人肺上皮细胞感染呼吸道合胞病毒后核内活性因子κB与诱导型

人肺上皮细胞感染呼吸道合胞病毒后核内活性因子κB与诱导型
一氧化氮合酶的表达**★

刘伟，云云，黄升海

应用要点：从转录水平和蛋白质水平证实了呼吸道合胞病毒感染可以显著上调A549细胞诱导型一氧化氮合酶的表达，且上调作用和感染之间有时间依赖性关系；并且这种上调的变化与核内活性核因子κB的表达增加存在相关性。

术语解析：核因子-κB是细胞中一个重要的转录调节因子，静息状态下与IκB相结合形成复合体，以无活性状态存在于胞浆中。当细胞受到外界因素刺激时，核因子-κB暴露出核定位信号进入核内，使其具有生物活性。

相关链接：生物活性递质包括：组胺、激肽原酶、嗜酸性粒细胞趋化因子、白三烯、前列腺素D2和血小板活化因子，具有扩张血管，增加通透性，引起平滑肌收缩等作用。

刘伟★，男，1983年生，安徽省阜阳市人，汉族，安徽医科大学在读硕士，主要从事呼吸道合胞病毒感染的研究。
liuwei2005010@
yahoo.com.cn

通讯作者：黄升海，副教授，安徽医科大学微生物学教研室，安徽省合肥市 230032 shhuang@ahmu.
edu.cn

安徽省高校“十五人才”优秀中青年骨干教师基金*；安徽省教育厅自然科学基金(2006Kj322B)*

摘要
目的: 呼吸道合胞病毒感染呼吸道上皮细胞后，诱导细胞过度表达活性递质。实验拟观察呼吸道合胞病毒感染人肺上皮细胞A549后核内活性核因子κB，诱导型一氧化氮合酶mRNA和蛋白、一氧化氮和丙二醛表达的变化。
方法：实验于2006-12/2007-05在安徽医科大学基础医学院病原与免疫学实验中心完成。①实验过程：将冻存的病毒株复苏后经Hep-2细胞增殖。用呼吸道合胞病毒感染体外培养的A549细胞，分别于感染4，8，16，24 h后收集细胞和细胞培养上清。以未感染病毒的细胞为正常对照组。②实验评估：反转录聚合酶链反应检测诱导型一氧化氮合酶mRNA表达的变化；免疫印迹法（Western-Blot）分别检测核内活性核因子κB、诱导型一氧化氮合酶蛋白的变化；用硝酸还原酶法、硫代巴比妥酸法分别检测细胞培养上清一氧化氮和丙二醛的表达。
结果：① A549细胞中核内活性核因子κB有基础表达，经由呼吸道合胞病毒感染后，核内活性核因子κB表达升高，且随着感染时间的延长而增加。② 呼吸道合胞病毒感染A549细胞后，诱导型一氧化氮合酶mRNA和蛋白的表达均升高且有时间依赖性，24 h的诱导型一氧化氮合酶mRNA表达量是基础表达量的近12倍，诱导型一氧化氮合酶蛋白的表达亦显著高于正常对照组。核内活性核因子κB与诱导型一氧化氮合酶的mRNA和蛋白升高表达呈正相关。③ 呼吸道合胞病毒感染能促进A549细胞培养上清中一氧化氮和丙二醛的表达升高，24 h内细胞上清中的一氧化氮呈缓慢升高变化。
结论：在呼吸道合胞病毒感染A549细胞的炎性反应中核内活性核因子κB升高，与诱导型一氧化氮合酶基因和蛋白的上升表达呈正相关。
关键词：核因子κB；呼吸道合胞病毒；诱导型一氧化氮合酶；一氧化氮；组织构建

刘伟，云云，黄升海. 人肺上皮细胞感染呼吸道合胞病毒后核内活性因子κB与诱导型一氧化氮合酶的表达[J].中国组织工程研究与临床康复，2008，12(15):2834-2837 [www.zglckf.com/zglckf/ejournal/upfiles/08-15/15k-2834(ps).pdf]

Influence of interferon-gamma in combination with methylprednisolone on the proliferation of human embryonic lung fibroblast

AIM:After human lung epithelial cells (A549) infected with respiratory syncytial virus (RSV), inducer cells over-express active transmitter. The study investigated the expression changes in nuclear factor κB (NF-κB), inducible nitric oxide synthase (iNOS) mRNA and protein, nitric oxide (NO) and malonaldehyde (MDA) on human lung epithelial cells (A549) infected with RSV.
METHODS: Experiments were performed at the Laboratory of Etiology and Immunology, Anhui Medical University between December 2006 and May 2007. ① Gyopreserved virus broliferated in Hep-2 cells after recovery. A549 cells infected with RSV in vitro were used to collect cells and cellular culture supernatant at hours 4, 8, 16 and 24. Cells non-infected with RSV were served as controls. ② Reverse transcription-polymerase chain reaction (RT-PCR) was used to evaluate the expression of iNOS mRNA. The expression of iNOS protein and NF-κB was detected by Western-Blot. The concentrations of NO and MDA were measured by nitrate reductase method and thiobarbituric acid method.
RESULTS: ①The basal expression of NF-κB was increased with the prolongation of RSV infection to A549 cells. ②RSV infection to A549 increased the amounts of mRNA and protein of iNOS in a time-dependent manner. The expression of iNOS mRNA was about 12 times as many as basal expression. RSV infection promoted the expression of iNOS protein, which was higher than the control group. The activities of NF-κB significantly were positively correlated with the mRNA and protein expression of iNOS. ③RSV could improve A549 cells secreting NO and MDA, but the NO levels rose slowly during the 24 hours of infection.
CONCLUSION: The inflammatory response of RSV can increase the activity of NF-κB and it is positive correlated with the increase in iNOS mRNA and protein levels.

Liu W, Yun Y, Huang SH. Expression of nuclear factor kappa B and inducible nitric oxide synthase in the respiratory syncytial virus infection on human lung epithelial cells.Zhongguo Zuzhi Gongcheng Yanjiu yu Linchuang Kangfu 2008;12(15):2834-2837(China)
[www.zglckf.com/zglckf/ejournal/upfiles/08-15/15k-2834(ps).pdf]

近年来研究表明核因子κB可被诱导活化并核转位，发挥关键转录调控因子的作用，使细胞分泌促炎细胞因子和趋化因子，协同刺激因子表达上调，抗原提呈能力增强，从而引发系统性炎症反应[1-3]。诱导型一氧化氮合酶为Ca2+ 非依赖型合酶，在细胞因子或接触到内毒素、肽聚糖等病原体相关分子模式刺激诱导下大量表达，并持续产生超生理量的内源性一氧化氮，作为免疫效应分子介导机体的炎症反应[4-5]。
呼吸道上皮组织是呼吸道合胞病毒感染时侵犯的主要部位，A549细胞为肺腺癌上皮细胞，具有肺泡Ⅱ型上皮细胞的特征，对呼吸道合胞病毒敏感。本实验用体外法以呼吸道合胞病毒感染A549细胞，探讨呼吸道合胞病毒感染后核内活性核因子κB和诱导型一氧化氮合酶表达的变化，以及两者的关系。

设计：随机分组设计。
单位：安徽医科大学基础医学院。
材料：实验于2006-12/2007-05在安徽医科大学基础医学院病原与免疫学实验中心完成。呼吸道合胞病毒为标准株Long株，由安徽医科大学微生物学教研室保存。细胞Hep-2（人喉癌上皮细胞）为安徽医科大学微生物学教研室保存，A549（人肺腺癌上皮细胞）购于上海实生细胞生物技术有限公司。试剂：DMEM培养基（美国Gibco公司），新生牛血清（杭州四季青公司），Trizol试剂（美国Invitrogen公司），反转录试剂盒（美国Promega公司），Blend Taq酶（日本Toyobo公司），鼠抗核因子κB p65抗体（美国Santa Cruz公司），兔抗诱导型一氧化氮合酶抗体（美国Santa Cruz公司），辣根过氧化物酶标记羊抗鼠IgG（北京中杉金桥生物技术有限公司），辣根过氧化物酶标记羊抗兔IgG（北京中杉金桥生物技术有限公司），化学发光试剂盒（美国Pierce公司），一氧化氮、丙二醛检测试剂盒（南京建成生物工程研究所），其他试剂为市售分析纯。
技术路线：
病毒感染量测定：将冻存的病毒株复苏后经Hep-2细胞增殖，按文后参考文献[6]方法对呼吸道合胞病毒进行培养测定，按Reed-Muench法计算病毒的半数感染量（TCID50）。
细胞培养与病毒接种：将5.0×105的A549细胞铺于24细胞孔板中，待细胞长至80%满时接种病毒，吸附1 h后，换维持液。细胞分组为正常对照组、呼吸道合胞病毒感染组，呼吸道合胞病毒感染组又分为4, 8, 16, 24 h的不同时间点，每组3个复孔，分别加入100TCID50的病毒0.1 mL。收集各组细胞和细胞培养上清。
反转录-聚合酶链反应检测诱导型一氧化氮合酶mRNA的表达：细胞总RNA用Trizol按照说明书步骤提取。用紫外分光光度仪分别测定260 nm和280 nm处的吸光度值，测定RNA含量和纯度。引物合成由Invitrogen（上海）公司完成。诱导型一氧化氮合酶上游引物序列：5’- TCC GAG GCA AAC AGC ACA TTC A-3’,下游引物序列：5’-GGG TTG GGG GTG TGG TGA TGT- 3’，扩增片断长度为461 bp；内参β-肌动蛋白上游引物序列为：5’-GGC TTT GAG TAA TGA GAA TTT CGA-3’,下游引物序列：5’-ATC AGT TGC AAT CAA GAA GTG TTG-3’，扩增片断长度为 520 bp；反转录按试剂盒说明书完成。β-肌动蛋白的聚合酶链反应条件为94 ℃ 45 s，55 ℃ 40 s，72 ℃1 min，28个循环。诱导型一氧化氮合酶的聚合酶链反应条件为94 ℃ 45 s，57 ℃ 40 s，72 ℃ 1 min，35个循环。用20 g /L琼脂糖凝胶DNA电泳检测聚合酶链反应产物。凝胶成像分析仪扫描拍照，Labworks软件分析测定条带灰度值，用目的基因条带灰度值与β-肌动蛋白条带灰度值的比值作为目的基因相对表达量。Western-Blot检测诱导型一氧化氮合酶蛋白、核因子κB p65的表达：提取细胞总蛋白和核蛋白，Lorry法蛋白定量，-70 ℃保存。Western-Blot参照《分子克隆实验指南》第2版进行。
硝酸还原酶法、硫代巴比妥酸法分别检测细胞培养上清一氧化氮和丙二醛的表达：取呼吸道合胞病毒感染A549的细胞培养上清，严格按照试剂盒说明书操作检测一氧化氮和丙二醛的表达，单位均为μmol/L。
主要观察指标：①呼吸道合胞病毒半数感染量滴定结果。②诱导型一氧化氮合酶mRNA的表达。③核内活性核因子κB和诱导型一氧化氮合酶蛋白的表达。④一氧化氮和丙二醛的表达量的变化。⑤相关性分析。
统计学方法：由第一作者采用SPSS 11.0软件进行单因素方差分析，用直线相关分析法对两变量进行相关性分析。

2.1 呼吸道合胞病毒半数感染量滴定结果为 10-6.8/0.1 mL。
2.2 诱导型一氧化氮合酶mRNA的表达反转录聚合酶链反应测定结果显示正常A549细胞诱导型一氧化氮合酶mRNA表达基线很低，呼吸道合胞病毒感染后能上调诱导型一氧化氮合酶mRNA的表达且有时间依赖型。与正常组相比呼吸道合胞病毒组在感染后诱导型一氧化氮合酶mRNA的表达逐渐增加，在感染4 h后诱导型一氧化氮合酶mRNA表达量即升高，8 h显著升高，24 h达最高峰，升高有显著性差异（见图1）。

2.3 核内活性核因子κB和诱导型一氧化氮合酶蛋白的表达 Western-Blot检测结果显示正常对照组A549细胞的细胞核内活性核因子κB有基础表达，呼吸道合胞病毒感染能促进核因子κB的核转位，诱导其活化，感染24 h后核内活性核因子κB p65蛋白量明显升高（见图2）。正常对照组A549细胞的诱导型一氧化氮合酶蛋白表达量非常低，用免疫引迹法检测不到条带，而呼吸道合胞病毒感染能促进诱导型一氧化氮合酶蛋白的表达。呼吸道合胞病毒感染A549细胞16 h后，诱导型一氧化氮合酶蛋白的表达量开始升高，可检测到清晰的蛋白条带，感染24 h后蛋白表达量进一步升高（见图2）。
2.4 一氧化氮和丙二醛的表达量的变化呼吸道合胞病毒感染后可促进炎性细胞因子一氧化氮和脂质过氧化产物丙二醛表达的升高。随着呼吸道合胞病毒感染时间的延长，A549细胞的培养上清中一氧化氮的量是逐渐增加的。呼吸道合胞病毒感染A549细胞24 h后，细胞培养上清中一氧化氮的分泌量升高约为正常组的2倍左右（见表1）。

2.5 相关性分析细胞核内活性核因子κB p65蛋白表达量与诱导型一氧化氮合酶mRNA表达量成正相关 (n =15, r =0.928, P < 0.05)；与诱导型一氧化氮合酶蛋白的表达量亦呈正相关(n =15, r =0.936, P < 0.05)。

呼吸道合胞病毒感染呼吸道上皮细胞后，诱导细胞过量表达细胞因子、趋化因子、活性氧等生物活性介质[7-10]。这些活性介质的过度分泌，粘液和坏死脱落的细胞堵塞气道。
核因子κB是一种重要的核转录调节因子，主要由P65 (RelA)和P60两个亚单位组成二聚体，在未被激活时以静止状态下和抑制蛋白IκB结合成复合体存在于细胞浆内，活化的核因子κB移位至胞核内并结合DNA上相应的特异性基因启动子或增强子位点，调节下游的细胞因子、趋化因子等相关炎症基因的表达,形成并放大炎症反应[11-12]。本实验证明呼吸道合胞病毒感染可以使呼吸道上皮细胞中核因子κB的表达增加, 核因子κB随感染时间的延长升高。
诱导型一氧化氮合酶则是受核因子κB调节的一个重要炎症基因，分析诱导型一氧化氮合酶基因的5’端上游4.9 kb区域发现有多个可结合调节蛋白的DNA位点作为启动子，包括核因子κB结合位点、γ活化位点(GAS)、激活蛋白1结合位点等起始调节位点[13-14]。而将诱导型一氧化氮合酶基因启动子上的κB元件敲处后，细胞因子刺激无法引起诱导型一氧化氮合酶基因的表达。这些研究结果都提示核因子κB对诱导型一氧化氮合酶的表达具有正调控作用。本实验分别用反转录聚合酶链反应和Western-Blot方法，从转录水平和蛋白质水平证实了呼吸道合胞病毒感染可以显著上调A549细胞诱导型一氧化氮合酶的表达，且上调作用和感染之间有时间依赖性关系；并且这种上调的变化与核内活性核因子κB的增加存在相关变化性。
诱导型一氧化氮合酶可在多种免疫炎症中被刺激诱导下大量表达（为正常原生型的20~100倍），参与机体的炎症反应。大量表达的诱导型一氧化氮合酶并持续产生超生理量的内源性一氧化氮，使感染组织局部的浓度剧升[6,15-18]。同时过量一氧化氮可迅速与机体中的水、氧以及广泛存在的超氧自由基发生结合反应，进一步导致呼吸爆发，生成多种的活性氧物质（主要为OONO、OH·、O2·等），这些过量表达的氧自由基及硝基自由基可通过氧化硝基化修饰作用于靶分子，导致正常机体细胞中的巯基、酪氨酸类蛋白破坏，攻击不饱和脂肪酸，产生脂质过氧化物及其降解产物丙二醛等，加重免疫炎症损伤[19-20]。研究表明在呼吸道炎症中，呼吸道上皮细胞分泌的一氧化氮作为一种活跃的气态脂溶小分子参与机体的生理和病理过程。参与使炎症细胞迁徙定位于呼吸道炎症部位，可以诱导CD4+ T淋巴细胞向Th2亚型转变，同时抑制其向Th1亚型成熟。因此，一氧化氮可能是导致在呼吸道合胞病毒感染婴幼儿后的急性肺损伤炎症中，出现Th2/ Th1比例失去平衡，造成以体液免疫Th2型炎症反应为主的关键性因素。
在本实验中同时检测了呼吸道合胞病毒感染A549细胞后细胞上清中一氧化氮和丙二醛的表达量的变化，发现呼吸道合胞病毒感染能促进A549细胞分泌一氧化氮，24 h内细胞上清中的一氧化氮呈缓慢升高变化，但一氧化氮的升高变化量未与诱导型一氧化氮合酶的表达升高变化量相一致。丙二醛作为反映体内发生脂质过氧化程度的指标，呼吸道合胞病毒感染组同正常组相比较，有显著性的升高，提示机体内的脂质氧化程度加重。对实验结果进行分析，说明诱导型一氧化氮合酶合成的一氧化氮可能参与了呼吸道合胞病毒感染中氧化自由基所制的免疫损伤。诱导型一氧化氮合酶的基因表达与最后催化一氧化氮产物的生成存在差异变化，其中仍存在多种调节机制的调节作用；另一方面可能由于一氧化氮的化学性质活泼，诱导型一氧化氮合酶催化生成的一氧化氮迅速参加机体炎症中的化学反应，进而不易在上清中被检测出来。这些变化以及调节机制是我们在以后的实验中需要继续探讨研究的方向。
通过本实验，观察到在呼吸道合胞病毒感染人肺上皮细胞后的炎症反应中，核内活性核因子κB表达显著上升，而且与诱导型一氧化氮合酶mRNA和蛋白的上升表达均成正相关，提示呼吸道合胞病毒感染后的炎症反应中，核因子κB的活化对人肺上皮细胞的诱导型一氧化氮合酶的表达有调控作用。

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