大鼠成纤维细胞生长因子2分子克隆及其真核表达载体的构建*★

杨丽华1，张学光1，王如兴2，陈永井1，吕海军1，张燕1，李肖蓉2

应用要点：①选择的观察对象为特殊人群，对于肥胖人群步态特征的研究刚刚开始，已有的研究主要是运动学分析，对肥胖人步态动力学的系统分析还很少，国内几乎还是空白。②利用的测试仪器为国际先进的足底压测试系统。

同行评价：对正常人群足底压力和步态的研究较多，但未见对肥胖青年进行足底压力和步态研究。本文设计合理，方法较先进可靠，数据可信，因此，本文结果有一定的应用意义，并且对肥胖的预防也有一定的参考价值。

相关链接：足底压力研究，揭示了人体在不同状态下的足底压力分布特征和模式，以及运动过程中足的动力性特征。同时，足底压力测量技术在临床步态研究和临床医疗中的不断应用与深入，已逐渐成为临床生物力学研究和诊断病足与足部康复评定的重要手段。通过足-鞋界压力的研究，也为指导人们健康穿鞋与科学制鞋带来了科学理论依据。

1苏州大学医学生物技术研究所江苏省干细胞重点实验室，江苏省苏州市 215007； 2无锡市第一人民医院心内科，江苏省无锡市
214002

杨丽华★，女，1981年生，陕西省宝鸡市人，汉族，苏州大学在读硕士，主要从事干细胞与临床、分子免疫方向研究。
lihuayang1981@
yahoo.com.cn

通讯作者：李肖蓉，硕士生导师，教授，无锡市第一人民医院心内科，江苏省无锡市
214002 lixiaorong.dr@163.
com

摘要
目的：实验旨在克隆大鼠成纤维细胞生长因子2CDS区基因全长，并将其于真核表达载体PIRES2-EGFP相连接，构建成纤维细胞生长因子2的真核表达载体。
方法：实验于2007-03/06在苏州大学生物技术研究所完成。①实验材料：克隆载体PMD18-T-vector(takara)；真核表达载体PIRES2-EGFP由苏州大学第一附属医院消化科叶建新博士惠赠；大肠杆菌TOP10购自英俊公司；清洁级新生一两天SD大鼠2只。②实验过程及评估：体外分离培养新生SD大鼠心室肌细胞。Trizol法抽提心室肌细胞总mRNA，采用反转录-聚合酶链反应的方法反转录获得总的cDNA，聚合酶链反应的方法扩增成纤维细胞生长因子2基因的CDS区片断全长。将扩增出来的基因片断和克隆载体PMD18-T-vector连接，转化TOP10感受态细菌，阳性克隆经电泳，质粒聚合酶链反应和酶切等鉴定正确后送去测序确认。测序正确后抽重组质粒，bglⅡ和pstⅠ同时双酶切PMD18-T-FGF-2和 PIRES2-EGFP，将切下的目的基因片段和线性PIRES2-EGFP空质粒载体在T4DNA连接酶作用下进行连接，构建其真核表达载体。
结果：①成功培养出了形态典型的SD大鼠的心室肌细胞。②所获的大鼠成纤维细胞生长因子2DNA序列与GeneBank中收录的大鼠成纤维细胞生长因子2序列完全一致。③PIRES2-EGFP-bFGF真核表达载体的构建测序表明，成纤维生长因子2成功插入真核表达载体PIRES2-EGFP之中。
结论：实验成功克隆了大鼠成纤维细胞生长因子2基因全长，并构建了其真核表达载体。为转基因细胞制备和移植治疗心肌梗死奠定基础。
关键词：成纤维细胞生长因子2；心肌/细胞学；载体构建；大鼠；组织构建

杨丽华，张学光，王如兴，陈永井，吕海军，张燕，李肖蓉. 大鼠成纤维细胞生长因子2分子克隆及其真核表达载体的构建 [J].中国组织工程研究与临床康复，2008，12(15):2875-2878 [www.zglckf.com/zglckf/ejournal/upfiles/08-15/15k-2875(ps).pdf]

中图分类号:R329.114
文献标识码:B
文章编号:1673-8225
(2008)15-02875-04

收稿日期：2007-09-05
修回日期：2008-01-15
(07-50-9-4837/W·Y)

Cloning of fibroblast growth factor-2 and construction of its eukaryotic cell expressing vector

Abstract

AIM: To clone full-length fragments of rat fibroblast growth factor-2 (FGF-2) CDS part, and connect it with PIRES2-EGFP to construct its eukaryotic cell expressing vector.
METHODS: The experiment was carried out in the Biotechnology Institute of Soochow University from March to June in 2007.①Materials: Cloning vector PMD18-T-vector (takara); eukaryotic cell expressing vector PIRES2-EGFP was presented by Ye Jian-xin, doctor of Department of Internal Digestion in NO.1 Affiliated Hospital of Soochow University. E. coli top10 was bought from Invitrogen Company; two clearing neonatal SD rats.②Experimental protocol and assessment: Neonatal SD rat ventricular muscle cells were cultured in vitro. The total mRNA was extracted from neonatal rat ventricular cells with Trizol method, and reversed transcription-polymerase chain reaction (RT-PCR) was adopted to obtain total cDNA. PCR reaction was used to amplify full-length fragments of FGF-2 gene with cDNA template. Gene fragments were connected with PMD18-T-Vector, and then were transformed into the competence bacteria TOP10, in which positive clones were identified by means of electrophoresis, plasmid PCR and restriction enzyme digestion. Plasmid was recombined after sequencing. PMD18-T-FGF-2 and PIRES2-EGFP were digested with restriction endonuclease bglⅡ and pst Ⅰ, the cut gene fragments and PIRES2-EGFP were ligated with T4DNA ligase to construct eukaryotic expressing vector.
RESULTS: ①Neonatal SD rat ventricular cells with typical morphology were cultured successfully.②The rat FGF-2 DNA sequence obtained in this experiment was consistent with that included in Genebank.③The sequencing of PIRES2-EGFP-bFGF eukaryotic expressing vector indicated that, FGF-2 had been inserted into PIRES2-EGFP vector.
CONCLUSION: The full-length of rat FGF-2 has been successfully cloned, and its eukaryotic expressing vector was constructed. Establishment of FGF-2 expressing vector will be able to lay the foundation for the further research of transgenic cell preparation and transplantation therapy of myocardial infarction.

Yang LH, Zhang XG, Wang RX, Chen YJ, Lü HJ, Zhang Y, Li XR. Cloning of fibroblast growth factor-2 and construction of its eukaryotic cell expressing vector.Zhongguo Zuzhi Gongcheng Yanjiu yu Linchuang Kangfu 2008;12(15):2875-2878(China) [www.zglckf.com/zglckf/ejournal/upfiles/08-15/15k-2875(ps).pdf]

成纤维细胞生长因子2又称碱性成纤维细胞生长因子是肝素结合生长因子家族成员,可以结合酪氨酸激酶受体[1]。不仅具有促进细胞分裂、增殖、存活、分化及诱导新生血管形成作用[2-3]，而且具有促进损伤血管内皮、软组织和软骨的修复及神经组织损伤的修复和再生。成纤维细胞生长因子2和心肌肥大及心肌梗死还有密切关系[4]，具有保护心脏、治疗局部缺血等作用。故采用成纤维细胞生长因子2基因治疗是近年来研究热点，而成功的成纤维细胞生长因子2基因治疗关键之一是成纤维细胞生长因子2基因的克隆及其真核表达载体的构建，为此，本实验旨在探讨大鼠成纤维细胞生长因子2基因克隆及真核表达载体构建方法，为成纤维细胞生长因子2基因转染治疗心肌梗死奠定基础。

设计：单一样本实验。
单位：苏州大学生物技术研究所和无锡市第一人民医院心内科。
材料：实验于2007-03/06在苏州大学生物技术研究所（P3）完成。①质粒与菌株：克隆载体PMD18-T-vector(takara),真核表达载体PIRES2-EGFP由苏州大学第一附属医院消化科叶建新博士惠赠，大肠杆菌TOP10购自英俊公司。②工具酶和主要试剂：DMEM培养(Invitrogen),小牛血清（Gibco），胰蛋白酶(sigma）,Trizol(GIBCO), 反转录-聚合酶链反应试剂盒，限制性内切酶bglⅡ和pstⅠ，T4DNA连接酶,rtaqDNA聚合酶和LA-taqDNA聚合酶均购自takara生物公司，DNA胶回收试剂盒、小量质粒抽提试剂盒均购自上海华舜公司。③动物：清洁级新生一两天SD大鼠2只，由苏州大学实验动物中心提供，许可证号SCXK(苏)2002-0008。④主要仪器：解剖显微镜(上海尖端广电科技有限公司)，倒置相差显微镜（olympus）。聚合酶链反应仪(德国biomatra公司和美国bioRad公司)，琼脂糖水平凝胶电泳槽（美国伯乐公司）。
设计、实施、评估者：为第一作者与通讯作者，均受过相关专业培训。
技术路线：
心室肌细胞的分离培养：新生一两天的SD大鼠，无菌取其心脏，剪下心尖部心室肌，解剖显微镜下小心剥除血管、黏膜以及结缔组织等。将心室肌组织剪成约1 mm×1 mm×1 mm 组织碎块，2.5 g/L胰酶37 ℃消化10 min，1 200 r/min， 37 ℃ 5 min，离心弃上清，加入含体积分数0.1小牛血清的DMEM,吹打混匀，移液管移入培养瓶中，置培养箱中培养。培养箱条件：37 ℃，体积分数为0.05的CO2饱和度，足够的饱和湿度。
引物设计：根据NCBI数据库里的鼠成纤维细胞生长因子2序列合成上下游引物 Sense: 5’ATG GCT GCC AGT AGT ATC GCT T 3’(533-554)，Antisense: 5’TCA GAT CTG AGT AGA CAT TGG A 3’(997-976)（上海生工生物工程有限公司合成）。
心室肌细胞总RNA抽提和基因的扩增：心室肌细胞培养至2周左右，以0.5 g/L的胰酶消化 1 min，离心弃上清，磷酸盐缓冲液洗涤1次，Trizol法提取总mRNA。采用反转录-聚合酶链反应的方法反转录成cDNA，再以此cDNA为模板，进行聚合酶链反应，对成纤维细胞生长因子2进行扩增。扩增条件：预变性94℃, 6 min；变性94 ℃，30 s；复性60 ℃，30 s；延伸72 ℃ 35 s；30个循环后72 ℃延伸10 min，扩增出总长度为444 bp的鼠成纤维细胞生长因子2。
获得聚合酶链反应产物按说明书进行割胶回收，与克隆载体PMD18-T连接，16 ℃过夜，转化事先制备好并已放置24 h的TOP10感受态细菌，挑选阳性克隆，进行阳性筛选并抽提重组质粒，经聚合酶链反应、酶切等鉴定后测序（上海英俊生物公司）。
真核表达载体的构建：抽提测序正确菌液的重组质粒，并以此为模板，以带有bglⅡ和pstⅠ酶切位点的引物sense: 5’acg AGATCT acc ATG GCT GCC AGT AGT ATC GCT T 3’(533-554)，anti-sense: 5’ctc CTGCAG TCA GAT CTG AGT AGA CAT TGG A 3’(997-976)。对带有酶切位点的成纤维细胞生长因子2进行扩增，循环和条件同上，再次挑选阳性克隆,经阳性鉴定后抽提其重组质粒，用bglⅡ和pstⅠ对PMD18-T-bFGF和PIRES2-EGFP同时进行双酶切，37 ℃，5 h，将酶切产物电泳，并割胶回收，将回收后的产物按照一定比例的体系在T4DNA连接酶作用下连接16 ℃过夜，再转化TOP10感受态细菌，挑取阳性克隆，经电泳，抽取重组质粒，经酶切、聚合酶链反应等一系列鉴定阳性之后测序(上海英俊公司)。测序正确菌液进行保种以备转染，这样成功构建成纤维细胞生长因子2真核表达载体。

主要观察指标：①心室肌细胞的分离培养结果。②大鼠成纤维细胞生长因子2编码区全长基因的克隆和鉴定。③PIRES2-EGFP-bFGF真核表达载体的构建。

2.1 心室肌细胞的分离培养结果刚培养的心室肌细胞较少，呈圆形，透亮，悬浮在培养基中。几小时后心室肌细胞贴壁生长。第2天可发现心室肌组织块周围有不规则细胞向外生长。几天后，细胞较多，形态呈梭形。第3，4天细胞生长成团状，折光性强，并出现自律性搏动，可持续2周左右，见图1。有部分细胞可呈聚团生长，以团为中心向外进行生长，见图2。培养至1个月以后的心肌细胞出现分化状态。

2.2 大鼠成纤维细胞生长因子2编码区全长基因的克隆和鉴定用反转录-聚合酶链反应的方法扩增的大鼠成纤维细胞生长因子2基因全长444 bp，装入PMD18-T-vector后，挑取阳性克隆进行经电泳，抽取重组质粒，经酶切、聚合酶链反应鉴定并测序，见图3。结果显示所获DNA序列与GeneBank中收录的大鼠成纤维细胞生长因子2序列完全一致。
2.3 PIRES2-EGFP-bFGF真核表达载体的构建将PMD18-T-bFGF为模板用带有酶切位点的引物经聚合酶链反应扩增获得的成纤维细胞生因子2再次与PMD18-T-vector连接，挑取阳性克隆经鉴定送测序后，抽取重组质粒，用bglⅡ和pstⅠ进行双酶切，同时双酶切空的真核质粒载体PIRES2-EGFP，将酶切之后的产物连接16℃过夜，转化TOP10感受态细菌之后挑取阳性克隆，经聚合酶链反应和酶切鉴定，测序表明成纤维生长因子2成功插入真核表达载体PIRES2-EGFP之中。

成纤维细胞生长因子2属于成纤维细胞生长因子家族，分布比较广泛，现已证实几乎所有的器官、组织、肿瘤和体外培养的细胞中都能检测到[5]。成纤维细胞生长因子2不仅具有促进细胞分裂增殖、诱导新生血管形成和促进损伤血管内皮细胞修复等作用，而且与心肌肥大和心肌梗死有密切的关系。有研究证实直接给梗死的心肌内注射低剂量的成纤维细胞生长因子2可诱导新生血管形成[6]。但在临床实验中，当前最大的限制就是在急性心肌梗后不能将成纤维细胞生长2蛋白及时注入，临床上大多数患者接受手术时已经是数小时之后了，这时候已经属于慢性心肌梗死了[7]。有人在狗身上实验，报告了急性心肌梗死后成纤维细胞生长因子2缓慢释放的效应[8]。实验证明成纤维细胞生长因子2心肌内注射治疗可以提高左心室射血分数，并且在治疗后数天，在心室壁可以发现微血管和小动脉[9]。也有研究发现，心肌内注射成纤维细胞生长因子2比中央静脉注射和冠状动脉注射此因子最终留在心肌内的因子量较多[10]。当前的研究表明，成纤维细胞生长因子2具有心肌保护效应，此效应可以对抗心功能不全和心肌梗死。此效应与冠脉灌注和血管密度无关[11]。心脏受损后，包括缺血再灌注和心肌重构，成纤维细胞生长因子2在心肌中的表达都会上调。据研究，细胞外信号调节激酶（ERK1/2）途经足够在体外诱导心肌肥大[12]，成纤维细胞因子2可以活化p38，p38激活转录因子及细胞增强因子2而使得心肌肥大[13]。另外，成纤维细胞生长因子2诱导的白细胞介素6在细胞中的增量表达需要p38[14]，而白细胞介素6家族类细胞活素通过激活细胞膜gp130信号转导蛋白，可以引起心肌肥大[15]。以上研究表明，成纤维细胞生长因子2在心肌梗死后对保护心脏功能，防止心室重构具有重要作用[16]，因此构建分泌成纤维细胞生长因子2的表达载体具有重要意义。
在成纤维细胞生长因子2的真核表达载体构建过程中，由于大鼠成纤维细胞生长因子2本身的特殊性，所以在引物设计上要多加注意，否则扩增比较困难。由于此因子前半部分GC含量普遍过高，Tm值相对也较高，而后半部分这两者则较正常，故引物设计比较困难，所以在设计引物时要注意上下游引物的起始位置，均衡二者的GC含量和Tm值，还要注意引物长度，以及二聚体的数量，二聚体太多则不易扩增出来，为减少二聚体数量，作者选择了无义突变的方法。
另外，由于周围实验环境以及操作中存在许多RNA酶，故反转录-聚合酶链反应时枪尖之类实验器材需要用DEPC水1∶1000稀释之后浸泡，高压灭菌，避免RNA被空气中的RNA酶降解。新生大鼠心肌消化后，由于新生大鼠心肌繁殖能力较弱，故使用原代培养物。而选择适当的载体也相当重要，本实验中作者选择PIRES-2-EGFP载体，是因为此载体是真核表达载体，不需要病毒辅助，有CMV启动序列，有IRES内核糖进入序列和EGFP基因报告，且表达效率较高，能够满足多种需要。
近年来，心肌梗死发病率逐年升高，冠状动脉性心脏病已成为世界上最常引起死亡的疾病之一。特别是急性心肌梗死，是心血管疾病中最主要的致死原因。对许多患者来说，经皮冠状动脉内成形术和冠状动脉搭桥术都是不可行的[17]。那么在治疗上一种可行的方法就是刺激心脏自身诱导血管发生和动脉形成，通过转染基因编码的血管生成因子这个生物途径可以为广泛的冠心病患者提供另外一种新的治疗方法[18]。成纤维细胞生长因子2就是的能够促使血管发生的首选因子之一[19]。据研究，成纤维细胞生长因子2可以诱导内皮细胞和平滑肌细胞增殖，并刺激血管发生[20]。急性心肌梗死后，心肌的收缩力将大幅度下降，心脏功能将会减低，为了对梗死后的心肌脏进行修复，近年来对骨髓间充质干细胞进行体外移植成为研究的热点，本实验旨在克隆并扩增出成纤维细胞生长因子2基因有效区全长，并将其和镇和表达载体连接，采用一定的方法将成纤维细胞生长因子2转染至骨髓间充质干细胞内，以此提高移植后大鼠体内骨髓间充质干细胞的存活率，此课题受江苏省开放课题研究基金资助，并已取得一定研究成果，如成功克隆多种基因病构建其载体，成功培养出大鼠骨髓间充质干细胞并诱导其向心肌样细胞分化。
总之，通过上述方法构建的PIRES-2-EGFP真核表达载体具有以下特点：①构建方法简便。②含有内核糖进入位点IRES。③含有CMV启动序列。④转染时不需要辅助病毒，转染效率高。⑤有EGFP报告基因可作为转染细胞后的移植示踪。本实验为进一步研究成纤维细胞生长因子2的生物学效应，探讨其作用机制及基因治疗心肌梗死等疾病的研究奠定基础。

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