小鼠皮肤损伤修复过程中白细胞介素1α和白细胞介素1β变化与
损伤时间的关系★
李 树1，王 杰2
应用要点：①选择的观察对象为特殊人群，对于肥胖人群步态特征的研究刚刚开始，已有的研究主要是运动学分析，对肥胖人步态动力学的系统分析还很少，国内几乎还是空白。②利用的测试仪器为国际先进的足底压测试系统。
同行评价：对正常人群足底压力和步态的研究较多，但未见对肥胖青年进行足底压力和步态研究。本文设计合理，方法较先进可靠，数据可信，因此，本文结果有一定的应用意义，并且对肥胖的预防也有一定的参考价值。
相关链接：足底压力研究，揭示了人体在不同状态下的足底压力分布特征和模式，以及运动过程中足的动力性特征。同时，足底压力测量技术在临床步态研究和临床医疗中的不断应用与深入，已逐渐成为临床生物力学研究和诊断病足与足部康复评定的重要手段。通过足-鞋界压力的研究，也为指导人们健康穿鞋与科学制鞋带来了科学理论依据。
1中国刑事警察学院法医学系，辽宁省沈阳市 110035；2沈阳医学院基础医学部生物化学与分子生物学教研室，辽宁省沈阳市
110034
李 树★，女，1964年生，吉林省辽源市人，汉族，1989年中国刑警学院法医专业双学位毕业，硕士，副教授，主要从事DNA多态性分析的研究。
lishu19852006@126.com
通讯作者：王 杰，教授，硕士生导师，沈阳医学院基础医学院副院长，沈阳医学院生物化学及分子生物学教研室，辽宁省沈阳市
110034
wangjie19932002@
163.com
摘要
目的：研究表明，细胞因子在各种炎症反应、损伤修复及细胞突变过程中发挥着重要作用，并且有望成为推断损伤时间新的有效指标。实验拟验证皮肤损伤后损伤区组织内不同时间白细胞介素1α和白细胞介素1β基因表达的变化及其与损伤时间的关系。
方法：实验于2006-03/2007-12在中国刑警学院法医系实验室完成。①实验材料：清洁级BALB/c纯系雄性小白鼠35只，体质量25~27 g。②实验方法：建立动物皮肤损伤模型，在脊柱两侧1.0 cm 处，左右对称各做一处皮肤缺损损伤，损伤不伤及肌肉，每只鼠做3对损伤。损伤后分别在0，3，6，12 h，1，3，6 d（0 h 作为对照）取5只动物麻醉断头处死。③实验评估：免疫组织化学染色后，显微镜下观察不同时间点白细胞的变化，实时定量聚合酶链反应检测白细胞介素1α和白细胞介素1β两种炎症因子的基因表达。
结果：纳入BALB/c纯系雄性小白鼠35只，均进入结果分析。①伤后0~5 h，皮肤创缘呈弱阳性反应；伤后6~24 h，表皮阳性反应减弱，创伤局部以巨噬细胞为主的阳性细胞逐渐增多。伤后1 d 可见嗜中性白细胞大量浸润及少量单核细胞；伤后2~4 d，单核细胞数目逐渐增加，3 d 达高峰。对照组皮肤表皮、毛囊、皮脂腺和汗腺均呈弱阳性反应。②皮肤损伤后在早期可诱导白细胞介素1α和白细胞介素1β的基因表达，6 h 达第一次高峰，24 h 下降，第3天再次出现高峰，第6天下降至正常水平。
结论：损伤组织中白细胞介素1α和白细胞介素1β的基因表达随伤后不同时间呈现一定规律性变化，可为法医学案例早期损伤时间的推断提供参考。
关键词：损伤时间；细胞因子；皮肤损伤；基因表达；实时定量聚合酶链反应；组织构建
李树，王杰. 小鼠皮肤损伤修复过程中白细胞介素1α和白细胞介素1β变化与损伤时间的关系 [J].中国组织工程研究与临床康复，2008，12(15):2879-2882 [www.zglckf.com/zglckf/ejournal/upfiles/08-15/15k-2879(ps).pdf]
中图分类号:R392.114
文献标识码:B
文章编号:1673-8225
(2008)15-02879-04
收稿日期：2007-12-07 修回日期：2008-02-12 (07-50-12-6803/WL·Y)
Time-course analysis of interleukin 1 alpha and 1 beta gene expression during the skin wound healing in mice
Abstract
AIM: Studies reveal that, cytokines play an important role in the process of various inflammatory reaction, wound repair and cell mutation, also, cytokines are expected to be a novel indicator of ratiocinating wound time. This study was designed to explore the changes in gene expression of interlukin-1α (IL-1α) and interlukin-1β (IL-1β) during the skin wound healing process in mice at different phases.
METHODS: The experiment was carried out in the laboratory of Forensic Medicine Department of China Criminal Police University from March 2006 to December 2007. ①Thirty-five BALB/c inbred male white mice of cleaning grade, aged 25-27 g, were used in this study. ②Skin wound model was induced by injuries in the area of 1.0 cm away from two sides of spinal column, without affection on muscles. Three pairs of injuries were established in each mouse. Five animals were decapitated under anesthesia at 0, 3, 6, 12 hours and 1, 3, 6 days, respectively, whereas those at 0 hour were taken as controls. ③The white blood cells at different phases were observed under microscope after immunochemical staining. Real-time quantitative polymerase chain reaction method was applied to detect gene expression of IL-1α and IL-1β.
RESULTS: Thirty-five BALB-c inbred male white mice were all involved in the result analysis. ①Skin wound was weakly positive during 0-5 hours after injury; the positive reaction was attenuated during 6-24 hours, and positive cells increased, of which macrophages were dominant. Infiltration of massive leucocyte neutrophils and a small quantity of mononuclear cells were detectable at 1 day; mononuclear cells increased during 2-4 days, and reached a peak at 3 days. In control group, the epidermis, folliculus pili, glandulae sebaceae and coil gland were all weakly positive. ②IL-1α and IL-1β were expressed at early phase after injury, and two expressing peaks were found at 6 and 72 hours, then decreased to normalized levels at 6 days after injury.
CONCLUSION: Genet expression of IL-1α and IL-1β in damaged tissues has a regularity with wound time, and can be used for reference to estimate early injury age in forensic cases.
Li S, Wang J. Time-course analysis of interleukin 1 alpha and 1 beta gene expression during the skin wound healing in mice.Zhongguo Zuzhi Gongcheng Yanjiu yu Linchuang Kangfu 2008;12(15):2879-2882(China)
[www.zglckf.com/zglckf/ejournal/upfiles/08-15/15k-2879(ps).pdf]
0 引言
随着分子生物学和细胞生物学技术的发展，人们越来越认识到创伤修复是一个在时间和空间上受修复因子调控的复杂生物学过程，多种生物活性物质，如胶原纤维、粘附分子、酶等在创伤修复的不同阶段发挥着重要的调节作用，同时它们在创伤修复中的表达和损伤时间密切相关[1-6]。其中细胞因子在各种炎症反应、损伤修复及细胞突变过程中发挥着重要作用[1,6]。因此，细胞因子有望成为推断损伤时间的新的有效指标。
本实验通过检测损伤后不同时间白细胞介素1α和白细胞介素1β基因表达的变化，分析损伤修复过程中这些因子的基因表达，并与损伤的变化进行比较，探索细胞因子在损伤修复过程中的协调关系，以及作为推断损伤时间标志物的可行性。
1 材料和方法
设计：随机对照动物实验。
单位：中国刑警学院。
材料：实验于2006-03/2007-12在中国刑警学院法医系实验室完成。清洁级BALB/c纯系雄性小白鼠35只，体质量25~27 g，购自日本三协株式会社。按照实验动物饲养标准，在沈阳医学院动物实验中心饲养。
主要试剂及仪器：ISOGEN购自Nippon Gene，Japan ife technology；TaqDNA聚合酶、大白鼠抗鼠F4/80抗体（大日本制药，大阪）；兔抗Myeloperoxidase抗体（Neomarkers，USA）；引物合成、碱基测序由大连TaKaRa生物工程有限公司完成；SYBR Green PCR Master Mix试剂盒为美国ABI公司产品，β-actin基因的检测灵敏度为1.47个拷贝，线性范围为1010~104拷贝/mL，R2为0.998，有效率为100%。实时定量聚合酶链反应扩增仪为ABI PRISM 7700 Sequence Detection SystemTM(美国ABI公司)；显色系统Catalyzed signal amplification system购自日本Duko株式会社，京都。
设计、实施、评估者：实验设计及评估为第一作者，干预实施为全部作者，均经过正规培训，采用盲法评估。
方法：
实验动物皮肤损伤模型的建立：取上述小白鼠，腹腔注射Nembutal（5 μg/g），麻醉后剃除背部毛发，常规消毒背部皮肤，然后用直径为4.0 mm 的圆形无菌手术刀在背部行皮肤切创，在脊柱两侧1.0 cm 处，左右对称各做一处皮肤缺损损伤，损伤不伤及肌肉，每只鼠做3对损伤。损伤形成后，不包扎，不施药，于无菌实验室内单笼饲养，给与消毒食物和饮水。损伤后分别在0，3，6，12 h，1，3，6 d 照相（0 h 作为对照），每个时间点取5只动物断头处死，用直径为8.0 mm 的圆形取材刀，以损伤面为中心取损伤处皮肤，做免疫组织化学和分子生物学样本处理。
免疫组织化学染色和白细胞计数：用40 g/L 中性多聚甲醛缓冲固定液固定检材12 h（室温），低熔点石蜡定向包埋后切为厚4 μm 切片。一次抗体：大白鼠抗鼠F4/80抗体用于单核细胞染色，兔抗Myeloperoxidase抗体用于嗜中性白细胞染色；二次抗体：生物素标记的兔抗大白鼠免疫球蛋白IgG抗体和生物素标记的山羊抗兔免疫球蛋白IgG抗体；显色系统用Catalyzed signal amplification system和DAB显色。染色后，用光学显微镜放大100倍，在损伤区域内随机选取5个视野，计数每个视野内阳性细胞的个数，取5个视野细胞数的平均值。
总RNA提取：取上述皮肤检材放入1.5 mL 小试管中，加入ISOGEN 1.0 mL，研磨成匀浆状后，室温放置5 min，加入氯仿0.2 mL，轻微振荡后4 ℃ 15 000 r/min 离心15 min，将上层（水层）移入新管后加异戊醇500 μL，室温静止 10 min，4 ℃ 15 000 r/min 离心10 min，弃上清后加体积分数为0.8的乙醇洗涤1次，室温干燥5~10 min，加入20 μL 去离子水溶解RNA沉淀，然后用紫外分光光度计测定浓度后备用。
实时定量聚合酶链反应：采用25 μL 反应体系：2×SYBR Green PCR SupurMix 12.5 μL，cDNA Template 2.0 μL，上下游引物各1.0 μL，超纯水补足体系。反应条件为：50 ℃ 10 s，95 ℃ 10 min，然后95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，共35个循环。反应体系扩增参数：50 ℃ 2 min，95 ℃ 预变性2 min，循环95 ℃ 变性15 s，60 ℃ 退火30 s，72 ℃ 延伸30 s，共45个循环。同一cDNA模板均在同一反应条件下行3次重复实验。每次扩增均设无模板对照。根据标准定量曲线进行聚合酶链反应产物的定量分析。各基因的引物序列及聚合酶连反应条件见表1。以上序列由大连TaKaRa生物工程有限公司合成。
主要观察指标：①伤口的恢复情况。②损伤后不同时间点白细胞的变化。③实时定量聚合酶链反应检测白细胞介素1α和白细胞介素1β基因的表达。
统计学方法：由第一作者采用SPSS 11.0软件完成统计处理，所有数据以_x±s表示。组间比较行 t 检验，P < 0.05为差异有显著性意义。
2 结果
2.1 实验动物数量分析 纳入BALB/c纯系雄性小白鼠35只，均进入结果分析，无脱落。
2.2 伤口的收缩和恢复 在损伤第1天，伤口缩小到原损伤的（87.6±6.7）%，第3天时缩小到（68.9±6.5）%，第6天已缩至（48.6±8.3）%，小于原伤口的50%，第12天时完全恢复，见图1。
2.3 损伤后不同时间点白细胞的变化 伤后0~5 h，皮肤创缘呈弱阳性反应，随伤后经过时间延长，近创缘表皮阳性染色逐渐增强，但远离创缘的阳性程度无变化或略增强；伤后6~24 h，表皮阳性反应减弱，创伤局部以巨噬细胞为主的阳性细胞逐渐增多，毛囊上皮阳性反应增强；伤后1 d 可见嗜中性白细胞大量浸润及少量单核细胞；伤后2~4 d，肉芽组织、真皮层及皮下组织内嗜中性白细胞减少，而单核细胞数目逐渐增加，3 d 达高峰，部分新生表皮细胞呈阳性反应；伤后3~6 d 阳性细胞明显减少。对照组皮肤表皮、毛囊、皮脂腺和汗腺均呈弱阳性反应。动物死后0.5~3.0 h 皮肤表皮呈弱阳性染色。
2.4 实时定量聚合酶链反应检测细胞因子的基因表达 结果显示，皮肤切除后在早期可诱导白细胞介素1α和白细胞介素1β的基因表达，6 h 达第一次高峰，24 h 下降，第3天再次出现高峰，第6天下降至正常水平，见图2。
2.5 可能影响结果的因素分析 SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR法因其定量原理的缘故，除与特异性产物双链结合外，尚可以与其他非特异的产物（特别是引物二聚体）结合，影响定量的灵敏度和特异度。因此，实时荧光定量PCR法可以制作融解曲线、调节引物以及模板浓度、以及使用热启动酶和UNG酶等方法从而提高其特异性。本实验建立了SYBR GreenⅠ荧光定量PCR检测白细胞介素1α和白细胞介素1β的标准曲线，未加入UNG酶和热启动酶，线性范围从109~104拷贝/mL，曲线的R2为0.996，检测的灵敏度为78拷贝（结果未显示）。故SYBR GreenⅠ荧光定量PCR法可以用来检测白细胞介素1α和白细胞介素1β，灵敏度与特异度高，重复性好，可以高通量、准确检测。
3 讨论
推断损伤时间方法目前多通过肉眼观察损伤处形态学变化来粗略推断，通过观察损伤处炎症细胞的种类和数量来判定损伤时间，通过损伤处组织中酶的改变判定损伤时间等[7-10]。
研究表明，机体组织在损伤的每个时期都有不同的细胞因子在发挥作用，如引起组织收缩、诱导炎性细胞浸润、决定浸润炎细胞的种类、调节炎症反应的程度、诱导纤维母细胞分化及肉芽组织形成、诱导上皮组织形成等[11-12]。因此，在损伤的每个时期都有不同的细胞因子在发挥作用，检查损伤处组织中不同细胞因子的表达情况可以用于推断损伤时间。目前已有学者开展了这些工作，如对人体或鼠类皮肤刺伤后白细胞介素1α、白细胞介素8以及转化生长因子β1等因子的变化进行分析，发现了这些因子的变化规律[4-7]。特别是其炎症因子在损伤早期即出现变化，它们通过自身量的改变，发动机体的炎症反应，使毛细血管壁通透性增加，诱导炎性细胞向损伤区域浸润，调节炎症细胞分泌各种相关的细胞因子，从而使损伤进入修复过程。
实时荧光定量聚合酶链反应技术是一种用于定量测定起始模板拷贝数的新技术，荧光检测的灵敏度很高，该技术通过对目标核酸的精确定量与定性检测，被广泛用于基因表达分析、基因分型等多种应用中[13-16]。本实验应用实时荧光定量聚合酶链反应技术检测白细胞介素1α和白细胞介素1β在损伤早期的变化，结果表明这两种细胞因子都呈现有规律的变化，在损伤早期(3~6 h)出现第一次表达高峰，1 d 下降至最低后，伤后第3天又出现一次高峰。第一次高峰可能是由于这些细胞因子产生的细胞在受到损伤刺激后立即释放贮存于细胞内的mRNA，迅速产生相应的细胞因子，这些细胞因子在诱导和发动炎症反应的同时，又通过自身分泌作用刺激细胞因子产生细胞，使之产生更多的同类细胞因子，形成第二次表达高峰，这个过程大约需要2 d 左右。与此同时，通过细胞因子的旁分泌作用和激素样作用刺激相应的细胞，产生其他相关的细胞因子，形成各种因子的协调工作网，共同完成损伤的修复过程。
据报道单核细胞趋化蛋白1、吞噬细胞炎性蛋白1α以及吞噬细胞炎性蛋白2在损伤后6 h 左右开始出现，72 h 达高峰，然后呈下降趋势[8]。在损伤修复的整个过程中，在不同的阶段检查不同的细胞因子，或对同一被检组织同时检查多种不同的细胞因子来推测损伤时间是完全可行的，而本实验所选择的白细胞介素1α和白细胞介素1β更适合于损伤早期的时间推断。
研究表明，皮肤受到损伤后6~8 h 中性粒细胞首先游出，12 h 左右中性粒细胞占多数，2 d 后损伤区组织内以单核细胞浸润为主，嗜中性粒细胞大多崩解消失[17]。本实验结果显示，损伤后1 d 嗜中性粒细胞浸润达高峰，3 d 后减少，而单核细胞在3 d 达高峰，完全印证了上述报道，而且在损伤修复过程中白细胞浸润与各种细胞因子密切相关 [18-19]，说明嗜中性粒细胞浸润与白细胞介素1α和白细胞介素1β有关。从白细胞浸润和两种被检细胞因子的关系来看，两者都可以用于损伤时间的推断，但细胞因子的改变要早于白细胞的变化。
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