精索静脉曲张管壁肌动蛋白和胶原的定性与定量分析
刘学银，苟 欣
应用要点：本文从超微结构、免疫组织化学等方面对曲张的精索静脉进行了观察；并从另一角度采用图像分析方法进行平均吸光度及平均面密度值分析，丰富了血管重塑的病程、细胞、分子等方面的资料。
同行评价：文章通过对精索静脉曲张管壁的肌动蛋白及胶原纤维的定性和定量研究，以探讨血管重塑在精索静脉曲张发生机制中的意义，目的明确。具有一定的创新性和科学意义。
相关链接：目前，众多国内外学者对于血管重塑有大量的研究报道。由河北医科大学教授韩梅等人完成的“血管重塑性疾病的细胞与分子机制研究”，从细胞和分子生物学角度对血管重塑性疾病的发生机制和发展规律提出了新的观点和试验数据，为该类疾病的治疗和新药研究机制提供了新的切入点。本领域有待解决的问题:①进一步研究精索静脉曲张血管重塑的发病机制。②找出治疗和研究新药治疗精索静脉曲张的切入点。
重庆医科大学附属第一医院泌尿外科，重庆市
400016
刘学银，男，1969年生，重庆市巫溪县人，汉族，1993年重庆医科大学毕业，副主任医师，主要从事男性生殖的研究。
wxlxy2008@163.com
通讯作者：苟 欣，硕士，教授，主任医师，硕士生导师，重庆医科大学附属第一医院泌尿外科，重庆市 400016
cymnk@163.com
摘要
背景：目前关于心脏、大血管疾病的血管重塑及其病理学、分子生物学、免疫组织化学以及药物对血管重塑的影响有大量的研究报道，而对于精索静脉曲张的有关报道较少。
目的：观察精索静脉曲张过程中管壁肌动蛋白和胶原的定性与定量的变化。
设计、时间及地点：同期非随机对照观察，于2006-03/2007-06在重庆医科大学附属第一医院泌尿外科完成 。
对象：实验组精索静脉取自2006-03/2007-06在重庆医科大学附属第一医院泌尿外科接受手术治疗的精索静脉曲张患者30 例；年龄(26.29±9.12)岁；病程(2.76±1.83)年。对照组选取同期该科肾移植供体正常精索静脉，共24 例，年龄(39. 56 ±8.32)岁。患者及供体亲属对治疗完全知情同意。
方法：采用V-G染色、免疫组织化学、扫描电镜定性和定量观察30 例曲张精索静脉和24例正常精索静脉壁中肌动蛋白及胶原纤维变化，并进行图像分析。
主要观察指标：两组精索静脉平滑肌细胞、胶原纤维、Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原和α-肌动蛋白的变化及吸光度和面密度的变化。
结果：①曲张精索静脉内膜、中膜改变以增厚为主，平滑肌细胞从收缩表型向合成表型转化。②曲张静脉α-肌动蛋白的吸光度和面密度均比正常静脉增多（P < 0. 01）；曲张静脉Ⅰ型胶原及Ⅲ型胶原的吸光度和面密度均比正常静脉增多（P < 0.01）。
结论：精索静脉曲张管壁的平滑肌细胞异常增生，从收缩表型向合成表型转化，细胞外基质中胶原异常改变，可能是精索静脉曲张发生和发展的机制之一。
关键词：静脉曲张；肌，平滑；血管/细胞学；胶原；肌动蛋白类；血管构建
刘学银，苟欣. 精索静脉曲张管壁肌动蛋白和胶原的定性与定量分析[J].中国组织工程研究与临床康复，2008，12(15):2859-2862 [www.zglckf.com/zglckf/ejournal/upfiles/08-15/15k-2859(ps).pdf]
中图分类号:R329.412
文献标识码:B
文章编号:1673-8225
(2008)15-02859-04
收稿日期：2008-01-18 修回日期：2008-03-12 (08-50-1-508/W·Y)
Qualitative and quantitative analysis of actin and collagen in varicocele vessel wall
Abstract
BACKGROUND: At present, there are considerable investigations and reports concerning the vascular remodeling cum pathology, molecular biology, immunohistochemistry, drug effect to the disease of the heart and great vessels. But varicocele is seldom reported.
OBJECTIVE: To observe the change of the qualitation and quantitation of actin and collagen in varicocele vessel wall.
DESIGN, TIME AND SETTING: A synchronized non-randomized control observation was carried out in the Department of Urinary Surgery, the First Affiliated Hospital of Chongqing University of Medical Sciences from March 2006 to June 2007.
PARTICIPANTS: Thirty varicocele patients treated in Department of Urinary Surgery, the First Affiliated Hospital of Chongqing University of Medical Sciences from March 2006 to June 2007, were recruited for experimental group in this study. Their age was (26.29±9.12) years, and the course of disease was (2.76±1.83) years. Meanwhile, 24 normal spermatic veins from the donator of kidney transplantation, aged (39.56±8.32) years, were served as control group. All the patients and the donators' relatives signed the informed consent to the treatment.
METHODS: Changes of collagen fibers and actin in 24 normal spermatic veins and 30 varicocele veins were studied quantitatively and qualitatively by the methods of V-G staining, immunohistochemistry, and scanning electron microscopy. The image analysis was conducted.
MAIN OUTCOME MEASURES: Changes of smooth muscle cells (SMC), collagen fibers, type Ⅰ collagen, type Ⅲ collagen and α-smooth muscle actin, as well as optical density and area density.
RESULTS: ①Tunica intima hyperplasia and medial thickening were the main histological appearances of varicocele veins, SMC transformed from the contractile phenotype to the synthetic phenotype.②The optical density and area density of α-actin, type Ⅰ collagen and type Ⅲ collagen were increased significantly compared with the normal veins (P < 0.01).
CONCLUSION: The development of varicocele may be associated with paraplastic SMC transforming from the contractile phenotype to the synthetic phenotype, and the abnormal change of collagen in the extracellular matrix.
Liu XY, Gou X. Qualitative and quantitative analysis of actin and collagen in varicocele vessel wall.Zhongguo Zuzhi Gongcheng Yanjiu yu Linchuang Kangfu 2008;12(15):2859-2862(China)
[www.zglckf.com/zglckf/ejournal/upfiles/08-15/15k-2859(ps).pdf]
0 引言
静脉曲张血管重塑是指发生在曲张静脉中以平滑肌细胞和细胞外基质等主要成分的结构发生改变的过程，是静脉壁适应各种病理状态所发生的代偿机制的结果[1]。近年来，大量形态学和生物化学等方面的研究提出了静脉曲张的原发病变主要在静脉壁，认为静脉壁的曲张主要是平滑肌细胞的分离、变性[2-3]；而另一些研究则认为胶原纤维的增多是造成静脉曲张的重要原因[4]。实验对精索静脉曲张管壁的肌动蛋白及胶原纤维进行了定性和定量观察。
1 材料和方法
设计：同期非随机对照观察。
单位：重庆医科大学附属第一医院。
对象：实验组：精索静脉取自2006-03/2007-06在重庆医科大学附属第一医院泌尿外科接受手术治疗的精索静脉曲张患者30例；年龄(26.29±9.12)岁；病程(2.76±1.83)年。对照组：选取2006-03/2007-06在重庆医科大学附属第一医院泌尿外科行肾移植取供体正常精索静脉，共24 例，年龄（39.56±8.32）岁。实验组人员及供体亲属对治疗均完全知情、同意。兔多克隆抗Ⅰ型胶原抗体为武汉博士德公司产品；鼠抗人Ⅲ型胶原单克隆抗体为北京中杉金桥生物技术有限公司产品；鼠抗人平滑肌肌动蛋白单克隆抗体抗人为北京中杉金桥生物技术有限公司产品；免疫组织化学PV-9000试剂为北京中杉金桥生物技术有限公司产品；北航BM2000生物医学图像分析系统由重庆医科大学电镜室提供；日本HITACHI-750透射电镜。
设计、实施、评估者：设计及实施者为第一作者，评估者为第二作者，均受过培训。
技术路线：
肌动蛋白及胶原纤维的显微结构观察：V-G 染色观察：平滑肌细胞（显示黄色）和胶原纤维（显示红色）。免疫组织化学：采用PV-9000检测系统法，二氨基联苯胺显色，观察静脉壁中Ⅰ型胶原，Ⅲ型胶原和α-肌动蛋白。一抗：Ⅰ型胶原抗体（兔多克隆抗Ⅰ型胶原抗体）；Ⅲ型胶原抗体（鼠抗人Ⅲ型胶原单克隆抗体）；α-平滑肌肌动蛋白抗体（鼠抗人平滑肌肌动蛋白单克隆抗体抗人）。二抗：免疫组织化学PV-9000试剂。
图像分析：采用北航BM2000生物医学图像分析系统。光镜下(× 400)分别拍摄对照组、实验组的Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原和α-肌动蛋白的免疫组织化学照片。对照组拍摄147个视野，实验组随机拍摄180个视野共327张照片。对所摄照片的阳性产物进行平均吸光度值和平均面密度值分析。
平滑肌细胞的超微结构：采用日本HITACHI-750透射电镜观察实验组4例、对照组2例精索静脉超微结构。
主要观察指标：①正常精索静脉平滑肌细胞、胶原纤维的结构特征。②曲张精索静脉中平滑肌细胞、胶原纤维的结构特征。③图像分析结果。
统计学方法：数据用_x±s表示，采用Student’t 检验，由第一作者用SPSS 13.0统计软件处理数据，P < 0.05表示有显著性意义。
2 结果
2.1 统计描述
2.1.1 正常精索静脉平滑肌细胞、胶原纤维的结构特征 正常精索静脉的平滑肌及胶原分布均匀，见图1。
正常精索静脉分内膜、中膜、外膜3层，平滑肌在3层中均有分布，α-肌动蛋白分布于平滑肌细胞胞浆内，与平滑肌走行一致，均匀，排列规则。电镜下，平滑肌细胞呈梭形，细胞膜完整，细胞核成熟，排列规则，胞浆内富含大量肌丝，粗面内质网和线粒体等细胞器很少，见图2。胶原纤维分布于内膜、中膜、外膜3层，Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原3 层均有分布，以中膜、外膜为主。在中膜，分布于平滑肌细胞之间，排列规则，外膜分布广泛，呈网状。电镜下，胶原纤维粗细均匀，排列规则，见图2。
2.1.2 曲张精索静脉中平滑肌细胞、胶原纤维的结构特征 曲张精索静脉的平滑肌及胶原明显增厚，见图3。
二氨基联苯胺染色可清楚显示肌动蛋白、平滑肌、胶原的结构，见图4。
平滑肌细胞在内膜以增生改变为主，中膜有肥大、融合样改变，排列紊乱，外膜中有肌团样增生，见图5。电镜下，平滑肌细胞胞形态不规则，排列紊乱，胞浆增多，胞浆中粗面内质网、线粒体、核糖体丰富，肌丝很少，部分出现脂滴样变性；平滑肌细胞具有合成型细胞特征，细胞核成熟、皱缩。胶原纤维在内膜大量沉积；在中膜胶原纤维聚集增多，排列紊乱；外膜胶原纤维排列紊乱，平滑肌细胞间胶原纤维粗细不均，排列紊乱；平滑肌细胞间胶原纤维聚集，使细胞间距离加大，见图6。
2.2 统计推断 实验组和对照组血管壁的α-肌动蛋白、Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原吸光度及面密度值：见表1，表2。
曲张静脉的α-肌动蛋白、Ⅰ型胶原和Ⅲ型胶原的吸光度和面密度比正常静脉显著增多(P均 < 0.01)。
3 讨论
1994年，Gibbons等[5]提出血管重塑是在生长因子、血管活性物质和血流动力学改变等多种因素作用下，引起血管壁的细胞增殖、死亡、迁移以及细胞外基质合成和分解所致的血管结构变化过程。自体静脉移植于动脉疾病的相关研究显示，静脉从稳定的、压力相对低的环境到搏动性、高压力的环境后，会发生重塑[6]。文献报道在血管再狭窄的相关研究中发现血管发生重塑[7]。王凡等[8]在大动脉顺应性减退的机制中研究同样发现血管发生重塑。Touyz[9]、李朝红[10]指出高血压引起血管重塑。Jeon等[11]在研究中发现高胆固醇引起血管重塑。Cui等[12-14]在动脉粥样硬化的相关研究中指出硬化血管重塑。Chello[15]通过取自曲张静脉壁的组织学研究证实曲张静脉壁组织结构重新塑形。Sansilvestri-Morel等[16]报道，曲张静脉壁中Ⅰ型胶原含量增加，而Ⅲ型和Ⅴ型胶原含量减少，推断这与静脉壁顺应性的下降有关。研究表明，静脉压增高与血液瘀滞可激活血管内皮细胞释放炎症因子和生长因子，后者促发血管平滑肌细胞由收缩表型向合成表型转化[17]，合成表型平滑肌细胞能合成Ⅰ型胶原和Ⅲ胶原[18]。血管平滑肌细胞是决定血管活性和血管构型的重要因素，在与心血管疾病的有关许多疾病中，血管活性和血管构型皆会发生变化[19-20]。血管平滑肌细胞的功能除了具有收缩作用外，还有合成细胞外纤维和基质的功能。有文献报道合成表型平滑肌细胞可以迁移至内皮下增生，但其收缩合成能力降低，细胞收缩功能下降[21]。曾进等[22]研究表明曲张精索静脉发生了明显的病理改变，表现为内皮细胞变性、脱落，平滑肌细胞出现空泡变性，中膜明显增厚，血管增殖并形成多腔血管以及瓣膜严重机化，认为精索内静脉的瓣膜功能不全、中膜肥厚及瓣膜严重机化等病理改变是引起精索静脉曲张的重要原因。正常精索内静脉的管壁中含有丰富的平滑肌细胞，它分布于内膜、中膜、外膜3 层，其发达的收缩功能使得精索内静脉具有肌性血管特征；同时，管壁内细胞外基质中胶原可提供张力，维持了管壁的完整性。
采用α-肌动蛋白标记精索静脉平滑肌细胞，显示曲张静脉的α-肌动蛋白的吸光度及面密度明显高于正常静脉的α-肌动蛋白的吸光度及面密度，说明了曲张静脉的平滑肌细胞主要以合成表型形式存在。这在电镜观察下也得到证实。平滑肌细胞从收缩表型向合成表型的转化，一方面使得平滑肌收缩效应减弱，静脉容易发生曲张；另一方面，使得平滑肌细胞合成细胞外基质增加，静脉管壁结构发生变化。研究中，曲张静脉中Ⅰ型和Ⅲ型胶原的增加可能与平滑肌细胞向合成表型转化有关。Ⅰ型胶原与管壁抗张力有关，Ⅲ型胶原与管壁弹性有关，Ⅰ型胶原和Ⅲ型胶原含量的变化其后果使得管壁弹性降低。胶原纤维在平滑肌细胞之间聚集、增多，不仅使平滑肌细胞之间距离加大，而且促进平滑肌细胞从收缩表型向合成表型的转化，都使得平滑肌收缩效应进一步降低，因此发生在静脉管壁结构中平滑肌细胞和胶原纤维等主要结构的变化最终导致静脉壁收缩性和弹性降低，静脉容易产生曲张。
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