大鼠颈动脉球囊损伤局部A20基因转染后内皮细胞再生及血管超微结构的影响*☆

高静，李蕾，徐丹，陈良，曲鹏

课题背景：锌指蛋白A20为近年来在细胞内源性保护机制的研究中发现的一类新的蛋白质，是核因子κB信号系统活化的产物，并负反馈抑制核因子κB的活化而对细胞损伤起保护作用。随着对血管内皮细胞增生分子生物学机制的深入认识和分子生物学技术的发展，基因治疗有可能成为未来解决这一问题的突破点之一。

同行评价：文章报告了A20基因转染对球囊损伤血管内皮细胞及平滑肌的影响，结果表明，A20基因转染可以改善损伤部位内皮的修复和逆转损伤引起的平滑肌细胞表型转化，可能对防治经皮冠状动脉支架植入后血管内皮细胞增生致再狭窄有一定作用，文章有一定的创新性。

相关链接：大量实验研究发现，完整的内皮层能抑制平滑肌细胞增生、迁移及细胞外基质合成。内皮剥脱造成新生内膜增厚。支架置入部位的早期内皮化可能预防血栓形成和再狭窄。研究者们曾试用多种不同方案，包括药物调控，组织工程、基因和干细胞治疗，甚至操作方法的改进（即直接置入支架）以期限制内皮损伤；补充内皮产物、加速内皮细胞再生；或三管齐下，以期减少新生内膜增厚。最为天然的途径应该还是刺激再内皮化，促进愈合过程的加速。

高静☆，女，1979年生，山东省平原县人，汉族，大连医科大学在读博士，主要从事介入心脏病学的研究。
slgaojing@sohu.
com

通讯作者：曲鹏，博士，博士生导师，大连医科大学附属第二医院心内科，辽宁省大连市 116027
qupeng777@yahoo.
com.cn

国家自然科学基金资助项目（30670836） *

摘要
目的: 锌脂蛋白A20是核因子κB信号系统活化的产物。研究证实核因子κB的激活是球囊损伤动脉后血管狭窄发生的重要机制之一。实验拟观察锌指蛋白A20对大鼠颈总动脉球囊损伤局部血管内皮再生和血管超微结构的影响。
方法：实验于2006-03/2007-06在大连医科大学附属第二医院中心实验室完成。①实验材料：健康雄性SD大鼠42只，体质量350~400 g。②分组及实验过程：采用随机数字表法将大鼠分为3组，每组14只。制备A20质粒DNA，建立大鼠颈总动脉球囊损伤模型（假手术组只进行颈动脉结扎，不进行球囊损伤术）；对照组：球囊损伤术后局部灌注Lipofectamine 2000 Reagent+TE缓冲液；治疗组：球囊损伤术后局部灌注Lipofectamine 2000 Reagent +TE缓冲液+pCAGGS-GFP/A20重组质粒。A20质粒DNA在球囊损伤大鼠颈动脉的局部转染。③实验评估：荧光显微镜观察A20在损伤动脉壁的转染效率；伊文思蓝染色法评估损伤后颈动脉内皮再生情况；透射电镜观察血管超微结构改变。实验过程对动物的处理符合动物论理学标准。
结果：①球囊损伤术和A20转染治疗后2周，治疗组再内皮化百分比大于对照组（P < 0.05）。②假手术组大鼠颈动脉平滑肌细胞电镜下呈典型的“收缩表型”；对照组球囊损伤后3 d可见合成型细胞及过渡型细胞，7 d血管平滑肌细胞表型发生明显改变，呈典型的“合成表型”，治疗组术后7 d可见接近收缩型的血管平滑肌细胞。
结论：局部转染A20基因可促进损伤血管内皮再生，抑制损伤处血管平滑肌细胞表型转化。
关键词：锌指蛋白A20；内皮；超微结构；基因转染；大鼠��

高静，李蕾，徐丹，陈良，曲鹏. 大鼠颈动脉球囊损伤局部A20基因转染后内皮细胞再生及血管超微结构的影响[J].中国组织工程研究与临床康复，2008，12(15):2838-2842 [www.zglckf.com/zglckf/ejournal/upfiles/08-15/15k-2838(ps).pdf]

中图分类号:R329.412
文献标识码:B
文章编号:1673-8225
(2008)15-02838-05

Effects of zinc finger protein A20 on reendothelialization and vascular ultrastructure of rats with carotid artery balloon injury

AIM:Zinc finger protein A20 is the activated product of nuclear factor-κB signaling. Activation of nuclear factor-κB is one of important mechanisms of angiostegnosis after balloon injury. This study aimed to investigate the effects of in vivo local transfection of zinc finger protein A20 gene on reendothelialization and vascular ultrastructure of rats with carotid artery balloon injury.
METHODS: Experiments were performed at the Central Laboratory of Second Affiliated Hospital of Dalian Medical University from March 2006 to June 2007.①Forty-two healthy male Sprague-Dawley (SD) rats of 350-400 g were selected. ②The rats were randomly divided into three groups equally. A20 plasmid DNA was prepared. Rat models of common carotid artery balloon injury were established. Rats in the sham operation group only received ligation of carotid. Rats in the control group were administered with Lipofectamine 2000 Reagent+TE buffer solution in local region after sac injury. Rats in the treatment group were treated with Lipofectamine 2000 Reagent +TE buffer solution+pCAGGS-GFP/A20 recombinant plasmid after sac injury. A20 plasmid DNA was locally transferred into rats with carotid balloon injury. ③The transfection efficiency of A20 plasmid in injured arterial wall was evaluated by fluorescence microscope. Endothelial regeneration of corotid artery was evaluated by Evans blue dye staining. Ultrastructural change in injured artery was observed with a transmission electron microscope. The disposal in animals was accorded with the animal ethical standards.
RESULTS: ①Local transfection of A20 gene resulted in an increase in reendothelialization, as measured as percent area reendothelialized at day 14 in the treatment group compared to the control group (P < 0.05). ②Contractile phenotype of vascular smooth muscle cells (VSMCs) was shown in the sham operation group and synthetic phenotype and transition cells were shown after balloon injury in the control group at day 3. VSMCs showed typical synthetic phenotype at day 7, at the same time, VSMCs resembled contractile phenotype in the treatment group at day 7.
CONCLUSION: Local transfection of A20 gene can accelerate reendothelialization after arterial injury and inhibit the phenotype transformation of VSMCs.

Gao J, Li L, Xü D, Chen L, Qu P. Effects of zinc finger protein A20 on reendothelialization and vascular ultrastructure of rats with carotid artery balloon injury.Zhongguo Zuzhi Gongcheng Yanjiu yu Linchuang Kangfu 2008;12(15):2838-2842(China) [www.zglckf.com/zglckf/ejournal/upfiles/08-15/15k-2838(ps).pdf]

经皮冠状动脉支架置入治疗冠心病后血管内皮增生导致再狭窄的机制，目前普遍认为是平滑肌细胞的增殖和迁移以及细胞外基质的堆积导致的血管内膜增生和血管重塑，而血管内皮的损伤是这一过程的启动因素。研究表明，内皮细胞可以调节血管平滑肌细胞的生长，抑制新生内膜的形成[1-2]。因此，减少内皮细胞的损伤和促进损伤后内皮细胞结构和功能的恢复，将有可能成为抑制内膜增生的新策略[3]。近年来在细胞内源性保护机制的研究中发现了一类新的蛋白质，即锌脂蛋白A20。A20的表达能够被脂多糖和肿瘤坏死因子等所诱导，是核因子κB信号系统活化的产物。同时A20通过抑制肿瘤坏死因子和脂多糖刺激肿瘤坏死因子受体1和Toll样受体4（Toll-like receptor 4,TLR4），抑制核因子κB的活化而对细胞损伤起保护作用。A20是核因子κB信号系统重要的负反馈调节因子，也是防止体内炎症反应失控的重要调节蛋白[4-6]。已有研究证实核因子κB的激活是球囊损伤动脉后血管内皮增生发生狭窄的重要机制之一[7-8]。本实验将A20重组质粒转染至球囊损伤的大鼠颈动脉，观察目的基因在局部血管壁的表达及对损伤后血管壁内皮再生和血管平滑肌细胞表型改变的影响，并探讨其可能的机制。

设计：随机对照动物实验。
单位：大连医科大学附属第二医院心内科。
材料：实验于2006-03/2007-06在大连医科大学附属第二医院中心实验室（BSL-2）完成。试剂和仪器：高效真核表达载体pCAGGS-GFP/A20由比利时根特大学分子生物学系Dr K. Heyninck和 Prof. R. Beyaert提供；Endo-Free Plasmid Maxi kit 购自QIAGEN公司；Lipofectamine 2000转染试剂购自Invitrogen公司；2F Fogarty球囊导管购自美国Edwards Lifesciences世界贸易公司；伊文思蓝(Evans blue）染料购自Sigma公司；透射电镜(JEM-2000EX型)为日本进口仪器，核酸测定仪(RS232C型)为Eppendorf公司产品。健康雄性SD大鼠42只，体质量350~400 g(由大连医科大学动物实验中心提供，许可证号：SYXK（辽）2002-0005)。
技术路线：
动物分组：SD大鼠42只实验前适应性饲养 1周，喂食标准饲料，自由摄食水。将42只大鼠采用随机数字表法分为3组，每组14只。①假手术组：只进行颈动脉结扎，不进行球囊损伤术。②对照组：球囊损伤术后局部灌注Lipofectamine 2000 Reagent+TE缓冲液。③治疗组：球囊损伤术后局部灌注Lipofectamine 2000 Reagent+TE缓冲液+pCAGGS-GFP/A20重组质粒。
重组A20质粒的鉴定：将获得的pCAGGS-GFP/A20质粒菌保涂Amp抗性的平板后，过夜培养。挑单菌落于3mL Amp抗性的LB培养基中37℃摇床中过夜培养，集菌后，使用TaKaRa MiniBEST Plasmid Purification Kit 进行小量质粒提取，并使用EcoR Ⅴ/Sma Ⅰ进行双酶切鉴定，酶切产物10 g/L琼脂糖凝胶电泳。
无内毒素质粒的大量提取：将鉴定好的pCAGGS-GFP/A20质粒菌保接种于100 mL Amp抗性的LB培养基中过夜培养后，使用QIAGEN
公司的Endo-Free Plasmid Maxi kit 进行无内毒素质粒的提取，溶于试剂盒中的TE缓冲液，并使用EcoRⅤ/ SmaⅠ进行双酶切鉴定，酶切产物10 g/L琼脂糖凝胶电泳。将质粒DNA提取物按适当比例稀释，置核酸浓度测定仪内，测得DNA的浓度，并用真空浓缩机将质粒浓度调整至1 g/L。
灌注液配制(每一只大鼠用量)：假手术组：无灌注液；对照组：Lipofectamine 2000 Reagent 40 μL+TE 20 μL；治疗组：Lipofectamine 2000 Reagent 40 μL + pCAGGS-GFP/A20质粒20 μL，（含质粒20 μg）。以上所配转染液均按Lipofectamine 2000 Reagent说明书配制，室温下静置30 min以上即可使用。
大鼠颈动脉球囊损伤模型的建立及基因转染[9-10]：健康雄性SD大鼠，体质量350~400 g。体积分数为0.1的水合氯醛（3 mL/kg）腹腔注射麻醉后将大鼠仰卧固定，颈部剃毛，常规消毒，取颈正中切口，切开皮肤，分离皮下组织；寻找左颈总动脉和颈外、颈内动脉分叉处，将颈外动脉向远端分离1 cm左右。为了预防操作中急性血栓形成，在球囊损伤前5 min由睾丸静脉注入肝素钠(200 IU/kg)[11]。用显微血管夹夹闭左颈总动脉近心端及颈内动脉，结扎颈外动脉远端，暂时阻断血流；在颈外动脉切一小口，将2F Fogarty球囊导管从切口插入至左颈总动脉近心端约2.0 cm，用50 μL生理盐水充盈球囊，直径扩大至动脉外径的2倍，来回抽动3次以剥脱内膜。退出球囊，用灌注管向损伤节段内缓慢注入灌注液。局部作用30 min后，结扎颈外动脉，恢复颈总和颈内动脉血流，适量庆大霉素局部喷洒手术野，缝合颈部切口，碘伏涂擦创口及周围皮肤。将大鼠送回饲养笼饲养。喂食标准饲料，自由饮水。以上操作由固定的2人完成。
质粒在损伤动脉壁转染效率的测定：转染治疗24 h后处死各组大鼠各2只，迅速取下球囊损伤血管段及对侧未损伤颈动脉标本，用肝素生理盐水轻柔冲洗管腔，随即用冷冻包埋剂包埋，-20 ℃ 冷冻30 min，其后于冰冻切片机上取5 μm厚度切片。不固定，不染色，于荧光显微镜下观察双侧颈动脉绿色荧光蛋白表达，籍以评估A20重组质粒在损伤动脉壁的转染情况。
pCAGGS-GFP/A20质粒DNA转染对损伤后内皮再生影响的检测[12-13]：大鼠颈动脉球囊损伤后2周，在大鼠被处死前30 min由睾丸静脉注射5 g/L伊文思蓝染液 (2 mL/kg)，然后以40 g/L多聚甲醛磷酸盐缓冲液心脏插管进行原位灌注固定，取损伤侧颈动脉1 cm，将取材后的损伤血管段纵向剖开，平铺固定，观察内膜染色情况，正常血管腔面不染色，内皮损伤后腔面被染成蓝色，内皮再生面积为肉眼观察到的没有被伊文思蓝染色的面积。数码相机拍照，由计算机图像分析系统测量蓝染区域面积和血管片段总表面积，损伤血管再内皮化百分比(%)=（总表面积－蓝染区域面积）/总表面积×100%。
透射电镜下血管超微结构的观察：取各组大鼠术后3 d，7 d病变血管标本，在冰块上纵行剖开，用肝素生理盐水冲洗管腔内血液，切成1.0~2.0 mm左右血管段，用25 g/L戊二醛固定24 h后，制备电镜切片，透射电镜观察血管平滑肌细胞的超微结构变化。实验过程对动物的处理符合动物论理学标准。
主要观察指标：①pCAGGS-GFP/A20重组质粒转染对损伤后内皮再生的影响。②透射电镜下血管超微结构的观察结果。
统计学方法：数据以_x±s表示，由第一作者采用SPSS 13.0统计软件处理，组间和组内比较采用方差分析，P < 0.05为差异有显著性意义。

2.1 统计描述
2.1.1 A20重组质粒在体转染效果观察转染A20基因治疗24 h后，取损伤局部血管的冰冻切片置于荧光显微镜下，用470~490 nm光激发可见治疗组残存血管内膜及中膜有大量绿色荧光分布，对照组及假手术组未见有绿色荧光分布，证明质粒转染成功，在血管壁细胞表达。
2.1.2 透射电镜下血管超微结构的观察结果假手术组电镜下中膜血管平滑肌细胞胞体规则呈长梭形，细胞体积小，胞核染色质浓集，胞浆肌丝成分丰富，排列整齐，粗面内质网、线粒体和高尔基体等细胞器含量较少，符合典型的“收缩表型”。对照组术后3 d内膜开始出现合成型细胞及过渡型细胞，细胞和胞核体积增大，细胞器增多，肌丝成分减少，细胞周围分泌物增多。对照组球囊损伤术后7d可见内膜血管平滑肌细胞表型发生明显改变，细胞轮廓不规则，细胞胞体明显增大，胞核增大，胞浆内见大量粗面内质网、高尔基体、线粒体等细胞器，靠近质膜周围可见菲薄且不连续的少量肌丝成分，细胞周围分泌物增多，表现为合成功能旺盛，说明已转变为“合成表型”。治疗组术后7 d可见增生内膜中的血管平滑肌细胞的胞体及核较小，胞浆内肌丝含量相对较多，线粒体、高尔基体亦较少，接近收缩型的血管平滑肌细胞。见图1。
2.2 统计推断 pCAGGS-GFP/A20重组质粒转染对损伤后内皮再生的影响：由静脉注入5 g/L伊文思蓝染料，内皮缺失后，胶原等结缔组织暴露，为伊文思蓝着色提供了基质，内皮缺失区被染成蓝色。肉眼观察显示，治疗组与对照组比较，蓝染面积减少，显示更大面积的内皮再生。计算机图像分析系统测定结果显示，治疗组与对照组损伤血管段的总面积相比差异无显著性，但治疗组再内皮化百分比明显大于对照组[(79.1±3.7)%,(55.6±3.3)%，P < 0.05]。见图2。

血管内皮是介于循环血液和血管平滑肌之间的选择性通透屏障，内皮细胞可以释放大量血管活性物质(一氧化氮、前列腺素等)，参与调节血管弹性和舒缩状态，对抑制血管平滑肌细胞生长、促凝和纤溶功能及血管重塑起到十分重要的作用[14]。经皮冠状动脉介入治疗术后内皮完整性的破坏和随即发生的内皮功能失调可引起血管内皮依赖性舒张功能受限，血小板聚集性增强，内皮下脂质大量积聚，平滑肌细胞迁移并过度增殖等，最终导致再狭窄。因此，内皮细胞损伤作为再狭窄的始动因素，同时影响着再狭窄形成中的多个病理生理过程。虽然目前用于防治支架内再狭窄的血管内放射治疗和药物洗脱支架成功地减少了新生内膜形成，但同时也引起靶血管的内皮愈合不良，产生支架裸露及迟发性血栓形成等危险[15]。另有研究表明，再内皮化不良对平滑肌细胞增生即使不是有促进作用也是准许作用[16]。这一概念已经引起防治策略的发展，最近，Losordo 等[17]强调指出：“内皮恢复是预防经皮冠状动脉介入术后再狭窄新策略”。已有广泛的资料表明促进内皮恢复是对预防再狭窄有效的、独立的策略。
A20是新近人们发现的参与体内炎症反应调控的内源性蛋白。对A20的序列分析揭示了其具有两种明显的结构区：N端半区（残基1-386），又称“N区”；C端半区（残基387-790），又称“锌区”。锌区包含了7种锌指结构，该区在对多种刺激的反应中显示出了对核因子κB的抑制活性。随后研究发现，A20分布于多种细胞内，是防止体内炎症反应失控的重要调节蛋白，在机体内源性保护机制中具有重要作用[4-5]。作者通过大鼠颈动脉球囊损伤局部转染A20基因，可使其在局部组织高表达。
研究表明，平滑肌细胞增殖和迁移在血管损伤后再狭窄中起着重要作用，而血管平滑肌细胞由收缩型向合成型转化是其增殖和迁移的关键起始步骤[18]。本实验发现，假手术组大鼠颈动脉中膜血管平滑肌细胞电镜下呈典型的“收缩表型”；球囊损伤后7 d对照组增生内膜中血管平滑肌细胞表型发生明显改变，呈典型的“合成表型”，术后3 d对照组开始增生的内膜中即可见合成型细胞及过渡型细胞；治疗组术后7 d增生受到抑制的内膜中可见接近收缩型的血管平滑肌细胞。表明A20重组质粒转染治疗可抑制平滑肌细胞表型的转变。结合文献，球囊损伤后炎症细胞活化释放的一系列炎症介质可能通过激活血管壁平滑肌细胞膜受体Toll样受体4，进而启动了Toll样受体4/核因子κB胞内信号转导途径，合成和分泌多种细胞外基质、血管活性物质和生长因子，在血小板源性生长因子等的刺激下，血管平滑肌细胞由收缩型转变为合成型，并在生长因子的刺激下迁移、分裂和增殖，参与血管壁修复和新生内膜的形成。通过局部转染A20基因，使其在局部血管壁细胞内高表达，可能通过对核因子κB的负反馈抑制，使核因子κB不能激活进入胞核，其下游多种炎症介质的基因转录不能激活，故血管活性物质、生长因子和细胞外基质的表达分泌减少，不能刺激血管平滑肌细胞表型转变，同时血管平滑肌细胞的迁移、分裂和增殖减轻，内膜增生和血管重塑减轻。
Doi 等[19]和 Noiseux 等[20]研究发现，并不直接作用于内皮细胞的C型利钠肽和血小板源性生长因子反义寡核苷酸不仅可抑制血管平滑肌细胞的增殖、迁移，而且可促进损伤内皮的修复及内皮依赖性舒张功能的恢复。本实验也表明，锌指蛋白A20在损伤局部血管壁高表达可促进内皮的修复。然而，这种促内皮修复作用的机制尚不清楚。文献报道，内皮损伤后血管平滑肌细胞表型由收缩型向合成型转化[19]，而合成型血管平滑肌细胞可分泌内皮细胞迁移抑制因子转化生长因子β和纤维连接蛋白，从而抑制内皮修复。故推测由于A20可抑制损伤诱导的血管平滑肌细胞表型转变，减少内皮细胞迁移抑制因子的分泌，因而可促进内皮再生，使内皮剥脱部位尽早再内皮化。
综上所述，球囊损伤后再狭窄早期，锌指蛋白A20作为体内重要的内源性保护物质，其具有抑制血管平滑肌细胞表型转变和促进损伤血管内皮修复的作用。从基因治疗的角度，锌指蛋白A20抑制血管平滑肌细胞表型转变和促进内皮再生的作用为再狭窄的防治提供了新的途径。

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