脱氢表雄酮对体外培养大鼠成骨细胞和骨保护素的影响*★

杨建芬1，孙宜萍1，李蔚1，朱国英2，王莉华2

课题背景：脱氢表雄酮是人体肾上腺素皮质分泌的一种甾体类物质，随年龄增加而明显下降，与骨质疏松的发生有一定的关系。目前关于脱氢表雄酮对成骨细胞调控作用的研究报道较少。

应用要点：实验结果显示，脱氢表雄酮可能直接作用于成骨细胞及通过增加骨保护素的表达，促进了成骨细胞的增殖作用。提示适当浓度的脱氢表雄酮可以促进骨形成并达到与雌二醇无显著差别的水平；无论是对成骨细胞增殖还是对于碱性磷酸酶活性，最佳浓度均是1×(10-7~10-9)mmol/L，而高浓度水平1×10-5 mmol/L并不利于成骨细胞增殖。

术语解析：脱氢表雄酮是20世纪的重要发现之一。不同性别者体内脱氢表雄酮通过生物酶的作用，可转化成雄烯乙醇、睾酮、雌二醇、雌酮等不同激素，脱氢表雄酮具有助于维持正常人体内分泌环境，保持正常机体体能和性功能，防止骨质疏松等作用。

1上海交通大学附属第六人民医院老年科，上海市200233;2上海复旦大学放射医学研究所，上海市 200032

杨建芬★，女，1966年生，上海市人，汉族，苏州大学在读硕士，主治医师，主要从事老年病学研究。
yangjianfen@medmail.com.cn

通讯作者：孙宜萍，主任医师，硕士生导师，上海交通大学附属第六人民医院老年科，上海市 200233
sunyipings@yahoo.
com.cn

摘要
背景: 脱氢表雄酮主要来自肾上腺皮质，在相关外周组织中转化为雄激素或雌激素而发挥间接的生物学作用。
目的：实验拟验证脱氢表雄酮促进成骨细胞增殖的作用及其机制。
设计、时间及地点：分组对照观察，于2006-01/2007-02在上海交通大学附属第六人民医院和上海复旦大学放射医学研究所合作完成。
材料：1日龄SD新生大鼠10只，雌雄不拘。脱氢表雄酮为美国Sigma公司产品。
方法：体外分离培养SD大鼠成骨细胞，取传1代细胞，分别给予(1×10-5，1×10-7，1×10-9) mmol/L 脱氢表雄酮培养72 h，以1×10-8 mmol/L雌二醇为阳性对照，另设空白对照组。
主要观察指标：以细胞形态学和碱性磷酸酶染色进行成骨细胞鉴定。应用光镜、四甲基偶氮唑盐法检测细胞的生长和增殖。茜素红染色观察成骨细胞矿化结节形成功能；同时双抗体夹心ABC-ELISA法测定不同浓度脱氢表雄酮培养液中对骨保护素浓度的影响。
结果：①原代培养细胞碱性磷酸酶染色成阳性鉴定为成骨细胞。②不同浓度脱氢表雄酮组成骨细胞增殖能力均有上升，其中以1×10-7 mmol/L脱氢表雄酮组最显著（P < 0.01），其作用和雌二醇相似(P > 0.05)。③不同浓度脱氢表雄酮组碱性磷酸酶的活性均升高，亦以1×10-7 mmol/L 脱氢表雄酮组最显著（P < 0.01），1×10-7 mmol/L,1×10-9 mmol/L 脱氢表雄酮的作用和雌二醇和相似(P > 0.05)。④1×10-9 mmol/L 脱氢表雄酮组单位细胞数的碱性磷酸酶活性高于空白对照组(P < 0.05)。⑤不同浓度脱氢表雄酮组矿化面积及矿化面积比均有显著增加（P < 0.01），其作用和雌二醇相似。⑥1×10-9 mmol/L脱氢表雄酮组培养72 h时骨保护素反应最活跃（P < 0.01），与成骨细胞增殖能力呈正相关。
结论：脱氢表雄酮能够促进SD大鼠成骨细胞生长和增殖，浓度适当时与雌二醇无显著差别，最佳浓度为1×（10-7~ 10-9）mmol/L，其作用可能与刺激骨保护素因子有关。当浓度升高至1×10-5 mmol/L时，并不利于成骨细胞的增殖。
关键词：硫酸脱氢表雄酮；成骨细胞；骨保护素；组织构建

杨建芬，孙宜萍，李蔚，朱国英，王莉华. 脱氢表雄酮对体外培养大鼠成骨细胞和骨保护素的影响[J].中国组织工程研究与临床康复，2008，12(15):2815-2819 [www.zglckf.com/zglckf/ejournal/upfiles/08-15/15k-2815(ps).pdf]

中图分类号:R329.471
文献标识码:A
文章编号:1673-8225
(2008)15-02815-05

BACKGROUND: Dehydroepiandrosterone (DHEA) derived from adrenal cortex has an indirect bioeffect through differentiating into androgen or estrogen in the related peripheral tissues.
OBJECTIVE: To verify the effects and mechanisms of DHEA on promoting osteoblasts (OBs) proliferation.
DESIGN, TIME AND SETTING: The grouping controlled experiment was accomplished in Shanghai Sixth People's Hospital affiliated to Shanghai Jiao Tong University and Institute of Radiation Medicine, Fudan University from January 2006 to February 2007.
MATERIALS: Ten SD rats were recruited, 1 day old, regardless of gender. DHEA was the product of American Sigma Company.
METHODS: Rat OBs were separated and cultured in vitro. First generation of OBs cultured in a varied concentrations of DHEA (1×10-5, 1×10-7 and 1×10-9 mmol/L) for 72 hours were set up as the experiment group, while those exposed to 1×10-8 mmol/L of estradiol culture were regarded as positive controls and blank control group was set up as well.
MAIN OUTCOME MEASURES: The OBs were identified by cell morphology and alkaline phosphatase (ALP) dyeing. Light microscope and methyl thiazolyl tetrazolium assay were used to detect the growth and proliferation of OBs. The formation of mineralized nodus was examined by alizarin bordeaux stain. The concentrations of osteoprotegerin in DHEA culture solution were also measured by double antibody sandwich ABC-ELISA simultaneously.
RESULTS: ①Identification of primarily cultured OBs showed ALP dyeing was positive.②Proliferation rate of OBs was increased in experiment groups compared with that of the blank control group, and the most significant increase occurred in the concentration of 1×10-7 mmol/L DHEA culture (P < 0.01). However, there was no significant difference in proliferation rate between estradiol culture and DHEA group (P > 0.05).③ALP activity in experiment groups was higher, especially in the group with the concentration of 1×10-7 mmol/L DHEA (P < 0.01). No significant differences were seen in the ALP activity between estradiol culture and DHEA groups with concentration of 1×10-7 and 1×10-9 mmol/L (P > 0.05).④ALP activity of unitary cell population was higher in 1×10-9 mmol/L DHEA culture group than that in blank control group (P < 0.05).⑤Both the area and area ratio of mineralized nodules were significantly increased in various concentrations of DHEA groups (P < 0.01), which was similar to that of estradiol culture.⑥Responds of osteoprotegerin to DHEA were the most active in 1×10-9 mmol/L DHEA group after 72 hours of the culture (P < 0.01), and had a positive correlation with OBs proliferation.
CONCLUSION: DHEA may promote growth and proliferation of rat OBs, its effect at the optimal concentration of 1×(10-7- 10-9) mmol/L is identical with estradiol, and might be related to stimulating osteoprotegerin pathway DHEA at the concentration exceeding 1×10-5 mmol/L has no effect on OBs proliferation.

Yang JF, Sun YP, Li W, Zhu GY, Wang LH. Effects of dehydroepiandrosterone on in vitro cultured osteoblasts and osteoprotegerin in rats.Zhongguo Zuzhi Gongcheng Yanjiu yu Linchuang Kangfu 2008;12(15):2815-2819(China)
[www.zglckf.com/zglckf/ejournal/upfiles/08-15/15k-2815(ps).pdf]

脱氢表雄酮主要来自肾上腺皮质，在相关外周组织中转化为雄激素或雌激素而发挥间接的生物学作用[1-2]。近年来有人主张采用脱氢表雄酮治疗老年骨质疏松症，但结果报道不一[3-7]。骨密度主要取决于在人体骨骼中骨形成细胞（成骨细胞）和骨吸收细胞（破骨细胞）代谢的平衡状态。成骨细胞是促进胶原蛋白和其他骨蛋白合成的细胞对骨矿化有重要作用[8-10]。同时研究发现，骨保护蛋白是肿瘤坏死因子受体超家族成员之一，骨保护素不仅涉及骨重塑、免疫调节、血管的发生等过程，而且是影响破骨细胞分化、生成及活性的最终途径，在骨质疏松的发生机制中扮演着重要的角色[11-13]。脱氢表雄酮对骨密度的影响是否通过骨保护素调控成骨细胞的增殖是悬而未决的问题。本实验在体外培养SD大鼠成骨细胞的基础上，观察不同浓度脱氢表雄酮对成骨细胞生长、增殖的作用，以及在有效浓度内脱氢表雄酮对骨保护素表达的影响。以期探讨脱氢表雄酮对成骨细胞增殖的作用和机制。

设计：分组对照观察。
时间及地点：实验于2006-01/2007-02由上海交通大学附属第六人民医院老年科和上海复旦大学放射医学研究所合作完成。
材料：1日龄SD新生大鼠10只(复旦大学放射医学研究所动物房,合格证34)，雌雄不拘。MEM培养基干粉为GIBCO BRL U.S.A产品；胎牛血清为GIBCO BRL U.S.A产品；胶原酶Ⅱ为Sigma公司产品；胰蛋白酶为华美生物工程公司产品；脱氢表雄酮为美国Sigma公司产品,配成浓度为1×10-5，1×10-7，1×10-9 mmol/L；碱性磷酸酶染色试剂盒为Sigma公司产品；大鼠骨保护素定量Elasa试剂盒由美国A&R公司提供,西康生物科技有限公司分装。
技术路线：
大鼠成骨细胞分离培养与鉴定：
成骨细胞分离培养：采用机械分离加酶消化法。出生24 h内的SD大鼠10只，切下颅盖骨，去骨膜，磷酸盐缓冲液反复冲洗后将骨组织剪碎，2.5 g/L胰蛋白酶5 mL 37 ℃预消化20 min。弃消化液，将骨片移入含1 g/L Ⅱ型胶原酶10 mL的安玻瓶中，37 ℃恒温水浴振荡消化 60 min。移取消化液，离心弃上清，加入适量培养液，制成细胞悬液混匀，以1.2×104/cm2接种于25 cm2培养瓶，置体积分数为0.05的CO2，37 ℃条件下培养至细胞汇合后，2.5 g/L胰蛋白酶消化，1.2×104/cm2分瓶接种于25 cm2培养瓶，继续培养，汇合后用于测定成骨细胞的增殖及功能等。
成骨细胞鉴定：采用碱性磷酸酶染色，偶氮偶联法。底物、显色剂与缓冲液按1∶1∶50比例混合配制孵育液，接种在玻片上的细胞培养1周，25 g/L戊二醛4 ℃ 固定 7 min，蒸馏水冲洗，浸入孵育液，37 ℃条件下孵育 60 min，蒸馏水冲洗，凉干，中性树胶封固，光镜观察、摄片。
矿化结节染色（茜素红法）：汇合后的成骨细胞经含抗坏血酸、β-甘油磷酸钠矿化诱导液培养，形成不透光的矿化结节，茜素红染色鉴定。光镜下观察。以红染,边界清晰,周围有明显细胞堆积，短径大于100(20)μm 的标准, 低倍镜下计数每个视野下的矿化结节数。
指标观察方法：
成骨细胞增殖能力：采用四甲基偶氮唑盐法。成骨细胞1.25×106 L-1×200 μL/孔接种于96孔细胞培养板，培养24 h后，分为空白对照组、1×10-8 mmol/L雌二醇阳性对照、1×10-5，1×10-7，1×10-9 mmol/L 脱氢表雄酮组。培养72 h，弃上清液，每孔加无血清MEM培养液100μL，四甲基偶氮唑盐10 μL，37 ℃ 孵育4 h，加入200 g/L的十二烷基硫酸钠150 μL，37 ℃温育2 h，以酶标仪570 nm波长检测吸光度值表示成骨细胞的增殖能力。
成骨细胞碱性磷酸酶活性（PNPP法）：以上5组，培养72 h，弃上清液，磷酸盐缓冲液冲洗，每孔加PNPP底物150μL，37 ℃ 孵育30 min，加入0.2 mol/L的NaOH 50 μL终止反应，酶标仪405 nm波长检测吸光度值（A），样品A值表示碱性磷酸酶活性。以碱性磷酸酶的A值 /四甲基偶氮唑盐的A值比值表示单位细胞数碱性磷酸酶活性。
成骨细胞矿化结节形成功能：采用茜素红染色。成骨细胞2.5×106 L-1×2 mL/孔接种于24孔细胞培养板，分为5组。培养至完全汇合后换成含10%矿化诱导液的培养液继续培养，每2天换液1次，继续培养3周，吸弃培养液，磷酸盐缓冲液洗涤2次，体积分数为0.95的乙醇固定，弃乙醇，磷酸盐缓冲液洗涤2次，加入2 g/L茜素红染液染色，自来水轻轻冲洗，光镜下观察。以红染,边界清晰,周围有明显细胞堆积，短径大于20 μm 的标准, 低倍镜下计数每个视野下的矿化结节数并计算矿化结节面积占整个视野的百分比。
大鼠骨保护素定量测定:采用酶联接免疫吸附法。大鼠成骨细胞1.25×106 L-1×200 μL/孔接种于48孔细胞培养板，分为各浓度组，培养24，48，72 h后，采用双抗体夹心ABC-ELISA法，在492 nm处测各标本中骨保护素浓度A值。
主要观察指标：①成骨细胞形态学分析。②不同浓度脱氢表雄酮对成骨细胞碱性磷酸酶活性、增殖能力、矿化结节形成功能的影响。③不同浓度脱氢表雄酮对骨保护素细胞因子的影响。
设计、实施、评估者：实验设计为第二、四作者作，实施为第一、三、五作者，评估为第二、四作者，均受过培训。
统计学方法：数据以_x±s表示，由第一、三作者采用SPSS 10.0统计软件进行方差分析及相关性分析。

2.1 统计描述成骨细胞形态学分析：倒置显微镜下，原代细胞培养第2天，见成骨细胞贴壁展开呈多种形态。培养3~5 d，细胞体积增大，见较多细胞分裂相；胞浆丰富，伸出多个伪足，细胞半融合。培养1周左右，细胞融合成铺路石状。成骨细胞的鉴定：碱性磷酸酶染色成阳性，可见胞质内蓝紫色阳性颗粒，核不着色，位于细胞一侧，可见一两个核仁。以胞浆呈明显蓝紫色颗粒为阳性细胞，无着色或和背景一致为阴性细胞。原代培养的细胞纯率超过90%，符合本实验的要求。见图1。
2.2 统计推断
2.2.1 不同浓度脱氢表雄酮对成骨细胞碱性磷酸酶活性、增殖能力的影响：见表1。
与对照组相比，1×10-5 mmol/L脱氢表雄酮组碱性磷酸酶活性和成骨细胞增殖能力均差异无显著性（P > 0.05），1×10-7 mmol/L脱氢表雄酮组碱性磷酸酶活性和成骨细胞增殖能力最高（P < 0.01）。1×10-7 mmol/L， 1×10-9 mmol/L脱氢表雄酮组和雌二醇组相比碱性磷酸酶活性相仿（P > 0.05）。

雌二醇组、1×10-7 mmol/L、1×10-9 mmol/L脱氢表雄酮组单位细胞数碱性磷酸酶活性均有升高，以1× 10-9 mmol/L脱氢表雄酮组升高最显著（P < 0.05）优于雌二醇组。
2.2.2 不同浓度脱氢表雄酮对成骨细胞矿化结节形成功能的影响见表2。

1×10-5，1×10-7及1×10-9 mmol/L 脱氢表雄酮组与对照组相比矿化面积及矿化面积比显著增加（P < 0.01），与雌二醇组相仿。各组矿化结节照片见图2，图3，图4。

大鼠成骨细胞接种培养于各浓度组24，48，72 h后，发现不同浓度脱氢表雄酮和雌二醇对骨保护素的表达与对照组比较均有显著差别，均呈上升趋势。培养24 h时，雌二醇组骨保护素呈上升趋势；72 h时脱氢表雄酮 1×10-9 mmol/L组显著上升，与雌二醇组相仿，分别将成骨细胞碱性磷酸酶和增殖能力与脱氢表雄酮1× 10-9 mmol/L组72 h时骨保护素作相关性分析，发现骨保护素(OPG)与成骨细胞碱性磷酸酶(ALP)呈线性正相关，ALP=0.50+0.003 1 OPG，r2=0.87，P=0.006；与增殖能力(WSP)呈线性正相关，WSP=0.31+0.004 6 OPG，r2=0.89，P=0.001。以脱氢表雄酮1×10-9 mmol/L浓度组相关性最显著（P < 0.01）。见图5，图6。

脱氢表雄酮作为体内性激素的前体物质，是人体肾上腺素皮质分泌的一种甾体类物质，随增龄而明显下降与骨质疏松的发生有一定的关系[14-16]。
由于原代培养的成骨细胞在体外实验中比人成骨细胞株更具有代表性[17]，因此，本实验采用了原代培养的成骨细胞作为研究对象，同时选用SD大鼠头盖骨分离培养的成骨细胞进行实验。碱性磷酸酶染色鉴定了原代分离培养的成骨细胞，纯率在90% 以上，符合实验的要求。
关于脱氢表雄酮对成骨细胞的影响，本实验结果观察显示，成骨细胞经各浓度组脱氢表雄酮培养后，成骨细胞贴壁展开呈较多细胞分裂相，培养1周左右，细胞数明显增多。成骨细胞的鉴定：碱性磷酸酶染色成阳性。提示脱氢表雄酮使成骨细胞代谢加快，细胞活性增强。低浓度（1×10-7和1×10-9 mmol/L）脱氢表雄酮组碱性磷酸酶活性、成骨细胞增殖力、单位细胞碱性磷酸酶活性、成骨细胞矿化结节形成功能均上升，且以1×10-7 mmol/L 脱氢表雄酮组更为显著，其作用和雌二醇组相仿，而高浓度脱氢表雄酮对碱性磷酸酶活性无影响。提示适当浓度的脱氢表雄酮可以促进骨形成并达到与雌二醇无显著差别的水平，都能使骨矿化物质在骨内沉积。脱氢表雄酮的正常生理浓度为0.001~0.03μmol/L,这和本实验结果无论是对成骨细胞增殖还是对于碱性磷酸酶活性，最佳浓度均是1×(10-7~10-9)mmol/L相一致，而高浓度水平1×10-5 mmol/L不利于成骨细胞增殖。
不同浓度脱氢表雄酮对骨保护素表达与对照组比
较均有显著差别，以1×10-9 mmol/L 脱氢表雄酮组更为显著。骨保护素与成骨细胞增殖能力均密切正相关。目前认为,多种细胞因子参与骨代谢[18]，其中RANKL-RANK-OPG 途径也是老年性骨质疏松的发生原因之一。动物和人体实验均显示,随年龄增长,骨组织、骨细胞的骨保护素mRNA 表达降低, RANKL 表达升高, 骨保护素与网状骨量成正相关[19]。综合脱氢表雄酮对成骨细胞的增殖作用，作者认为脱氢表雄酮可能直接作用于成骨细胞及通过增加骨保护素的表达，促进了成骨细胞的增殖作用。这为以后的动物实验和骨质疏松的临床应用提供了必要的实验依据。
但是，骨的形成是一个十分复杂的多因素过程, 许多激素和生长因子可以激活促进细胞的生长和增殖。虽然本实验结果显示, 脱氢表雄酮在体外能够增加大鼠骨保护素的表达，刺激成骨细胞增殖能力，然而，脱氢表雄酮在人体内是否有同样的效应？脱氢表雄酮有没有特异性受体，是否通过雌、雄激素受体介导促进成骨细胞的增殖[20]？需要进一步的研究，最终效果评测仍需要大量体内外实验验证。

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