构建组织工程气管上皮细胞和成纤维细胞联合培养的模式：

构建组织工程气管上皮细胞和成纤维细胞联合培养的模式：
与常规培养的比较*

王琳，姜威

课题背景：气管重建是气管外科学中的一个重要课题。许多学者尝试应用同种异体移植、自体组织移植以及人工材料替代物等方法，效果均不够理想。近年来，随着组织工程学的发展，有学者开始了组织工程化气管的研究工作。解放军第四军医大学第二附属医院呼吸科立足组织工程气管替代物的实验，为气管重建的研究开拓了一条新路。

应用要点：常规分离培养法的培养需要2次取材，所以过程相对繁琐，加之上皮细胞之间以及与成纤维细胞间连接紧密，很难严格把握酶浓度及消化时间。消化不到位则分离下来的细胞数量较少，消化过度则会将黏膜层的成纤维细胞一同消化下来，同时还会破坏已经消化下来细胞膜的完整性，影响上皮细胞的贴壁、增殖与使用。联合培养方法简化了操作过程，同时减少了污染几率。

相关链接：组织工程化气管的构建过程是：首先选取一定数量的经体外培养扩增种子细胞，把它们种植在生物相容性好、可降解的支架材料上；然后将此细胞材料复合物置于生物反应器当中或自体皮下，经过一段时间的诱导分化和培养即形成组织工程化气管。然而，要将组织工程化气管真正应用到临床，还有很长的路要走，首要做的是先从种子细胞的培养方面进行初步研究。

王琳，女，1978年生，青海省西宁市人，汉族，2002年西安医科大学毕业，主治医师，主要从事呼吸内科的基础研究。
jiangweibest@
ohu.com

陕西省自然基金资助(2003C20 36)*

摘要
目的: 构建体外组织工程化气管种子细胞的共培养模式，并与常规培养相比较，为细胞复合材料构建组织工程化气管奠定研究基础。
方法：实验于2006-05/2007-05在解放军第四军医大学唐都医院呼吸科实验室完成。①实验材料：1个月龄雄性健康新西兰兔3只，体质量（250.00±0.75）g。②实验过程：联合培养模式：分离气管上皮细胞和成纤维细胞，联合培养7~10 d后，根据两种细胞对胰酶浓度耐受性不同的特性，A孔中加入0.5 g/L胰酶消化，用体积分数为0.05的胎牛血清的培养液DMEM重悬细胞后移入培养板B孔中(成纤维细胞)；A孔中再次加入2.5 g/L胰酶继续消化后，用K-FSM培养液重悬细胞后移入培养板C孔中(气管上皮细胞)。常规培养法：分别进行气管上皮细胞分离培养和成纤维细胞分离纯化。③实验评估：观察细胞生长曲线与四甲基偶氮唑盐检测细胞的生长状态，并与常规培养的细胞进行比较。
结果：①细胞生长状态：联合培养的两种细胞生长状态良好，A孔加入胰酶消化后，细胞间隙增大；B孔细胞呈现长梭形，未见铺路石状细胞；C孔出现片状生长的铺路石状细胞，未见长梭形细胞。②细胞生长曲线：分离后的细胞与常规方法培养的细胞生长曲线一致。③细胞增殖情况：四甲基偶氮唑盐检测联合培养组细胞增殖与常规方法培养差异无显著性（P < 0.05）。
结论：联合培养模式较常规方法更加简便易行，可以作为一种较好的气管组织工程种子细胞体外培养模式得到应用。
关键词：组织工程；气管；种子细胞；联合培养

王琳，姜威. 构建组织工程气管上皮细胞和成纤维细胞联合培养的模式：与常规培养的比较[J].中国组织工程研究与临床康复，2008，12(15):2825-2828 [www.zglckf.com/zglckf/ejournal/upfiles/08-15/15k-2825(ps).pdf]

Co-culture mode of tissue-engineered tracheal epithelial cells and fibroblasts: Comparison with routine culture

AIM: To establish the co-culture mode of tissue-engineered tracheal seeding cells, and compare with the routine culture, so as to provide the fundament of tissue-engineered trachea construction by cell compound materials.
METHODS: The experiment was completed at the laboratory, Department of Respiratory Diseases, Tangdu Hospital, the Fourth Military Medical University of Chinese PLA from May 2006 to May 2007.①Three healthy New Zealand male rabbits, weighed (250.00±0.75) g, were used in this study.②Co-culture mode: The tracheal epithelial cells and fibroblasts were isolated and then co-cultured for 7-10 days. The two kinds of cells were distinguished according to their different tolerances to trypsin. Subsequently, A hole received 0.5 g/L trypsinization, cells were suspended in DMEM medium containing 0.05 volume fraction of CO2 and then transplanted into B hole (fibroblasts); again, A hole was added with 2.5 g/L trypsin for digestion, afterwards cells were suspended with K-FSM medium and transplanted into C hole (tracheal epithelial cells). Routine culture: after isolation, tracheal epithelial cells were cultured and fibroblasts were purified, respectively.③The co-cultured cells and the traditionally cultured cells were compared via cell growth curve and cell proliferation detected by 3-(4,5-dimethylthiazo-2-yl)-2,5-diphenyl-tetrazolium bromide (MTT) assay.
RESULTS: ①Cell growth: Co-cultured cells grew well, those in A hole increased intercellular apace after trypsinization, while cells in B hole were shaped as fusiform, without the manifestation of typical road stone-like cells, and cells in C hole were apposite, showing lamellar road stone-like morphology.②Cell growth curve: The growth curve of co-cultured cells was identical with that of cells by routine culture method.③Cell proliferation: MTT detection revealed no significant difference in the proliferation of co-cultured cells and cells cultured by traditional method (P < 0.05).
CONCLUSION: Compared with routine culture method, co-culture model is an effective method to establish tissue-engineered tracheal seeding cells culture in vitro.

Wang L, Jiang W. Co-culture mode of tissue-engineered tracheal epithelial cells and fibroblasts: Comparison with routine culture.Zhongguo Zuzhi Gongcheng Yanjiu yu Linchuang Kangfu 2008;12(15):2825-2828(China)
[www.zglckf.com/zglckf/ejournal/upfiles/08-15/15k-2825(ps).pdf]

近年来，利用组织工程学的原理和技术在体外构建出具有气管主要生理功能的生物活性人工气管，作为移植物修复气管缺损逐渐成为研究热点。与其他种类的气管替代物相比，组织工程化气管具有无免疫原性、无排斥反应、有生物活性等优点，更加适合机体内环境[1-5]。常规培养气管上皮细胞和成纤维细胞需要2次取材，过程相对繁琐。为早日实现将组织工程化气管应用到临床的目标，作者从种子细胞的培养入手，试图建立更简单易行的组织工程气管上皮细胞与成纤维细胞的培养模式，为气管组织工程学的可行性研究奠定基础。

设计：对比观察。
单位：解放军第四军医大学唐都医院呼吸科实验室。
材料：实验于2006-05/2007-05在解放军第四军医大学唐都医院呼吸科实验室（省部级重点实验室）完成。清洁级1个月龄雄性健康新西兰兔3只（由解放军第四军医大学实验动物中心提供，许可证号为SCXK2002-005），体质量（250.00±0.75）g。
设计、实施、评估者：设计为第一作者，实施为全部作者，评估为第二作者，评估者经过正规培训。
技术路线：
气管上皮细胞和成纤维细胞的联合培养：取1个月龄雄性健康新西兰兔，处死后无菌条件下取出气管，用不含Ca2+、Mg的磷酸盐缓冲液反复冲洗气管内外。实验组将冲洗干净的气管剖开，放入含0.4%Dispase的离心管中，4 ℃冰箱24 h后将消化酶换成2.5 g/L胰酶，置体积分数为0.05的CO2，37 ℃消化15 min，取出气管，终止胰酶反应。抽吸液体反复冲洗气管内面，用离心管收集细胞悬液，800 r/min离心7 min，弃上清。用磷酸盐缓冲液洗涤1次，用无血清培养液（试剂均为美国Gibco公司产品）。FSM重悬细胞后移入培养板A孔中。放入体积分数为0.05的CO2、37 ℃培养，静置3 d后换液，以后隔日换液。倒置显微镜下观察细胞的形态。两种细胞混合培养7~10 d后，吸去培养液，A孔中加入0.5 g/L胰酶轻轻吹打，消化15 min，镜下观察成纤维细胞变圆，终止酶反应，800 r/min离心7 min，弃上清。用磷酸盐缓冲液洗涤1次，用含体积分数为0.05的胎牛血清的培养液DMEM重悬细胞后移入培养板B孔中(成纤维细胞)。A孔中再次加入2.5 g/L胰酶轻轻吹打，继续消化10 min，终止酶消化反应。收集消化液于离心管中，800 r/min离心7 min，弃上清。用磷酸盐缓冲液洗涤1次，用K-FSM培养液重悬细胞后移入培养板C孔中(气管上皮细胞)。
气管上皮细胞和成纤维细胞的常规培养：
气管上皮细胞的分离培养：采用Dispase冷消化法：将冲洗干净的气管一端用线扎紧，从另一端加入0.1% 的Dispase至气管微胀，扎紧置4 ℃冰箱，24 h后将消化酶换成2.5 g/L 的胰酶，置体积分数为0.05的CO2，37 ℃ 孵箱，10 min后取出气管放出消化液，加入含体积分数为0.1的胎牛血清的培养液以终止胰酶反应。用5 mL注射器抽吸液体，反复冲洗气管内面，收集细胞悬液于离心管中，800 r/min离心7 min，弃上清，用磷酸盐缓冲液洗涤1次。用K-FSM培养液重悬细胞后移入一次性培养板中，置体积分数为0.05的CO2、37 ℃孵箱，静置3 d后换液，以后隔天换液。
成纤维细胞的分离纯化：将分离上皮细胞后的气管取出，小心剥除气管内膜，磷酸盐缓冲液冲洗2次，1 g/L 的胶原酶消化2 h，用200目筛网滤除组织块，收集细胞悬液于离心管中，800 r/min离心7 min，弃上清，磷酸盐缓冲液洗涤1次。用DMEM培养液重悬细胞后移入一次性培养板中，置入体积分数为0.05的CO2，37 ℃孵箱培养，静置3 d后换液，以后隔天换液。
细胞生长情况观察：将分离后的两种细胞分别传代培养，在相差显微镜下观察细胞形态、生长状态及贴壁时间，并摄片记录。以1×106 L-1的密度将各组细胞接种于96孔板，测定绘制生长曲线，横坐标为培养时间，纵坐标为细胞浓度。
四甲基偶氮唑盐法测定细胞活性：取传代培养的细胞，以1×106 L-1的密度接种于96孔板，每孔加入200 μL培养液于37 ℃，体积分数为0.05的CO2条件下培养。每天同一时间点随机抽取5孔细胞，加入50 g/L四甲基偶氮唑盐 20 μL/孔，培养4~6 h，吸出液体，每孔加150 μL二甲基亚砜振荡10 min，酶联免疫测定仪测定波长490 nm处的吸光度。取5孔吸光度的均值，以时间(d)为横坐标，吸光度值为纵坐标绘图。
主要观察指标：①细胞生长状态观察结果。②细胞生长曲线。③四甲基偶氮唑盐法测定细胞增殖活性。
统计学方法：数据以_x±s表示，由本文作者采用SPSS 12.0进行数据处理，行方差分析。P < 0.05为差异有显著性意义。

2.1 统计描述细胞生长状态观察结果：倒置显微镜下观察可见，3 d后联合培养的气管上皮细胞和成纤维细胞呈现长梭形细胞和铺路石状细胞共存的现象，见图1a；5 d长梭形细胞出现放射状生长，铺路石状细胞呈片状生长；7 d后出现两种细胞均匀生长的现象。A孔加入胰酶消化后，细胞间隙增大；B孔细胞呈现长梭形，未见铺路石状细胞，见图1b；C孔出现片状生长的铺路石状细胞，未见长梭形细胞，见图1c。

倒置显微镜下观察可见，3 d后单独培养的气管上皮细胞贴壁呈铺路石状，5 d后铺路石状细胞呈现片状生长的状态，7 d后铺路石状细胞融合成片状；3 d后单独培养的成纤维细胞在镜下呈现细长梭形，5 d后长梭形细胞呈放射状或旋转生长的现象。
2.2 统计推断
2.2.1 联合培养和单独培养的两种细胞生长曲线见图2。

细胞数随时间增长呈对数生长，3~5 d生长速度最快，联合培养组与对照组相比，细胞增长速度无明显降低（P > 0.05）。
2.2.2 四甲基偶氮唑盐法测定细胞增殖活性见图3。

联合培养组与对照组相比，细胞增殖活性间差异无显著性（P > 0.05）。

气管是一种具有独立生物学特性和功能的单一管腔器官。气管管壁是由透明软骨、弹性纤维、结缔组织、平滑肌及富含腺体的黏膜组成，气管黏膜由假复层柱状上皮组成。气管外伤、肿瘤切除等均可引起气管缺损，较为理想的治疗方法是一期端端吻合，但当气管缺损长度超过6 cm时，则无法进行无张力吻合，必须置入气管替代物才能重建气管的连续性，维持气道通畅[6-10]。因此修复气管缺损，恢复重建损伤部位的气管组织功能成为研究人员的目标。近年来迅速发展的组织工程技术已成为未来医学由替换向重建发展的重要手段，气管组织工程研究将为气管的修复提供了一条更符合生物学原则的途径[11-18]。
气管的上皮细胞和成纤维细胞作为种子细胞是组织工程气管中不可缺少的部分。气管上皮细胞是假复层纤毛柱状上皮，仅有一层细胞，上皮细胞之间以及与成纤维细胞间连接紧密，常规培养很难严格把握酶浓度及消化时间。消化不到位则分离下来的细胞数量较少，消化过头会将黏膜层的成纤维细胞一同消化下来，同时还会破坏已经消化下来细胞膜的完整性，影响上皮细胞的贴壁、增殖与使用。而且，常规方法是将两种细胞分别培养，过程繁琐且费时费力[19-20]。本实验方法是将气管上皮细胞与成纤维细胞一同消化，联合培养，简化了操作过程，同时减少了污染几率。
在本实验确立的培养模式下，细胞活力和细胞增殖的测定结果显示，实验组的两种细胞的活性和增殖能力良好，分离后的两种细胞传代生长情况与传统方法获得的细胞生长情况相似，可见利用这种分离纯化的方法对细胞生长状态、增殖能力无明显影响。由于上皮细胞对胰酶的耐受力较成纤维细胞强，利用不同浓度胰酶可以将两种细胞分别消化，得到纯化的上皮细胞和成纤维细胞。两种细胞的培养基不同，成纤维细胞使用的是含体积分数为0.05的胎牛血清的DMEM，气管上皮细胞使用的是无血清培养液K-FSM。血清可以抑制气管上皮细胞的增殖，因此即使第1次消化时混入少量气管上皮细胞，胎牛血清可以抑制其不能进一步增殖，从而保证了成纤维细胞的纯度可达100%。实验证明，分离后的两种细胞传代生长曲线与对照组相似，可见利用这种分离纯化的方法对细胞生长状态无明显影响。
综上所述，联合培养气管上皮细胞与成纤维细胞的模式较常规分离培养方法更加简单易行，可以作为组织工程气管种子细胞培养的一种新的思路。

1 Edelman ER.Vascular tissue engineering: designer arteries.Circ Res 1999;85(12):1115-1117
2 Zhang T,Li T,Li XF.Shiyong Yixue Zazhi 2002;18(10):1131-1133
张涛，李小飞.气管移植研究进展[J].实用医学杂志,2002,18(10): 1131-1133
3 Weidenbecher M, Henderson JH, Tucker HM, et al. Hyaluronan-based scaffolds to tissue-engineer cartilage implants for laryngotracheal reconstruction.Laryngoscope 2007;117(10):1745-1749
4 Kanzaki M, Yamato M, Hatakeyama H, et al. Tissue engineered epithelial cell sheets for the creation of a bioartificial trachea.Tissue Eng 2006;12(5):1275-1283
5 Elazar M,Levi R,Zlotkin E.Targeting of an expressed neurotoxin by its recombinant baculovirus. J Exp Biol 2001;204(Pt 15):2637-2645
6 Shi HC,Xu ZF.Zhonghua Xiongxin Xueguan Waike Zazhi 2002;18(6): 337-379
史宏灿,徐志飞.气管重建外科的现状及进展[J].中华胸心血管外科杂志,2002,18(6):337-379
7 Nishida K, Yamato M, Hayashida Y,et al.Functional bioengineered corneal epithelial sheet grafts from corneal stem cells expanded ex vivo on a temperature-responsive cell culture surface. Transplantation 2004;15;77(3):379-385
8 Kojima K, Vacanti CA. Generation of a tissue-engineered tracheal equivalent. Biotechnol Appl Biochem 2004;39(Pt 3):257-262
9 Lee CJ, Moon KD, Choi H, et al.Tissue engineered tracheal prosthesis with acceleratedly cultured homologous chondrocytes as an alternative of tracheal reconstruction.J Cardiovasc Surg (Torino) 2002;43(2):275-279
10 Yang J, Yamato M, Nishida K, et al.Cell delivery in regenerative medicine: the cell sheet engineering approach.J Control Release 2006;116(2):193-203
11 Adams BF,Berry GJ,Huang X,et al.Immunosuppressive therapies for the prevention and treatment of obliterative airway disease in heterotopic rat trachea allografts. Transplantation 2000;69(11):260-266
12 Vacanti CA,Paige KT,Kim W S,et al. Experimental tracheal replacement using tissue engineered cartilage.Pediatric Surg 1994;29(4):201-205
13 Koji Kojima,Lawrence B,Amit KR.A composite tissue-engineered trachea using sheep nasal chondrocyte and epithelial cells.FASEB 2003;17(8):823-828
14 Le Visage C, Dunham B, Flint P, et al. Coculture of mesenchymal stem cells and respiratory epithelial cells to engineer a human composite respiratory mucosa.Tissue Eng 2004;10(9-10):1426-1435
15 Walles T. Bioartificial tracheal grafts: can tissue engineering keep its promise? Expert Rev Med Devices 2004;1(2):241-250
16 Sekiya S, Shimizu T, Yamato M, et al. Bioengineered cardiac cell sheet grafts have intrinsic angiogenic potential.Biochem Biophys Res Commun 2006;10;341(2):573-582
17 Shimizu T, Sekine H, Isoi Y, et al. Long-term survival and growth of pulsatile myocardial tissue grafts engineered by the layering of cardiomyocyte sheets. Tissue Eng 2006;12(3):499-507
18 Aminuddin BS.Tissue engineering trachea: Malaysian experience. Med J Malaysia 2004;59 Suppl B:3-4
19 Young TF,Thacker EL,sEriekson BZ.A tissue culture system to study respiratory ciliary.Veterin Mierobiol 2000;71:269-279
20 Du YC,Xu JY,Yan F.Zhongguo Bingli Shengli Zazhi 2003;19(9): 1286-1288
杜永成,许建英,延峰.胰酶冷消化加刮刷法分离培养气管上皮细胞的实验研究[J].中国病理生理杂志,2003,19(9):1286-1288