黄芪甲苷对缺氧/复氧损伤人脐静脉内皮细胞与中性粒细胞黏附能力及细胞核转录因子κB表达的影响★

黄芪甲苷对缺氧/复氧损伤人脐静脉内皮细胞与中性粒细胞黏附能力及
细胞核转录因子κB表达的影响★

杨富国1，刘革新1，董果雄2，郭云良3

课题背景：黄芪是用于防治心脑血管疾病的传统中药。黄芪甲苷是从黄芪中提取的有效成分，其分子结构已明确，但有关黄芪甲苷对内皮细胞缺氧复氧损伤的影响报道较少。

同行评价：该项实验建立了人脐静脉内皮细胞缺氧复氧模型模拟器官组织缺血－再灌注所诱导的血管改变，从分子水平探讨黄芪甲苷对血管内皮细胞缺氧／复氧的保护作用，为缺血再灌注损伤的治疗提供用药依据，实验具有一定的创新性。

相关链接：氧化应激可激活血管内皮细胞核转录因子κB信号转导通路，活化的核转录因子κB通路又可导致细胞间黏附分子1过度表达，后者进而介导中性粒细胞的黏附和聚集，引发器官、组织及细胞的炎性损伤反应。黄芪甲苷通过清除氧自由基，抑制核转录因子κB发生核易位，减少细胞间黏附分子1的表达，从而减轻血管内皮细胞与中性粒细胞黏附，对缺氧/复氧损伤血管内皮细胞具有保护作用。

1青岛大学医学院护理学院，山东省青岛市 266021；青岛大学医学院附属医院，2心内科， 3脑血管病研究所，山东省青岛市 266003

杨富国★，男，1970年生，山东省青岛市人，汉族，青岛大学医学院附属医院心内科在读硕士，讲师，主要从事冠心病的基础和临床研究。
yfuguo@163.com

摘要
目的: 采用人脐静脉内皮细胞缺氧复氧模型模拟器官组织缺血-再灌注所诱导的血管改变，观察黄芪甲苷对缺氧/复氧损伤血管内皮细胞与中性粒细胞黏附及细胞核转录因子κB表达的干预作用。
方法：实验于2005-09/2006-05在青岛大学医学院附属医院脑血管病研究所细胞生物工程实验室进行。①实验材料：新生儿脐带（由青岛大学医学院附属医院妇产科提供，产妇及其家属知情同意，实验符合赫尔辛基宣言中的伦理学标准）。②实验过程及分组：人脐静脉内皮细胞原代培养，传至3代后，随机分为3组。对照组：常规培养；缺氧/复氧组：先缺氧处理1 h，再复氧1 h；药物干预组：在培养液中加入终浓度分别为20，40，80 mg/L的黄芪甲苷预处理，12 h后进行缺氧/复氧处理。③实验评估：分别用硫代巴比妥法和酶联免疫吸附试验测定细胞培养液中丙二醛的含量和细胞间黏附分子1浓度；免疫化学法测人脐静脉内皮细胞核转录因子κB的表达；虎红染色法检测人脐静脉内皮细胞与中性粒细胞黏附。
结果：①与对照组比较，缺氧/复氧组细胞培养液中丙二醛含量增多（P < 0.01）；随着黄芪甲苷预处理剂量的增加，丙二醛含量降低（P < 0.01），呈剂量依赖性。②与对照组比较，缺氧复氧组人脐静脉内皮细胞核转录因子κΒ阳性细胞率、细胞培养液中细胞间黏附分子1浓度及中性粒细胞黏附率升高（P均< 0.01）；随着黄芪甲苷预处理剂量的增加，核转录因子 κB表达阳性细胞率、中性粒细胞黏附率下降（P < 0.05或P < 0.01），细胞间黏附分子1浓度减少（P < 0.01），呈剂量依赖性。
结论：黄芪甲苷通过抑制缺氧复氧引起的血管内皮细胞核转录因子κB表达，减轻血管内皮细胞与中性粒细胞黏附，对缺氧/复氧损伤血管内皮细胞具有保护作用，且呈剂量依赖性。
关键词：黄芪甲苷；内皮细胞；缺氧/复氧；NF-κB；胞间粘附分子1；组织构建

杨富国，刘革新，董果雄，郭云良. 黄芪甲苷对缺氧/复氧损伤人脐静脉内皮细胞与中性粒细胞黏附能力及细胞核转录因子κB表达的影响[J].中国组织工程研究与临床康复，2008，12(15):2843-2846
[www.zglckf.com/zglckf/ejournal/upfiles/08-15/15k-2843(ps).pdf]

中图分类号:R329.4
文献标识码:A
文章编号:1673-8225
(2008)15-02843-04

Effect of astragaloside on adhesion of human umbilical vein endothelial cells and polymorphonuclear neutrophils and expression of nuclear factor kappa B under hypoxia/reoxygenation condition

Abstract

AIM:To investigate the intervention effect of astragaloside on adhesion of polymorphonuclear neutrophils (PMN) and vascular endothelial cells and on expression of nuclear factor-κB (NF-κB) in human umbilical vein endothelial cells (hUVECs) injured by hypoxia/reoxygenation due to ischemia/reperfusion.
METHODS: The experiment was performed at the Cell Bioengineering Laboratory of Institute of Cerebrovascular Diseases, Affiliated Hospital of Medical College, Qingdao University from September 2005 to May 2006. ①Neonatal umbilical cords were offered by Department of Gynecology and Obstetrics in Affiliated Hospital of Medical College of Qingdao University, with informed consent of puerperant and their families. The experiment was accorded with ethical standard of Helsinki declaration. ②The hUVECs were cultured to the future passage. After the third passage, hUVECs were randomly divided into three groups. Cells in a control group were cultured under normal conditions; Cells in a hypoxia/reoxygenation group were cultured under in closed container with hypoxia for 1 hour, and then under normal conditions for 1 hour; The hUVECs in a astragaloside group were pretreatment by different doses of astragaloside (20, 40, 80 mg/L). After 12 hours, hUVECs suffered from hypoxia/reoxygenation. ③The concentration of intercellular adhesion molecule (ICAM)-1 and content of malondialdehyde (MDA) in supernatant were detected by enzyme linked immunosorbent assay (ELISA) and thiobarbituric acid method. Expression of NF-κB of hUVECs was analyzed by immunohistochemistry. PMN adhesion to hUVECs was measured by rose Bengal staining.
RESULTS: ①Compared to the control group, the content of MDA remarkably increased in hypoxia/reoxygenation group (P < 0.01). With the increased dose of astragaloside, MDA content decreased (P < 0.01) with a dose-dependent effect. ②Compared to the control group, the percentage of NF-κB positive endothelial cells, concentration of ICAM-1 and adhesion rate of hUVECs to PMN increased in the hypoxia/reoxygenation group (P < 0.01). With the increased dose of astragaloside, the percentage of NF-κB positive endothelial cells and adhesion rate of hUVECs to PMN decreased (P < 0.05 or P < 0.01), and concentration of ICAM-1 was reduced (P < 0.01) with a dose-dependent effect.
CONCLUSION: Astragaloside can protect vascular endothelial cells from the injury caused by hypoxia/reoxygenation by inhibiting expression of NF-κB induced by hypoxia/reoxygenation in vascular endotheliial cells and by reducing the adhesion of vascular endotheliial cells to PMN with a dose-dependent effect.

Yang FG, Liu GX, Dong GX, Guo YL. Effect of astragaloside on adhesion of human umbilical vein endothelial cells and polymorphonuclear neutrophils and on expression of nuclear factor kappa B under hypoxia/reoxygenation condition.Zhongguo Zuzhi Gongcheng Yanjiu yu Linchuang Kangfu 2008;12(15):2843-2846(China)
[www.zglckf.com/zglckf/ejournal/upfiles/08-15/15k-2843(ps).pdf]

黄芪的有效成分复杂，主要有皂苷类、黄酮类、多糖等。现代医学研究发现,黄芪不同提取物具有抗氧化、抗炎、扩血管、改善心脏缺血性疾病的作用[1-3]。黄芪甲苷是从黄芪总苷中分离得到的一类单体化合物，其对内皮细胞缺氧复氧损伤的影响报道较少。本实验采用人脐静脉内皮细胞缺氧复氧模型模拟器官组织缺血-再灌注所诱导的血管改变，观察黄芪甲苷对缺氧/复氧损伤人脐静脉内皮细胞培养液中丙二醛的含量和细胞间黏附分子1浓度、细胞核转录因子κB表达以及与中性粒细胞黏附率的影响，从分子水平探讨黄芪甲苷对血管内皮细胞缺氧/复氧的保护作用。

设计：随机对照实验。
单位：青岛大学医学院护理学院内科学教研室。
材料：实验于2005-09/2006-05在青岛大学医学院附属医院脑血管病研究所细胞生物工程实验室(山东省重点实验室，BSL-2)完成。新生儿脐带(由青岛大学医学院附属医院妇产科提供，产妇及其家属知情同意，实验符合赫尔辛基宣言中的伦理学标准)。药品与主要试剂：黄芪甲苷(中华人民共和国国家药品监督管理局，批号：0781-200311)；DMEM培养基(美国Gibco公司)；丙二醛检测试剂盒、细胞间黏附分子1 试剂盒（南京建成生物工程研究所）；辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG、免疫组织化学试剂盒、二氨基联苯胺显色试剂盒、核转录因子κB p65多克隆抗体(武汉博士德生物工程有限公司)；虎红(北京试剂公司)等。主要仪器：Sw-CJ-TA超净工作台（吴江市净化设备总厂），CO2培养箱MCO-17AIC型(日本Sanyo公司生产)；IX-70 型荧光倒置显微镜(日本Olympus公司生产)；Sartorius BS110型电子天平(德国)，Beckman低温低速离心机(Beckman公司)等。
设计、实施、评估者：设计为第一、三作者，实施为第一、二作者，评估为第三、四作者。所有作者均经正规培训，具备基本的实验技术。
技术路线：
人脐静脉内皮细胞分离、鉴定和培养：人脐静脉内皮细胞采用改良的Jaffe 方法。在无菌条件下取健康产妇正常分娩胎儿脐带25~30 cm，用Hank’s液冲洗干净，灌入1 g/L的Ⅰ型胶原酶，在37 ℃ 温箱中培养18~20 min，收集消化液，1 000 r/min（离心半径20 cm）离心10 min，弃上清，加入含体积分数0.20小牛血清和生长因子的DMEM培养液制成细胞悬液，置37 ℃培养箱（含体积分数0.95 O2+0.05 CO2）中进行培养，24 h后换液，待细胞长成融合状态后作细胞鉴定。血管内皮细胞特征：相差显微镜下呈单层铺路石样排列，用免疫法测定第Ⅷ因子相关抗原呈阳性反应。确定为内皮细胞后再传代培养，取第3代生长良好的人脐静脉内皮细胞进入实验。
缺氧/复氧损伤模型的建立：人脐静脉内皮细胞生长至80%以上融合的单层细胞时，消化制成单细胞悬液，调整细胞密度为2.0×105 L-1，分别接种于预先用多聚赖氨酸包被的24孔板。24 孔板每孔加入200 μL 细胞悬液，次日换液，第3 天进行造模。置于自制的37 ℃ 密闭缺氧罐中，持续通入缺氧混合气体（含体积分数0.05 CO2+0.95 N2）0.5 L/min，置换容器中的氧气。待该容器内氧气体积分数低于0.01后，停止通入缺氧混合气体。密闭该容器，置于37 ℃细胞培养箱中培养1 h，再打开容器，将24孔培养板置于正常培养条件的培养箱中（含体积分数0.95的O2+0.05的CO2）培养，进行复氧处理。
实验分组与药物干预：实验随机分为：①对照组：置于37 ℃体积分数0.95 O2+0.05 CO2的培养箱中正常培养相应的时间。②缺氧复氧组：制备缺氧复氧模型，置于体积分数0.95的N2+0.05的CO2缺氧环境1 h，然后置于正常培养条件的培养箱中继续培养1 h。③药物干预组：分为3个亚组，在培养液中加入终浓度分别为20，40，80 mg/L的黄芪甲苷，预处理12 h，然后同缺氧复氧组处理。每组6例，实验重复2次。
细胞培养上清中丙二醛含量和细胞间黏附分子1浓度的检测：收集各组培养细胞上清液，按每份1 mL分装，置-70 ℃ 冻存备用。采用酶联免疫吸附技术双抗体夹心法（ABC-ELISA）测定细胞培养上清液中丙二醛含量和细胞间黏附分子1浓度。具体检测步骤按试剂盒说明操作，用酶标仪测得各孔450 nm处A值，根据不同浓度标准品的A 450 nm值做标准曲线，计算出样品中细胞间黏附分子1的浓度。硫代巴比妥法测丙二醛含量，具体检测步骤按试剂盒说明操作。
免疫组织化学检测核转录因子κB的表达：根据博士德生物工程公司提供的生物抑蛋白素过氧化物酶法(SABC)免疫组织化学染色试剂盒说明书要求进行。标本用50 g/L多聚甲醛固定20 min，采用核转录因子κB p65多抗在4 ℃ 过夜，再用生物素标记的羊抗兔抗体保温，二氨基联苯胺染色，在显微镜下检测，核空白或呈均匀弱淡褐色为阴性细胞，核内出现棕褐色颗粒为阳性细胞，高倍镜下观察10个高倍视野，计算阳性细胞占所有细胞的比率。
人中性粒细胞的分离及其与人脐静脉内皮细胞黏附试验：取健康人静脉血20 mL，肝素抗凝，用Percol1分离液分离中性粒细胞，磷酸盐缓冲液洗涤2遍后重悬于体积分数为0.05胎牛血清的DMEM培养液中，调整细胞数为2.5×10 9 L-1。Giemsa染色中性粒细胞纯度90%以上，锥虫蓝染色细胞活力大于95%，符合试验要求。人脐静脉内皮细胞处理结束后，吸弃各孔液体，磷酸盐缓冲液洗孔3次，加入中性粒细胞悬液200 μL（5.0×105个），37 ℃ 孵育30 min。吸除未黏附的中性粒细胞，磷酸盐缓冲液洗3次，每孔加入0.25% 虎红（磷酸盐缓冲液配制）100 μL，室温孵育5 min。吸除染料，磷酸盐缓冲液洗3次，加入磷酸盐缓冲液-乙醇（1∶1），每孔200 μL，室温孵育30 min，酶标仪570 nm 波长测定各孔A值。中性粒细胞所摄取的虎红染料在磷酸盐缓冲液-乙醇作用后可释放出来，因此，每孔A值与所黏附的中性粒细胞数量成正比，计算各组的细胞黏附率。黏附率=（人脐静脉内皮细胞黏附中性粒细胞A值－人脐静脉内皮细胞 A值）/加入总中性粒细胞A值×100%。
主要观察指标：①黄芪甲苷对缺氧/复氧损伤人脐静脉内皮细胞培养液中丙二醛的含量、细胞间黏附分子1含量及中性粒细胞黏附率的影响。②黄芪甲苷对缺氧/复氧损伤人脐静脉内皮细胞核转录因子κB表达的影响。
统计学方法：由第一作者采用SPSS 11.5软件进行方差齐性检验、单因素方差分析，组间比较用LSD法。

2.1 黄芪甲苷对缺氧/复氧损伤人脐静脉内皮细胞培养液中丙二醛含量的影响与对照组[(2.38±0.49) μmol/L]比较，缺氧复氧组人脐静脉内皮细胞培养液中丙二醛含量显著升高（P < 0.01）。与缺氧复氧组比较，药物干预组随着黄芪甲苷预处理浓度的增加，细胞培养液中丙二醛含量明显降低[(缺氧/复氧组和黄芪甲苷20，40，80 mg/L组依次为：(6.98±1.15)，(4.38±0.83)，(3.25±0.66)，(2.22±0.58) μmol/L，P < 0.01]，该效应与黄芪甲苷预处理浓度呈剂量依赖效应。
2.2 黄芪甲苷对缺氧/复氧损伤人脐静脉内皮细胞核转录因子κB表达、细胞培养液中细胞间黏附分子1浓度及与中性粒细胞黏附率的影响见表1。

正常细胞组胞浆有阳性染色，多数细胞胞核无明显的染色，少数细胞核有一定程度的染色。缺氧复氧后，多数胞核呈现明显的阳性染色。与对照组相比，缺氧复氧组人脐静脉内皮细胞核转录因子κB阳性细胞率、细胞培养液中细胞间黏附分子1浓度及与中性粒细胞黏附率显著升高（P 均< 0.01）。与缺氧复氧组比较，药物干预组随着黄芪甲苷预处理浓度的增加，人脐静脉内皮细胞核转录因子κΒ表达阳性细胞率减少（P < 0.05或P < 0.01）、细胞培养液中细胞间黏附分子1浓度减少（P < 0.01）、人脐静脉内皮细胞与中性粒细胞黏附率下降（P < 0.01），该效应与黄芪甲苷预处理浓度呈剂量-依赖效应。

正常情况下，内皮细胞所具有的抗氧化机制可清除活性氧（包括H2O2、OH-、O2- 等氧自由基），维持细胞氧化还原自稳态，因而不会发生有害作用。内皮细胞缺氧复氧时氧自由基生成增加，这些氧自由基作用于细胞膜可引起脂质过氧化反应，产生大量丙二醛，且氧自由基能激活细胞内蛋白激酶和转录因子，介导一系列生物反应。丙二醛含量的变化在某种程度上可以了解机体内氧化反应的强弱。本实验结果显示：经缺氧复氧处理的人脐静脉内皮细胞培养液中丙二醛含量显著增加，提示缺氧复氧使氧自由基生成增多，内皮细胞发生脂质过氧化；不同浓度黄芪甲苷预处理后，细胞培养液中丙二醛含量下降，且其作用具有浓度依赖性。已有研究表明黄芪甲苷具有清除氧自由基，抗脂质过氧化作用[4]。黄芪甲苷可能通过加强人脐静脉内皮细胞清除氧自由基的能力，使脂质过氧化作用减轻，故培养液中丙二醛含量下降。
核转录因子κB是一个多功能核转录因子, 为Rel蛋白家族成员, 由多肽P50 和P65 亚基形成同源性或异源性二聚体。核转录因子κB具有广泛的生物学活性，在内皮细胞的活化中具有重要的作用 [5]。一般情况下，核转录因子κB与其抑制蛋白（IκB）结合，以无活性形式存在于细胞的胞浆中。已有研究表明，心肌缺血再灌注能激活核转录因子κB，其激活因素可能为心肌缺血再灌注后造成的氧化应激、复氧、内质网钙离子超载、游离基和内毒素等[6]。缺氧复氧时产生的氧自由基可使ⅠκB磷酸化水解，从而与核转录因子κB发生解离，导致核转录因子κＢ发生核易位，进入细胞核与靶基因启动区或增强子上的核转录因子κB结合位点结合，促使细胞表面受体、黏附分子和细胞因子的表达 [7-11]。使用核转录因子κB激活抑制剂吡咯二硫氨基甲酸酯(PDTC)可使核转录因子κB活性明显降低，减轻中性粒细胞黏附和浸润，缺血再灌注损伤显著减轻。
细胞间黏附分子1属于免疫球蛋白超基因家族成员，主要表达于血管内皮细胞。细胞间黏附分子1在生理条件下处于低表达状态，当促炎性介质如活性氧、肿瘤坏死因子α、白细胞介素1刺激下表达增强[12]，并且能在内皮细胞上持续表达，与中性粒细胞表面的整合素家族CD11/CD18连接，使中性粒细胞与内皮细胞牢固黏附，诱导内皮细胞骨架相关蛋白酪氨酸磷酸化，引起细胞骨架的改变，有利于活化中性粒细胞穿过内皮细胞及基膜向局部组织聚集浸润，导致微血栓形成和毛细血管阻塞，引起缺血区无复流现象的发生。同时，黏附激活的中性粒细胞释放氧自由基、弹性蛋白酶、蛋白水解酶等细胞毒性物质，加重内皮细胞和心肌细胞的损伤[13-20]。细胞间黏附分子1的表达决定了中性粒细胞的浸润程度。
本实验采用人脐静脉内皮细胞缺氧复氧模型模拟器官组织缺血-再灌注所诱导的血管改变，结果显示不同浓度黄芪甲苷处理后，人脐静脉内皮细胞缺氧复氧核转录因子κB 表达降低，细胞培养液中细胞间黏附分子１的浓度减少，人脐静脉内皮细胞与中性粒细胞黏附率降低。提示内皮细胞的核转录因子κB活性变化与心肌再灌注损伤有关，并在转录水平上说明内皮细胞缺氧复氧时存在核转录因子κB活化的信号传导途径。核转录因子κB被激活后，通过调控细胞间黏附分子1蛋白的表达而参与再灌注损伤的发生过程。黄芪甲苷可能通过清除氧自由基[21-22]，减少IκB磷酸化水解，抑制核转录因子κB发生核易位，从而减少细胞间黏附分子1的表达，故内皮细胞核转录因子κB表达减少，培养液中细胞间黏附分1浓度降低，人脐静脉内皮细胞与中性粒细胞黏附率降低。

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