，从而加速对缺损的重建[17]。Shang等[18]通过实验证实新生骨组织是由工程化骨中的种子细胞形成的，这与本实验的Brd-U标记的结论相符。本实验结果显示实验组各时间段的成骨效果均优于对照组。单纯的BMG虽然可以对缺损局部存在的正常MSCs提供支架和生长的空间，也可以在BMP的诱导下定向分化为成骨细胞，但是其数量太少，无法满足成骨要求，成骨与材料的吸收速率失调。骨组织的重建时一个系列性的复杂过程，首先需要把种子细胞植入或者招募到缺损部位[19]，在局部微环境的成骨诱导下，向成骨性细胞分化，然后成骨细胞进一步发生至成骨细胞钙盐沉积到基质上[20]。
本实验的实验组大量复合到载体中的MSCs在BMP和缺损局部一些生长因子的诱导下，在BMG的微环境里成骨速率与材料的吸收速率基本一致，基本能够满足修复缺损的要求。

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