课题背景：课题组目前取得的研究成果包括：①建立优化体外扩增骨髓间充质干细胞的培养体系，达到临床级应用规模，即(1~2)×106/kg受者体质量。②初步证实骨髓间充质干细胞移植适宜的数量范围为（1~5）×106/kg受者体质量，造血干细胞回输前先期回输体外扩增的骨髓间充质干细胞更有利于造血的重建。③就单独输注间充质干细胞联合有效化疗显示的临床效果，正在进行进一步深入的动物实验。

应用要点：①选题上，目前对间充质干细胞支持造血的临床应用研究主要集中于在造血干细胞移植后或与造血干细胞共移植治疗，以缩短造血功能的恢复时间。而化疗后单独输注体外扩增的骨髓间充质干细胞治疗白血病在国内尚无报道，进一步拓宽了骨髓间充质干细胞在治疗血液病中的应用。②方法上，采用密度梯度离心法分离细胞后，体外以无血清培养扩增骨髓间充质干细胞，在保证细胞纯度的同时，避免了含动物血清培养过程中可能的未知病毒等病原体感染人类，应用于临床更为安全。

偏倚或不足：作为在国内骨髓间充质干细胞单独用于白血病治疗的首次报道，主要不足之处是病例数少，仅1例。由于缺乏相类似的病例作比较，以及尚无足够的理论依据，此法适用性及安全性均有待进一步验证与观察。

1南京医科大学第一附属医院血液科，江苏省南京市 210029；2南京医科大学附属儿童医院血液科，江苏省南京市 210008

陆世丰★，男，1979年生，江苏省常熟市人，汉族，南京医科大学在读硕士，主要从事人骨髓间充质干细胞、急性白血病、蛋白酶体抑制剂靶向治疗方面的研究。
maclsf@yahoo.
com.cn

通讯作者：陆 化，博士，主任医师，教授，南京医科大学第一附属医院血液科，江苏省南京市 210029
luhua56@e165.
com

2007江苏省高校自然科学基础研究项目
(07KJB320074)*；江苏省2005年第二批省级产业技术研究与开发项目(20051125)*；2007年度南京医科大学科技发展基金项目(07NMU M
080)*

摘要
目的:回顾性分析化疗后骨髓抑制期输注体外扩增的异基因骨髓间充质干细胞治疗低增生性复发难治性急性髓细胞白血病的可行性与安全性。
方法：①53岁女性患者1例，2002-01在南京医科大学第一附属医院确诊为急性髓细胞性白血病M0型，予HA、EA等诱导方案化疗后达完全缓解，在随后的4年中给予包括MA、中剂量Ara-C、DA、TA在内的多次巩固治疗以维持完全缓解。2006-01中性粒细胞缺乏，白血病复发。同年3月再次给予TAE方案诱导治疗未缓解，骨髓持续低增生，并持续粒细胞缺乏达半年。②患者有一位HLA配型完全相合的同胞姐姐，为行异体造血干细胞移植，于2006-07再次入院，患者及其家属对治疗知情同意，实验经医院伦理委员会批准。③患者于2006-08-23予CAG方案化疗，即阿柔比星10 mg/d，×8 d；阿糖胞苷15 mg/次，2次/d，×14 d；2006-08-23~2006-09-25给予洁欣300 μg/d。化疗过程中骨髓抑制进一步加重，并出现霉菌性败血症等重症感染。抗感染治疗的同时，于CAG化疗结束后第2天输注经体外扩增的异基因骨髓间充质干细胞，细胞数为1.4×106/kg受者体质量，以促进骨髓造血恢复支持治疗。
结果：异基因骨髓间充质干细胞输注后第15天，中性粒细胞数达到半年多来第1次大于0.5×109 L-1。输注1个月后，外周血白细胞数5.5×109 L-1，中性粒细胞数4.64×109 L-1，血红蛋白量94 g/L，血小板数25×109 L-1，外周血象渐恢复正常水平。复查骨髓涂片显示骨髓三系增生活跃，原始细胞占0.4%，骨髓流式细胞仪检查MRD阴性，骨髓达完全缓解，感染症状逐渐控制。随访半年，患者持续完全缓解，未有移植物抗宿主病等并发症出现。
结论：CAG方案联合输注体外扩增的异体骨髓间充质干细胞有助于衰竭骨髓的造血重建，对长期反复化疗后出现低增生性复发难治急性白血病患者的治疗是一个新的有前途的方法，但其安全性与有效性需要通过临床试验进一步证实。
关键词：骨髓间充质干细胞；急性白血病；粒细胞集落刺激因子；预激

陆世丰，陆化，刘澎，沈文怡，洪鸣，张建富，杨慧，李建勇.CAG预激方案与异基因骨髓间充质干细胞输注联合治疗低增生复发难治急性髓细胞白血病1例[J].中国组织工程研究与临床康复，2008，12(16):3006-3010
[www.zglckf.com/zglckf/ejournal/upfiles/08-16/16k-3006(ps).pdf]

中图分类号: R394.2
文献标识码: A
文章编号: 1673-8225
(2008)16-03006-05

收稿日期：2007- 09-24
修回日期：2008-01-24
(07-50-9-5240/ZS·A)

CAG regimen combined with infusion of allogenetic bone marrow mesenchymal stem cells for treatment of hypoplastic relapsed acute myelogenous leukemia: One case report

Abstract

AIM:To analyze the practicability and safety of the infusion of expanded in vitro human bone marrow-derived mesenchymal stem cells (MSCs) for a refractory and relapsed acute myeloid leukemia (AML) with hypo-proliferative bone marrow after chemotherapy.
METHODS: A 53-year-old woman was admitted to the First Affiliated Hospital of Nanjing Medical University in January 2002 and diagnosed with acute myeloid leukemia type M0, according to the French-American-British (FAB) classification. Complete remission (CR) was achieved after two courses of standard AML induction chemotherapy, consisting of homoharringtonine, etoposide, and Ara-C (cytarabine). An additional course of intensive chemotherapy (mitoxantrone, intermediate-dose cytarabine, daunomycin, and pirarubicin) was carried out for four years. In January 2006, a bone marrow examination revealed a hypocellular marrow with 47.6% blast cells. In March 2006, although she received a TAE regimen (pirarubicin, cytarabine, and etoposide), she did not achieve CR. A hypocellular marrow and severe agranulocytosis was maintained for approximately six months. Since she had a HLA-identical sibling sister, the patient was again admitted to hospital in July 2006 for human leukocyte antigen-identical allogeneic stem cell transplantation. Informed consents were obtained from the patient and her family members and the protocol was approved by Hospital Ethics Committee. On August 23rd 2006, she received a CAG regimen which consisted of aclarubicin (10 mg/d for 8 days), Ara-C (15 mg/d, twice daily for 14 days), and granulocyte colony-stimulating factor (G-CSF, 300 μg/d from August 23rd to September 25th). During the course of chemotherapy of CAG, the patient developed severe invasive fungal infection. The patient received anti-infection treatment and infusion of expanded in vitro allogeneic MSCs from her human leukocyte antigen-identical sibling sister on the second day of the CAG regimen. The patient received a total of 1.4×106 mesenchymal cells/kg body mass to promote marrow hematogenesis recovery.
RESULTS: Fifteen days after MSC infusion, neutrophil granulocytes (NG) rose above 0.5×109 L-1. One month after MSC infusion, white blood cells count was 5.5×109 L-1, NG was 4.64×109 L-1, haemoglobin levels were 94 g/L, and platelets were 25×109 L-1. Peripheral blood gradually recovered to normal levels. Bone marrow examination revealed 0.4% blast cells with tri-lineage engraftment, while flow cytometry examination detected no micro-residual disease (MRD). She achieved CR again and recovered from severe invasive fungal infection. In the follow-up for 6 months, the patient maintained status of CR without any evidence of leukemia relapse or graft-versus-host disease.
CONCLUSION: It is suggested that the combination of CAG regimen based on G-CSF priming, followed by infusion of MSCs is a promising new approach for the therapy of refractory and relapsed acute myeloid leukemia with long-term agranulocytosis. However, safety and efficacy need further validation by clinical trials.

Lu SF, Lu H, Liu P, Shen WY, Hong M, Zhang JF, Yang H, Li JY.CAG regimen combined with infusion of allogenetic bone marrow mesenchymal stem cells for treatment of hypoplastic relapsed acute myelogenous leukemia: One case report.Zhongguo Zuzhi Gongcheng Yanjiu yu Linchuang Kangfu 2008;12(16):3006-3010(China)
[www.zglckf.com/zglckf/ejournal/upfiles/08-16/16k-3006(ps).pdf]

0 引言

急性髓细胞白血病是一种较常见的危及人类生命的血液系统恶性肿瘤，在过去的20年中，对于急性髓细胞白血病的治疗取得了一定进展，使初治成人急性髓细胞白血病完全缓解率达60%~70%[1]。但仍有一部分患者特别是反复化疗后对一线化疗药物不敏感，以及对骨髓造血微环境破坏所致的造血不易恢复，均成为难治因素，而且大部分获得完全缓解的患者在3年内也会复发，这直接影响了急性髓细胞白血病患者的疗效及预后，如何提高难治复发性急性髓细胞白血病患者的疗效成为其治疗的关键。
在反复化疗或清髓性造血干细胞移植过程中，对骨髓造血的抑制及对骨髓微环境的破坏是影响患者长期生存或移植成功与否的主要因素之一[2]。骨髓间充质干细胞是一类具有分裂、增殖、分化形成多种间质细胞潜能的干细胞，能分化生成多种骨髓基质细胞和分泌多种细胞因子，是骨髓微环境的重要组成部分，为造血干细胞的分裂、增殖、分化提供微环 境[3]。在之前的对恶性淋巴瘤的研究中，本课题组已证实骨髓造血干细胞移植后输注自体体外扩增的充质干细胞可加速造血重建[4]，近期对1例危重型低增生性急性髓细胞白血病化疗后并发重症感染患者输注体外扩增的异基因间充质干细胞支持治疗，获得成功。

1 材料和方法

设计：回顾性病例分析。
单位：南京医科大学第一附属医院血液科，南京医科大学附属儿童医院血液科。
对象：患者女，53岁，2002-01因发热5 d在南京医科大学第一附属医院确诊为低增生性急性髓细胞性白血病M0型，染色体检查正常。2002-02应用HA方案（高三尖杉酯碱 2 mg/m2，×7 d；阿糖胞苷100 mg/m2，×7 d）、2002-03应用EA方案（依托泊苷60 mg/m2，×7 d；阿糖胞苷100 mg/m2，×7 d）均未达缓解，至2002-04再次给予EA方案后达完全缓解。
在随后的4年中，分别于2002-07予MA方案（米托蒽醌10 mg/m2，×3 d；阿糖胞苷 100 mg/m2，×7 d）、2002-09予MA方案、2002-12予中剂量阿糖胞苷方案（每次阿糖胞苷2 g/m2，2次/d，×3 d）、2003-03予MA方案、2003-07予MA方案、2003-11予DA方案（柔红霉素 40 mg/m2，×3 d；阿糖胞苷100 mg/m2，×7 d）、2004-04予DA方案、2004-09予MA方案、2005-03予TA方案（吡柔比星40 mg/m2，×3 d；阿糖胞苷100 mg/m2，×7 d），患者持续达完全缓解。
2006-01来本院门诊随访，查外周血象提示中性粒细胞缺乏，仅为0.4×109 L-1，血红蛋白与血小板正常，临床无症状，当时未予其他特殊检查与治疗。同年3月再次查血常规，白细胞1.6×109L-1，中性粒细胞0.08×109 L-1，血红蛋白 85 g/L，血小板35×109 L-1，骨髓涂片示骨髓增生尚活跃，原始细胞占63.2%，红系、巨核系增生低下。考虑白血病复发，当月入住本院血液科，予TAE方案化疗（吡柔比星40 mg，×3 d；阿糖胞苷100 mg，×7 d；依托泊苷100 mg，×5 d）。化疗后骨髓抑制明显，3月25日始加用粒细胞集落刺激因子300μg/d，连续使用48 d（至5月11日）仍持续中性粒细胞缺乏，血白细胞3.4×109 L-1，


中性粒细胞0.25×109 L-1，血红蛋白75.9 g/L，血小板118×109 L-1，查骨髓涂片示骨髓增生极度减低，原始细胞3%。其后在近两个月的院外门诊随访中，无需输血支持治疗，血红蛋白 > 100 g/L，血小板 > 100×109 L-1，但仍持续中性粒细胞缺乏。患者有一位HLA配型完全相合的同胞姐姐，为行异体造血干细胞移植，于2006-07再次入院，患者及其家属对治疗知情同意，实验经医院医学伦理委员会批准。
设计、实施、评估者：实验设计为第一、二、七作者，实施者为第一~六作者，由本课题组共同评估，均经过系统培训，未使用盲法评估。
方法：
无菌操作下抽取与患者HLA相合的同胞姐姐的胸骨骨髓液25 mL，肝素抗凝。向骨髓液中加入DMEM-LG稀释，再加入1.073 g/mL的Percoll液，1 350 g离心30 min，分离单个核细胞并收集，用DMEM-LG洗2次，计数并调整细胞浓度，按(2~5)×109 L-1接种于培养皿，加入MesenCult培养液至终体积为10 mL，置37 ℃、体积分数为0.05的CO2饱和湿度培养箱中。24 h后弃悬浮细胞，加入新鲜的MesenCult培养液，待贴壁细胞达80%~90%融合后，用2.5 g/L胰酶消化、传代。扩增至第3代计数，冻存备用。细胞冻存采用10%DMSO、20%人血白蛋白、70%DMEM-LG体系，4 ℃ 30 min，20 ℃ 1 h后，转移至-80 ℃低温冰箱备用。
患者入院后查骨髓涂片示骨髓增生减低，原始粒细胞占21%，外周血白细胞0.8×109 L-1，中性粒细胞为0，血红蛋白105 g/L，血小板102×109 L-1。移植前评估，结核菌素试验PPD(+++)（胸部CT未见结核病灶），血沉54 mm/H。考虑到造血干细胞移植风险与成功率，暂缓行异体造血干细胞移植。2006-08-23给予CAG方案化疗：阿柔比星10 mg/d，×8 d；阿糖胞苷15 mg/次，2次/d，×14 d；2006-08-23~2006-09-25给予粒细胞集落刺激因子300μg/d。化疗过程中骨髓进一步抑制，化疗结束即出现高热及咳嗽咳痰等肺部症状，痰培养示耐甲氧西林表皮葡萄球菌生长，两次血培养示光滑假丝酵母生长，考虑肺部感染及霉菌性败血症，予两性霉素B、舒普深、泰能、稳可信等抗感染治疗。同时在化疗结束后第2天（2006-09-07）予输注其胞姐的经体外扩增的骨髓间充质干细胞，细胞数为1.4×106/kg受者体质量。输注前0.5 h，使用地塞米松10 mg静推，非那更25 mg肌注，输注时使用普通一次性输液器，细胞在0.5 h内输完。期间及后 3 d监测生命体征平稳，未出现即刻或迟发不良反应，输注后延续使用粒细胞集落刺激因子300 μg/d近两周。
主要观察指标：①移植后造血重建情况。②移植后器官排异情况。

2 结果

骨髓间充质干细胞输注后半个月内，患者仍持续高热，热峰在40 ℃以上，伴咳嗽、咳痰及咯血，2006-09-26胸片示两侧肺部多发粟粒状高密度影伴左侧胸腔积液，并在半个月后发展为胸片可见的的两肺多处囊状及囊内结节影，考虑霉菌性肺炎，将两性霉性B改为斯皮仁诺继续抗霉菌治疗。
在输注后第15天，中性粒细胞达到半年多来第1次大于0.5×109 L-1，进而外周血三系均有明显改善。输注1个月后，无需输血支持，外周血白细胞109 L-1，中性粒细胞4.64×109 L-1，血红蛋白94 g/L，血小板25×109 L-1，并渐恢复到正常水平（图1）。复查骨髓涂片显示骨髓三系增生活跃，原始细胞占0.4%，骨髓流式细胞仪检查MRD阴性。

随着血象的恢复，输注1个月后患者的生命体征渐平稳，10月4日及10月9日送检的两次痰培养和血培养均呈阴性。复查胸部CT示双肺多发散在病灶较之前有明显吸收，好转出院。随访半年，患者持续完全缓解，未有移植物抗宿主病等并发症出现。

3 讨论

急性髓细胞性白血病治疗目前主要以标准剂量的诱导方案化疗及缓解后巩固治疗为主，很大部分患者应在缓解后尽早行异基因造血干细胞细胞移植。而长期反复化疗或是清髓性造血干细胞细胞过程中，对骨髓造血微环境的破坏比较明显。骨髓间充质干细胞是骨髓基质中的一种非造血细胞，产生多种细胞因子，与造血干细胞接触，一方面有利于骨髓微环境的形成和功能完整，另一方面有利于对正常造血的支持和刺激[5]。反复化疗引起的间充质干细胞受损必然影响骨髓造血的恢复或是重建。本例患者发病后予诱导方案化疗并巩固治疗4年，维持完全缓解状态。但4年后复发，表现为低增生性急性白血病复发。复发后给予DAE方案化疗对诱导骨髓缓解起了一定的作用，但同时进一步加重了对骨髓的抑制，并持续了半年以上的粒细胞缺乏症，在此期间使用了近2个月的粒细胞集落刺激因子，并未显示出任何疗效，考虑可能与反复化疗所致的对骨髓造血微环境与造血干细胞损伤以及反复化疗可能引起部分粒细胞集落刺激因子受体的缺陷[6]有关，临床上属难治复发型低增生性急性白血病。其造血干细胞及造血微环境受损明显，异基因造血干细胞移植有望成为其再次达完全缓解或治愈的手段，但由于考虑其存在结核感染，移植风险较大，暂缓行这一方案。
目前低增生性急性髓系白血病化疗尚无公认的经典方案, 国内外多例报导，在对初发的低增生性或复发的难治性急性髓系白血病的患者治疗中，应用粒细胞集落刺激因子预激配合小剂量化疗的方案取得了一定疗效[7-8]。而类似本例患者因长期反复化疗药物对骨髓干细胞的损伤及对骨髓造血微环境的破坏引起的复发型低增生性急性白血病预后较差，治疗相关死亡率高。在无法进行异基因造血干细胞移植的情况下，运用粒细胞集落刺激因子预激为基础的CAG方案的同时，联合输注体外扩增的异基因间充质干细胞治疗，取得意想不到的疗效，输注半个月后中性粒细胞自复发后半年来首次恢复到0.5×109 L-1以上，骨髓再次达到了完全缓解，并在随后的一段时间内患者严重致命性的霉菌性败血症伴肺部感染得到了控制。
骨髓间充质干细胞是一类具有分裂、增殖、分化形成多种间质细胞潜能的干细胞，易于获得、扩增、多系分化等优点已经为细胞及组织工程提供了广阔的前景[9-10]，动物实验及前期临床试验证实了其在支持造血干细胞的造血中的安全性与可行性。许多动物与临床试验成功治疗了诸如软骨缺陷、血管性缺血、冠心病，甚至局部损伤的修复[11-14]。骨髓间充质干细胞产生基质细胞构成骨髓微环境，而此微环境的改变是许多血液病发生或转归的关键。所以在血液病领域的应用，更显示了其广阔的前景。KOC[15]最早于2000年报道了骨髓间充质干细胞与骨髓造血干细胞共移植成功治疗乳癌患者。本课题组之前的临床研究也表明，骨髓间充质干细胞在血液恶性病造血干细胞移植后能促进造血恢复。进一步的研究中，使用自体和异体骨髓间充质干细胞先后输注支持1例危重型恶性淋巴瘤的化疗也显示了良好的促进造血恢复的疗效，对于那些失去造血干细胞移植机会或无条件造血干细胞移植且复发难治的血液病患者提供了一个新的有希望的治疗途径。对于本例患者，认为单独输注异体间充质干细胞联合化疗为受损的骨髓微环境的重建、促进体内残存的正常骨髓造血干细胞恢复造血，起到至关重要的作用。
在对本例患者的回顾性分析中进一步认识到，治疗过程中所用的粒细胞集落刺激因子已在一定程度上突破了其原有的单纯治疗粒缺的意义，在整个治疗过程中起了重要的作用。一方面，粒细胞集落刺激因子在CAG方案中通过预激将处于G0期的白血病细胞动员至细胞周期(S期)，提高化疗的敏感性，加强了阿糖胞苷与阿克拉霉素的抗白血病细胞效应[16]。这一点与化疗后应用粒细胞集落刺激因子以缩短粒细胞缺乏期的治疗目的有所不同。另一方面，新过的研究显示，粒细胞集落刺激因子作为一种粒细胞集落刺激因子，与体外扩增后输注的治疗量的骨髓间充质干细胞协同对骨髓造血重建可能起了一定的作用。到目前为止还没有特异性的标记来鉴定骨髓间充质干细胞，最统一的办法是通过其自我更新、分化等特性来鉴定。然而这些结果只能被分别检出，而一旦分化，骨髓间充质干细胞也就失去了其干细胞特性。尽管间充质干细胞贴壁生长被公认为其特性之一，但不得不承认前B细胞及粒单核细胞前体也具有这种贴壁的特性[17]。而在目前，动物实验与临床研究中骨髓间充质干细胞分离扩增主要还是通过这种贴壁特性来完成的，这个过程产生的是一个包括了CD45-造血细胞及其干细胞在内的不均一的细胞群，也必然包含了能分化为多个细胞系的非成体干细胞[18]。Jiang等[19]报道，从鼠骨髓间充质干细胞分离出来的具有无限增殖特性的多能成体祖细胞注入一个早期的胚泡后，在新生鼠中能被发现多能成体祖细胞分化成多种成体细胞及在造血组织中发现供体来源的CD45+细胞。在体外研究中，Hu等[20]运用粒细胞集落刺激因子与具骨髓间充质干细胞表型的成体干细胞成功重建了超致死剂量射线照射后小鼠的造血功能，提示在粒细胞集落刺激因子的刺激下，骨髓间充质干细胞表型的成体干细胞能分化为造血细胞并有重建造血的功能。目前尚无特异性表面标志来鉴别具有间充质干细胞表型的成体干细胞的有效方法，但其贴壁生长的特性，决定了在目前运用包括梯度离心法体外分离培养骨髓间充质干细胞过程中必然有这类细胞存在的可能。在此例治疗后的造血重建中，目前无法判断是否含有间充质干细胞表型的成体干细胞分化为造血干细胞，但认为粒细胞集落刺激因子的使用与体外扩增的具有贴壁生长特性的间充质干细胞输注产生的协同作用在方案中是治疗成功的关键之一。
由于单独骨髓间充质干细胞输注联合化疗对于白血病支持治疗国内尚属首次报道，适用性与安全性均有待进一步验证与观察。

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