骨髓基质细胞静脉移植对局灶性缺血再灌注损伤脑组织转化生长因子β1的影响★

陈敬1，赵彬2

课题背景：骨髓基质细胞在体内外培养均可分化神经干细胞和成熟的神经细胞，能够透过血脑屏障在脑中成活并迁移，促进脑梗死后神经功能的恢复，重建血管，比神经保护剂具有更长的治疗时间窗。实验立足其抗神经细胞凋亡及机制研究。

应用要点：①实验通过对骨髓基质细胞传代培养，BrdU体外标记，表明静脉注射的骨髓基质细胞能够到达缺血脑组织并存活。②应用TUNEL法检测凋亡细胞在骨髓基质细胞移植前后脑组织中的表达，并证实具有抗凋亡作用。

偏倚或不足：缺乏相应时间点的功能学数据，另外未进行双标免疫组化，后续试验将进一步补充。

1沈阳市第一人民医院神经内科，辽宁省沈阳市 110041；2中国医科大学附属第一医院神经内科，辽宁省沈阳市 110001

陈敬★，女，1971年生，辽宁省沈阳市人，汉族，辽宁中医药大学在读硕士，副主任医师，主要从事脑血管病方面的研究。
jccccj@163.com

摘要
目的: 骨髓基质细胞能透过血脑屏障在脑中存活并迁移至脑梗死区，而在脑梗死区转化生长因子β1的增加将有助于减轻神经元的损害。
目的：观察静脉移植骨髓基质细胞对大鼠脑缺血再灌注损伤神经元转化生长因子β1的影响。
设计、时间及地点：随机对照设计，于2005-09/2006-03在中国医科大学实验动物中心完成。
材料：清洁级成年Wistar大鼠36只，随机分为模型对照组、盐水组、细胞移植组，12只/组。另取2月龄Wistar大鼠2只用于制备骨髓基质细胞。
方法：贴壁法+胰蛋白酶消化分离培养骨髓基质细胞，传至3~5代用于实验，移植前24 h向培养基中加入BrdU进行体外标记。采用改良线栓法建立左侧大脑中动脉梗死大鼠模型，造模后24 h，细胞移植组于尾静脉输入浓度为3×109 L-1骨髓基质细胞悬液1 mL，盐水组尾静脉注射1 mL生理盐水，模型对照组不给予任何处理。
主要观察指标：免疫组化染色检测BrdU阳性细胞及转化生长因子β1的表达，原位TUNEL法检测神经细胞凋亡情况。
结果：造模后3 d，细胞移植组脑梗死灶周围可见大量BrdU阳性细胞，盐水组及模型对照组未见BrdU阳性细胞；细胞移植组转化生长因子β1的表达明显高于盐水组及模型对照组（P < 0.01）；细胞移植组纹状体梗死区神经细胞凋亡数明显低于盐水组及模型对照组（P < 0.01）。
结论：经静脉移植的骨髓基质细胞可选择性进入脑缺血区，增强脑损伤区转化生长因子β1的表达，从而减少神经细胞的凋亡。
关键词：骨髓基质细胞；转化生长因子β1；细胞凋亡；局灶性脑缺血

陈敬，赵彬.骨髓基质细胞静脉移植对局灶性缺血再灌注损伤脑组织转化生长因子β1的影响[J].中国组织工程研究与临床康复，2008，12(16):3011-3014 [www.zglckf.com/zglckf/ejournal/upfiles/08-16/16k-3011(ps).pdf]

中图分类号:R394.2
文献标识码:A
文章编号:1673-8225
(2008)16-03011-04

Effects of intravenous transplantation of marrow stromal cells on transforming growth factor beta 1 in brain tissues of rats with focal cerebral ischemia/reperfusion injury

BACKGROUND:Marrow stromal cells (MSCs) can cross blood-brain barrier, and survive and traverse into cerebral infarction region. The increase of transforming growth factor beta 1 (TGF-B1) in the cerebral infarction region can reduce neuron lesion.
OBJECTIVE: To investigate the effect of intravenous transplantation of MSCs on TGF-B1 expression in neurons from rats with cerebral ischemia/reperfusion.
DESIGN, TIME AND SETTING: A randomized control experiment was performed at the Experimental Animal Center of China Medical University from September 2005 to March 2006.
MATERIALS: Thirty-six clean adult Wistar rats were equally randomized into a model control group, a saline group and a cell transplantation group. An additional two Wistar rats aged two months were used to prepare MSCs.
METHODS: Adhesion + trypsin digestion was used to isolate and culture MSCs. Third to fifth passages of cells were used in the study. MSC was in vitro labeled with bromodeoxyuridine (BrdU) 24 hours before transplantation. Modified suture occlusion was used to establish rat models of left side middle cerebral artery occlusion (MCAO). Twenty-four hours after MCAO, 1 mL of MSCs (3×109 L-1) were injected into the caudal vein in the cell transplantation group; 1 mL saline was injected into the saline group; Rats in the model control group did not receive any treatment.
MAIN OUTCOME MEASURES: The distribution of BrdU-positive cells and the expression of TGF-B1 were determined by immunohistochemistry. Nerve cell apoptosis was detected by TUNEL.
RESULTS: Three days after MCAO, BrdU-positive cells were mainly distributed around the infarction area in the cell transplantation group. There was no BrdU-positive cells in the model control group and saline group. The expression of TGF-B1 was significantly higher in the cell transplantation group than in the model control and saline groups (P < 0.01). The number of nerve cell apoptosis at the striatum in the cell transplantation group was significantly reduced compared to the model control and saline groups (P < 0.01).
CONCLUSION: Intravenous injected MSCs can traverse into the cerebral infarction region, and promote the expression of TGF-β1 and reduce the nerve cell apoptosis.

Chen J, Zhao B.Effects of intravenous transplantation of marrow stromal cells on transforming growth factor beta 1 in brain tissues of rats with focal cerebral ischemia/reperfusion injury.Zhongguo Zuzhi Gongcheng Yanjiu yu Linchuang Kangfu 2008;12(16):3011-3014 [www.zglckf.com/zglckf/ejournal/upfiles/08-16/16k-3011(ps).pdf]

骨髓基质细胞是具有多向分化潜能的非造血干细胞，研究表明骨髓基质细胞在体内外培养均可分化神经干细胞和成熟的神经细胞。国外进行了大量骨髓基质细胞治疗脑梗死的实验研究[1-6]，证明骨髓基质细胞能够通过血脑屏障在脑中成活并迁移，能促进多种神经营养因子的分泌，促进脑梗死后神经功能的恢复，改善局部血液循环，重建血管，比神经保护剂具有更长的治疗时间窗[7]。转化生长因子β1对脑缺血的作用近年颇受关注，已有报道显示大鼠脑缺血补充外源性转化生长因子β1可减少脑缺血后脑梗死体积及神经细胞损害[8]，本实验探讨静脉移植骨髓基质细胞对转化生长因子的影响。

设计：随机对照动物实验。
单位：沈阳市第一人民医院神经内科，中国医科大学附属第一医院神经内科。
材料：实验于2005-09/2006-03在中国医科大学实验动物中心完成。①动物：选取清洁级成年Wistar大鼠36只（由中国医科大学实验动物中心提供，动物质量合格证号：SCXK（辽）2003-0009），体质量250~280 g，雌雄不拘，随机数字表法分为3组：模型对照组、盐水组、细胞移植组，12只/组。另取2月龄Wistar大鼠2只用于制备骨髓基质细胞，实验过程中对动物的处置符合动物伦理学标准。②主要药品与试剂：DMEM(Gibco)；胎牛血清，胰蛋白酶(华美)；羊抗小鼠IgG，羊抗兔IgG，兔抗大鼠转化生长因子β1 BrdU、小鼠抗BrdU、SABC试剂盒，DAB显色剂(博士德)。
设计、实施、评估者：实验设计为第一作者，干预实施与结果评估为全部作者，均经过正规科研培训，使用盲法评估。
方法：
骨髓基质细胞的分离培养：取2月龄Wistar大鼠，以10%水合氯醛过量麻醉致死，浸泡于体积分数为0.75的乙醇中消毒3 min，无菌条件下取股骨和胫骨，暴露骨髓腔，DMEM-LG冲洗骨髓腔，过滤、除渣，4 ℃ 1 000 r/min离心10 min，弃上清，用含有20%胎牛血清DMEM培养液重悬细胞沉淀，吹打成单细胞悬液。镜下计数，细胞按2×105/cm2密度接种于培养瓶中，在37 ℃、体积分数为0.05的CO2孵育箱中培养。接种后24 h首次换液，去除未贴壁细胞。以后每3 d换液1次，相差显微镜下观察细胞生长状况。待原代培养20 d的细胞达80%融合时，以质量浓度为2.5 g/L的胰蛋白酶消化，按1∶2传代，取第3~5代骨髓基质细胞用于实验。
骨髓基质细胞的体外标记：BrdU在细胞有丝分裂S期掺入细胞核中，可用来标记细胞。细胞移植前24 h，在培养基中加入3 mg/L BrdU对骨髓基质细胞进行标记，再用2.5 g/L胰蛋白酶消化，4 ℃ 1 000 r/min离心 5 min，弃上清，用磷酸盐缓冲液清洗1次，再离心，细胞沉淀用磷酸盐缓冲液重悬，红细胞计数板计数，调整骨髓基质细胞悬液浓度为3×109 L-1。
左侧大脑中动脉梗死模型的建立：各组大鼠均造模，以100 g/L水合氯醛按300 mg/kg腹腔注射麻醉，参照改良Zea Longa线栓法[9]于颈总脉分叉处剪约 0.2 mm的“V”形切口，将直径0.26 mm、长约4 cm的尼龙渔线插入左侧颈内动脉，直至左侧大脑中动脉起始端，遇阻力而停，从颈总动脉分叉部始计栓线插入深度为(18.5±0.5) mm，动脉闭塞2 h后撤出渔线至动脉分叉处，实现再灌注。术中室温保持在25 ℃，以大鼠苏醒后出现右侧肢体活动障碍，即右前肢不能伸展，偏向右侧行走，或向右侧转圈成追尾状为模型成功。
骨髓基质细胞移植：造模24 h后，各组大鼠以 100 g/L水合氯醛300 mg/kg腹腔注射麻醉。无菌注射器抽取浓度为3×109 L-1骨髓基质细胞悬液1 mL，于细胞移植组鼠尾静脉输入。盐水组鼠尾静脉注射1 mL生理盐水，模型对照组不给予任何处理。
BrdU阳性细胞及转化生长因子β1表达免疫组化染色检测：造模后3 d，各组大鼠麻醉，多聚甲醛心脏灌流，取脑固定，脑取材范围为前囟前2 mm至前囟后3 mm，常规固定、包埋、连续冠状切片，片厚6 μm，按免疫组化试剂盒说明书染色，苏木精轻度复染，常规脱水、透明、封固。
神经细胞凋亡原位TUNEL法检测：切片制备方法同上，按照原位TUNEL试剂盒说明书操作，常规脱水、透明、封固，在高倍镜(×400)下随机观察纹状体区不重叠的8个视野，检测凋亡细胞数量。
主要观察指标：①BrdU阳性细胞免疫组织化学染色结果。②转化生长因子β1免疫组织化学染色结果。③神经细胞凋亡TUNEL法检测结果。
统计学方法：由第一作者采用SPSS 11.5软件包进行统计处理，数据以_x±s表示，组间比较行t检验分析，P < 0.05为差异有显著性意义，P < 0.01为差异有非常显著性意义。

2.1 实验动物数量分析各组12只大鼠均进入结果分析，中途无脱落。
2.2 BrdU阳性细胞免疫组织化学染色结果造模后3 d，细胞移植组在缺血中心的脑组织石蜡切片中可见细胞核呈棕色的BrdU阳性细胞，主要分布在梗死灶周围（图1）；盐水组及模型对照组均未见BrdU阳性细胞。

2.3 转化生长因子β1免疫组织化学染色结果造模后 3 d，与细胞移植组转化生长因子β1的表达比较，盐水组及模型对照组阳性面积百分率均明显降低[(35.62±5.17)%，(17.32±3.91)%，(19.63±4.67)%，P < 0.01]；后两组间比较差异无显著性意义（P > 0.05）。再灌注后3 d细胞移植组转化生长因子β1的表达见图2。
2.4 神经细胞凋亡TUNEL法检测结果造模后3 d，与细胞移植组纹状体梗死区神经细胞凋亡数比较，盐水组及模型对照组均明显升高[(59.76±6.92)个，(80.24±9.35)个，(83.94±7.91)个，P < 0.01]；后两组间比较差异无显著性意义（P > 0.05）。神经细胞凋亡TUNEL法检测结果见图3。

本实验对移植前的骨髓基质细胞进行了BrdU标记，移植后脑组织切片行免疫组织化学法检测阳性细胞，结果经BrdU标记的骨髓基质细胞主要分布在梗死灶周围区域,表明静脉注射的骨髓基质细胞能够到达缺血脑组织并存活,分析可能原因是由于缺血后血脑屏障被破坏和(或)缺血后的脑组织分泌趋化因子，促使静脉注射的骨髓基质细胞选择性进入缺血脑组织。
骨髓基质细胞是一种来自中胚层的多潜能干细胞，能够自我更新，具有分化成神经元、胶质细胞的潜能，可以参与修复缺损的神经功能。大量研究表明骨髓基质细胞治疗脑缺血的作用机制之一是其促使脑组织各种生长因子的分泌，如脑源性神经营养因子(BDNF)、神经生长因子(NGF)、血管内皮生长因子(VEGF)和肝细胞生长因子(HGF)等[10-17]，而这些神经营养及保护因子促进缺血组织的功能恢复。转化生长因子β1是一种分子量为Mr25 000多功能活性肽，在中枢神经系统由小胶质细胞、星型胶质细胞或神经元产生。转化生长因子β1能延长神经元死亡作用，作用机制促进血管再生，稳定细胞内钙离子浓度，抑制小胶质细胞反应，抗氧化，拮抗兴奋性氨基酸神经毒性[18-20]。本实验结果表明脑梗死大鼠静脉注射骨髓基质细胞后，用免疫组化方法观察到骨髓基质细胞治疗组大鼠脑内转化生长因子β1表达均对照组明显增多。
脑缺血损伤发生后，缺血中央区神经元坏死，而周边区则发生迟发性神经元凋亡。如何能及时挽救缺血周边区即半暗带的细胞，改善局部血供，减少细胞的凋亡是减轻脑缺血损伤的有效方法。本实验观察到将骨髓基质细胞经尾静脉移植给大脑中动脉梗死大鼠，采用TUNEL法检测神经细胞凋亡，与对照组相比可见缺血边缘区凋亡细胞数减少，这与Chen等[1]研究一致。
本实验结果进一步表明，静脉注射骨髓基质细胞至大脑中动脉闭塞再灌注动物模型，骨髓基质细胞可选择性进入脑缺血区，增加转化生长因子β1的表达，减少神经细胞凋亡，可能为其神经保护机制之一。

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