不同预湿方法对构建组织工程骨膜细胞黏附率的影响★
王军胜1，王栓科2，高恩建1，卢则陈1
课题背景：目前骨组织工程中对种子细胞与支架材料复合体修复骨缺损的研究较多，但仍无构建复合体的成熟技术，本课题已取得的成果：①骨髓间充质干细胞与骨基质明胶复合体体外构建时细胞的理想浓度；②复合体构建的骨缺损的修复效果。
应用要点：实验结果证实异种骨基质明胶与骨髓间充质干细胞复合构成的复合体，对骨节段性缺损有较好的修复作用，而且其抗原反应不明显，但在实验中发现材料吸收过快，如果进一步能改善异种骨基质明胶的性状，此材料与骨髓间充质干细胞的复合体可以为临床提供较好的植骨材料。
偏倚或不足：在实验室骨缺损模型制备的过程中，为了减少手术对实验动物的创伤，虽然严格按照骨缺损临界值要求造模，但每只动物骨缺损的位置仍不太一致，降低了实验的完整性。
1淮安市第二人民医院骨科，江苏省淮安市 223002； 2 兰州大学第二附属医院骨科， 甘肃省兰州市 730000
王军胜★，男，1974年生，甘肃省通渭县人，汉族，2007年兰州大学毕业，硕士，主治医师，主要从事骨组织工程研究。
nick121@sina.com
摘要
目的: 将经成骨诱导的兔骨髓来源的间充质干细胞与猪小肠黏膜下层复合，构建的组织工程骨膜,与天然骨膜在形态结构和功能上非常类似。实验着重观察不同预湿方法对构建的组织工程骨膜细胞黏附率的影响，为有效构建组织工程化骨膜奠定理论基础。
方法：实验于2005-09/2007-03在兰州大学附属第二医院骨科研究所完成。①实验材料：20 d的新西兰纯种兔2只。②实验过程及分组：取健康新西兰幼兔骨髓,密度梯度离心法分离骨髓间充质干细胞并进行体外扩增、诱导分化,然后与经过胎牛血清（实验组）、磷酸盐缓冲液（对照组）预湿处理的猪小肠黏膜下层复合构建组织工程骨膜，体外培养2周。③实验评估：计算贴附率、测定碱性磷酸酶活性,并用倒置显微镜、扫描电镜观察生长、分裂、增殖情况。
结果：①细胞贴附率：接种后5 h实验组细胞贴附率高于对照组[（57.34±2.23）%，（39.16±5.22）%，P < 0.01]；12 h实验组细胞贴附率高于对照组[（72.45±1.15）%，（54.47±3.46）%，P < 0.01]。②倒置显微镜观察：实验组比对照组更易黏附、伸展。③扫描电镜观察：复合培养第3天，实验组可见材料表面的细胞已完全伸展，附着在材料表面；对照组细胞大多呈不规则形，未完全伸展。培养7 d以后两组细胞差异不大。④碱性磷酸酶活性测定：复合培养第5，10，14天，实验组的碱性磷酸酶活性均明显高于对照组，差异有非常显著性（P < 0.01）。
结论：用胎牛血清预湿小肠黏膜下层,有利于提高接种效率,从而能更有效的构建组织工程骨膜。
关键词：组织工程骨膜；间质干细胞；小肠黏膜下层；组织构建
王军胜，王栓科，高恩建，卢则陈. 不同预湿方法对构建组织工程骨膜细胞黏附率的影响[J].中国组织工程研究与临床康复，2008，12(15):2806-2810 [www.zglckf.com/zglckf/ejournal/upfiles/08-15/15k-2806(ps).pdf]
中图分类号:R318
文献标识码:A
文章编号:1673-8225
(2008)15-02806-05
收稿日期：2007-09-13 修回日期：2008-11-26 (07-50-9-5021/W·Y)
Effect of different wetting methods on cellular adhesion during tissue-engineered periosteum fabrication
Abstract
AIM:Tissue engineered periosteum fabricated by porcine small intestinal submucosa (SIS) combined with rabbit bone marrow-derived mesenchymal stem cells (BMSCs), are similar to the natural periosteum in the morphology, structure and function. The study was designed to explore the cell attachment in process of constructing tissue-engineered periosteum by different wetting methods to determine the most effective method of fabricating tissue-engineered periosteum.
METHODS: The experiment was carried out in the Institute of Orthopedics, the Second Affiliated Hospital of Lanzhou University from September 2005 to March 2007.①Two New Zealand purebred rabbits, 20 days old, were used in this study.②Bone marrow was obtained from healthy rabbits, and BMSCs were isolated by using density gradient centrifugation for culture in vitro. After induction, BMSCs were seeded to SIS wetted with fetal bovine serum (experimental group) and pretreated with phosphate buffered saline (control group), to construct the tissue-engineered periosteum that was cultured for two weeks in vitro. ③The adhesion rates were calculated, and alkaline phosphatase (ALP) activity was detected after seeding. The growth, dissociation and proliferation of the cells were observed by inverted microscope and scanning electron microscope.
RESULTS: ①At 5 hours and 12 hours after seeding, the adhesion rates were higher in the experimental group than in the control group [(57.34±2.23)%, (39.16±5.22)%, P < 0.01; (72.45±1.15)%, (54.47±3.46)%, P < 0.01].②The inverted microscope confirmed that cells in the experimental group were easier adhesive than ones in the control group.③Scanning electron microscope results showed that, cells in the experimental group spread completely and adhered on the material surface; most of the cells in the control group were irregular on the third day of seeding. No obvious differences were found after 7 days.④ALP activity of the BMSC-SIS complex in the experimental group were higher significantly than that in the control group (P < 0.01).
CONCLUSION: The SIS pretreated with fetal bovine serum can improve the seeding efficiency and facilitate the fabrication of tissue-engineered periosteum.
Wang JS, Wang SK, Gao EJ, Lu ZC. Effect of different wetting methods on cellular adhesion during tissue-engineered periosteum fabrication.Zhongguo Zuzhi Gongcheng Yanjiu yu Linchuang Kangfu 2008;12(15):2806-2810(China)
[www.zglckf.com/zglckf/ejournal/upfiles/08-15/15k-2806(ps).pdf]
0 引言
骨髓间充质干细胞是骨组织工程理想的种子细胞[1-5]，猪小肠黏膜下层是理想的支架材料[6-10]，将二者复合，构建组织工程骨膜成为可能[11-12]，这将为骨缺损的治疗提供了一种全新的思路和方法。基于材料表面的黏附与细胞生长、增殖、分化和组织发育密切相关,黏附率及其强度可影响工程组织的最终结构与功能[13],因此有必要研究细胞在材料表面的黏附行为,并通过改变细胞的黏附强度来实现对细胞生长的调控。本实验着重探索小肠黏膜下层不同的预湿方法对种子细胞黏附率的影响，为有效构建组织工程化骨膜奠定理论基础。
1 材料和方法
设计：对比观察。
单位：兰州大学附属第二医院骨科。
材料：实验于2005-09/2007-03在兰州大学附属第二医院骨科研究所完成。主要试剂和仪器：DMEM培养基、地塞米松、维生素C、β-甘油磷酸钠（均为sigma公司，美国），胰蛋白酶（Gibco公司，美国），胎牛血清(杭州四季青)，Percoll分离液(Pharmacia公司)，24孔培养板（Corning Incorporated, USA）。倒置相差显微镜（日本Olympus公司）,扫描电镜（JSM-680LA,日本），冻干机（Heto. Power Dry LL 3000，Heto-Holten, Denmark）。20 d的新西兰纯种兔2只（由兰州生物制品研究所提供，许可证号：医动字第14-004号）。
设计、实施、评估者：设计、评估者为第一、二作者，实施者为全部作者，均受过培训。
技术路线：
兔骨髓间充质干细胞的分离与培养：生后20 d的新西兰纯种兔（由兰州生物制品研究所提供），麻醉后断颈处死，四肢脱毛（80 g/L硫化钠）、碘伏消毒后,在无菌条件下解剖并离断四肢长管状骨,取净骨膜并切除干骺端，标本放入含青霉素、链霉素各100 U/mL的磷酸盐缓冲液中漂洗数分钟。用无菌空针抽10 mL完全培养基反复冲洗骨髓腔,直至骨质变白。收集细胞悬液于离心管,吹打均匀，以1 000 r/min离心10 min,弃上清。以4 mL完全培养基重悬沉积物，并缓慢加入到预制等体积的Percoll分离液(密度1.073 g/L)中，3 000 r/min离心30 min。将云雾层吸入另一无菌离心管，用磷酸盐缓冲液洗涤 2次（各1 000 r/min，5min）。重悬细胞，以2×105接种于25 cm2培养瓶，加入完全培养基（含低糖DMEM，体积分数为0.1的胎牛血清，青、链霉素各100 U/mL）置于37 ℃、含体积分数0.05的CO2的孵箱中培养。72 h后首次全量换液，以后每隔3 d换液1次，至接种第10天细胞生长达80%~90%融合时，移除培养液，用1.25 g/L胰蛋白酶消化传代。
兔骨髓间充质干细胞的成骨诱导培养：消化收集第3代骨髓间充质干细胞，改用成骨诱导培养液（高糖DMEM，体积分数未0.1的胎牛血清，地塞米松1×10-8 mol/L。维生素C 50 mg/L，β-磷酸甘油钠10 mmol/L），置于37 ℃、含体积分数0.05的CO2的孵箱中培养，隔天换液，诱导第5天，细胞达80%融合，可做组织构建之用。
小肠黏膜下层的制备：
物理方法处理：封闭饲养的健康猪，杀后30 min内取小肠用40 ℃水反复冲洗，清除小肠内外壁黏附的物质。挑选管腔粗细均匀，管壁无破损及无淋巴结的肠段，用裹有湿纱布的的手术刀柄将浆膜和肌层沿小肠的纵轴褪下。翻转小肠，使黏膜面向外，用同样的方法将黏膜褪下。即得小肠黏膜下层，呈白色半透明的薄片状物，厚约100 μm（0.1 mm）。
化学方法处理：沿纵轴切开经物理方法处理的小肠，切成每段15 cm长，按Abraham方法[14]制备。化学方法处理过程的每一步均在室温下进行，材料与溶液体积的比例都保持在1∶100。①将机械方法制得的小肠黏膜下层浸泡在含有100 mmol/L乙二胺四乙酸和10 mmol/L氢氧化钠溶液中(pH值11.0~12.0)16 h。②用去离子水冲洗干净，置于含盐酸(lmmol/L)和氯化钠(lmmol/L)的溶液(pH值为0~1)中浸泡6~8 h。③用去离子水冲洗后在氯化钠 (1 mmol/L)磷酸缓冲液中浸泡16 h。④用去离子水冲洗后在磷酸盐缓冲溶液(pH值为7~7.4)中浸泡2 h。⑤再用去离子水冲洗基质2 h。⑥杀菌:将小肠黏膜下层在含体积分数为0.001的过氧乙酸的体积分数为0.2的乙醇溶液中浸泡8 h，用含0.5 g/L叠氮化钠的磷酸盐缓冲液清洗 2 h，然后程序性降温到-80 ℃，冻干后切成1 cm×1 cm大小，用无菌袋包装，γ射线照射(25~35 kGy)消毒。
组织工程骨膜的体外构建：
小肠黏膜下层的不同预处理：将制备好的大小为 1 cm×1 cm并经消毒处理的小肠黏膜下层置入两个24孔培养板，每孔1片，分成两组。实验组加入1 mL胎牛血清，对照组加入1 mL磷酸盐缓冲液。两个培养板均置于37 ℃、含体积分数0.05的CO2的孵箱中培养2 h后，吸去多余的液体，翻转培养板置于孵箱中至少5 h。
小肠黏膜下层与种子细胞的复合：消化收集已经诱导5 d的第3代细胞，离心，调整细胞密度为5×109 L-1，立即用微量移液器滴加到24孔板中的小肠黏膜下层上，每片10 μL并涂摸均匀。将培养板在37 ℃、体积分数为0.05的CO2、饱和湿度条件下静置5 h,再加入2 mL诱导培养液继续培养。
观测指标：①黏附率：细胞接种后5，12 h分别从各组取出五孔细胞组织复合物，用0.01 mol/L的磷酸盐缓冲液轻轻漂洗1遍后置于新的培养板中培养,对未贴附的细胞计数，计算细胞的黏附率：黏附率=[（接种细胞总数-脱落细胞数）/接种细胞总数]×100%。②形态学检查：逐日在倒置显微镜下观察细胞在生物材料上附着及生长情况；复合培养第3，7天将培养孔内生物材料取出，25 g/L戊二醛固定,系列丙酮中脱水,乙酸异戊酯置换，临界点干燥,表面喷金，扫描电镜观察骨髓间充质干细胞在小肠黏膜下层上的附着、生长、分裂、增殖情况。③碱性磷酸酶活性测定：分别在接种后第5，10，14天各取5块工程化组织并分别放入10 mL离心管中，磷酸盐缓冲液洗涤3次，加入裂解液（TritonX-100）， 孵育4 h,然后1 000 r/min离心5 min,取上清液，加入新鲜配制的碱性磷酸酶底物，置37 ℃水浴箱内1 h，405 nm波长下检测光吸收值。
主要观察指标：①细胞贴附率。②倒置显微镜观察。③扫描电镜观察。④碱性磷酸酶活性测定。
统计学分析：所得数据以_x±s表示，由第一作者使用SPSS10.0统计软件进行分析，组间差异采用独立样本t检验，以P < 0.05为差异具有显著性意义。
2 结果
2.1 细胞贴附率 接种后5 h两组细胞贴附率分别为实验组（57.34±2.23）%，对照组（39.16±5.22）%；接种后12 h实验组为（72.45±1.15）%，对照组为（54.47±3.46）%，经统计学处理表明，组间差异均有非常显著性意义（P < 0.01）。见图1。
2.2 倒置显微镜观察细胞在小肠黏膜下层上附着及生长情况 复合后4 h可见对照组细胞呈圆形散布于小肠黏膜下层上，细胞体积较小，细胞数较少，与复合当时情况几乎相同，见图2；培养板底壁有多量已经贴壁的细胞。实验组部分细胞开始伸展，由圆形变成短梭形，体积增大，部分呈不规则形，见图3。12 h后对照组膜上仍可见部分细胞清晰的轮廓，形态不规则，实验组膜上轮廓清晰的细胞很少，（因膜较厚，细胞伸展后与膜重叠在一起）。
2.3 扫描电镜观察细胞在小肠黏膜下层上生长、分裂、增殖情况 复合培养第3天的组织工程骨膜，实验组可见材料表面的细胞已完全伸展，附着在材料表面，呈长梭形或不规则形状，细胞间连接较少，部分细胞深入孔隙，胞体表面有许多颗粒状物，可见微丝形成，见图4；对照组细胞大多呈不规则形，未完全伸展，胞体表面亦呈颗粒状,大多数看不到明显的微丝，并见数量不等的类球形物质，表面光滑，黏附于纤维丝表面，见图5；培养7 d以后两组细胞均明显增多，形成细胞间连接，差异不大，见图6。
2.4 碱性磷酸酶活性测定 骨髓间充质干细胞与小肠黏膜下层复合后第5，10，14天，实验组的碱性磷酸酶活性均明显高于对照组，差异有非常显著性（P < 0.01）。见表1。
3 讨论
在组织工程化骨或骨膜的构建过程中，支架材料必先经预湿处理，使其含有一定的水量。适当的含水量，不仅可使材料重现原有的三维空间结构，适于细胞黏附、增殖和分化，还有利于支架材料在体内降解。有研究显示，未经预湿处理的材料在植入骨缺损12周后，虽然皮质完全连续,但中心部分仍有较多的材料存留,影响了骨再生及重建的进行[15]。当然，不同的预湿方法对种子细胞的黏附、增殖和分化的影响，也明显不同。Garcia等[16]研究表明,用Ⅰ型胶原包被湿化材料,常可提高材料的生物活性,促进细胞黏附。Hu等[17]用多聚赖氨酸处理支架材料，结果细胞黏附率明显提高。本实验采用磷酸盐缓冲液和胎牛血清预湿小肠黏膜下层,观察其对细胞黏附的影响。结果显示,在细胞黏附率和碱性磷酸酶活性上，实验组均优于对照组，有非常显著的差异(P < 0.01)。
胎牛血清含有丰富的细胞生长所必要的营养成分[18]。它在细胞接种后的作用，大致有以下几点。①保护细胞免受损伤：胎牛血清中的a2巨球蛋白，可抑制细胞消化时剩余的胰蛋白酶；血清的高粘稠度可保护细胞免受机械损伤。②促进细胞黏附：血清中的纤维粘连素为细胞外基质，可促进细胞黏附；胎球蛋白亦可促进细胞附着。③促进细胞增殖：多种生长因子，尤其血小板促生长因子能促进细胞分裂,是主要的促进细胞增殖因子。另外，血清中的胰岛素,能促进细胞摄取葡萄糖和氨基酸,与促细胞分裂有关；类胰岛素生长因子,能与细胞表达的胰岛素受体结合,从而具有与胰岛素相同的作用；促生长激素,具有细胞增殖的效应。胎牛血清中的氢化可的松,可能兼有促细胞贴附和增殖并诱导其分化作用。
为了便于骨髓间充质干细胞与小肠黏膜下层黏附，需要在复合后不加培养液的情况下静置4~6 h。本实验结果表明，在这段时间里，经胎牛血清预湿的小肠黏膜下层，细胞的黏附率明显增加，而且细胞更易伸展。这与胎牛血清的作用密不可分。焦强等[19]的研究也证实,胎牛血清可明显促进间充质干细胞的增殖，且增殖作用随胎牛血清浓度增高而增加。叶晓峰等[20]用不同方法处理去细胞猪主动脉瓣，结果显示，多聚赖氨酸和胎牛血清预处理均明显提高大鼠主动脉肌成纤维细胞在去细胞猪主动脉瓣上的黏附，但胎牛血清较多聚赖氨酸更为有效。高黏附率使种子细胞的增殖和组织工程化骨膜的成熟也明显加快，碱性磷酸酶活性在复合后第5天已明显高于对照组，以后一直上升，增幅较大。对照组虽有上升，但增幅较小。可见，用胎牛血清预湿小肠黏膜下层可以提高种子细胞的黏附率，提高接种效率。
经磷酸盐缓冲液预湿的小肠黏膜下层，在复合后5 h内，细胞的黏附率较低，培养板底部有较多贴壁细胞，且膜上细胞的体积较小，这可能与部分水分的散失有关(在不格外添加培养液的情况下水分易丢失) 。因为在静置接种时，为了提高接种率，重悬细胞的培养液就不能太充分，培养液过多，则细胞易于弥散至小肠黏膜下层以远；过少，又易引起细胞缺水和酸中毒。但胎牛血清却具有缓冲酸碱度的作用，这也是实验组接种率高的原因之一[21]。因此，用恰到好处的培养液重悬细胞，无疑可提高接种效率，这是构建组织工程骨膜过程中的又一棘手问题。
值得一提的是，预湿时，同样应使材料的含水量适当，过多的含水量，会使细胞悬液外溢，影响接种率。本实验在预湿2 h后，将培养板翻转，置孵箱5 h以上，使多余的液体积聚于翻转培养板的底面，既保证了适当的含水量，又避免了传统做法用吸水纸吸水的繁琐和增加污染危险，值得推广。
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