神经干细胞诱导分化为多巴胺能神经元与胚胎中脑多巴胺能神经元移植治疗帕金森病效果比较*☆

柯春龙1，陈白莉2，金华伟1，郭少雷1

应用要点：①实验通过与胚胎中脑多巴胺能神经元组织体内移植疗效的比较，探讨神经干细胞诱导分化的多巴胺能神经元移植治疗帕金森病大鼠的作用，目前国内外相关的研究还很少。②实验结果表明，神经干细胞诱导分化的多巴胺能神经元与胚胎中脑多巴胺能神经元移植治疗帕金森病大鼠具有相同的疗效。③实验为进一步开展神经干细胞诱导分化的多巴胺能神经元移植治疗帕金森病提供了实验基础及理论依据。

同行评价：神经干细胞具有分化为神经元和胶质细胞的潜能，相关的基础研究为临床治疗神经系统疾病带来新希望。文章应用神经干细胞体外诱导分化的多巴胺能神经元移植治疗帕金森病大鼠，立项依据充分，内容新颖，有学术创新和临床应用前景。如能明确移植后胚胎中脑细胞存活率及诱导分化的多巴胺能神经细胞移植存活率则更有说服力。

相关链接：随着神经干细胞技术的飞速发展，来源于胚胎和成体神经干细胞的成功分离、纯化、培养、传代、建立细胞系以及体外定向诱导分化等技术的成熟，中脑神经干细胞在体外特定细胞因子的作用下可定向诱导分化成多巴胺能神经元。应用体外诱导分化的多巴胺能神经元替代胚胎中脑多巴胺能神经元组织移植治疗帕金森病，既解决了胎脑移植数量不足的问题，又避免了伦理学方面的争论，目前已成为帕金森病治疗研究的热点。

中山大学附属第一医院，1神经外科，2消化内科，广东省广州市 510080

柯春龙☆，男， 1971 年生，福建省泉州市人， 2005 年中山大学医学院毕业，博士，主治医师，主要从事干细胞和功能性神经外科疾病立体定向治疗的研究。
Kechunlong05@
163.com

摘要
目的:目前对于体外诱导分化的多巴胺能神经元的生物学功能、体内存活状况，以及与胚胎中脑多巴胺能神经元移植治疗帕金森病大鼠的疗效比较方面尚缺乏深入的研究。观察神经干细胞诱导分化的多巴胺能神经元移植治疗帕金森病大鼠的作用，并与胚胎中脑多巴胺能神经元组织移植治疗帕金森病大鼠的疗效进行比较。
方法：实验于2006-06/2007-09在中山大学附属第一医院完成。①实验材料：健康成年雄性SD大鼠及孕14~15 d的SD大鼠由中山大学动物实验中心提供，实验过程中对动物处置符合动物伦理学标准。②实验方法：在含表皮生长因子及碱性成纤维细胞生长因子的无血清培养液中培养胚胎大鼠中脑神经干细胞。经传代扩增后，在含白细胞介素1a、白细胞介素11、白血病抑制因子、胶质细胞源性神经营养因子的诱导分化液中向多巴胺能神经元分化，并进行免疫细胞化学鉴定和流式细胞仪检测。参考Sauer和Lee等方法制备帕金森病大鼠模型，并将造模成功大鼠随机分组，每组9只：分化细胞组向每一坐标点注入1×1011 L-1神经干细胞诱导分化的多巴胺能神经元；胚胎中脑组注入 1×1011 L -1胚胎中脑多巴胺能神经元；手术对照组注入DMEM/F12细胞培养液。③实验评估：移植术后10、20、40、60 d诱发大鼠不对称旋转行为以观察治疗效果，并对移植区进行酪氨酸羟化酶免疫组织化学检测以了解移植细胞体内存活的情况。
结果：①大鼠神经干细胞球在诱导分化液中呈贴壁生长，球内细胞从球体中央逐渐向四周分化扩展出形态各异的细胞。免疫细胞化学染色显示，分化细胞中含有酪氨酸羟化酶染色阳性细胞。流式细胞仪检测诱导分化6 d的细胞中酪氨酸羟化酶染色阳性细胞的比率为(16.7±2.8)%。②移植后20 d分化细胞组大鼠的不对称旋转行为开始明显下降（P < 0.05）。移植后40 d和60 d，分化细胞组大鼠的旋转圈数与胚胎中脑组比较差异不显著（P > 0.05）。③分化细胞组和胚胎中脑组大鼠纹状体移植区有酪氨酸羟化酶染色阳性细胞，多数细胞位于移植针道边缘。
结论：神经干细胞诱导分化的多巴胺能神经元与胚胎中脑多巴胺能神经元移植治疗帕金森病大鼠具有相同的疗效。
关键词：帕金森病；神经干细胞；多巴胺能神经元；神经移植；细胞移植
柯春龙，陈白莉，金华伟，郭少雷.神经干细胞诱导分化为多巴胺能神经元与胚胎中脑多巴胺能神经元移植治疗帕金森病效果比较[J].中国组织工程研究与临床康复，2008，12(16):3019-3023
[www.zglckf.com/zglckf/ejournal/upfiles/08-16/16k-3019(ps).pdf]

中图分类号: R742.5
文献标识码: A
文章编号: 1673-8225
(2008)16-03019-05

Transplantation of dopaminergic neurons differentiated from neural stem cells versus embryonic mesencephalic dopaminergic neurons for treating Parkinson’s disease

AIM: Biological function and in vivo survival of differentiated dopaminergic neurons (DNs), and comparison to the transplantation of embryonic mesencephalic DNs for treating Parkinson’s disease rats are seldom studied. This study investigated the effect of transplantation of dopaminergic neurons differentiated from neural stem cells (NSCs) into Parkinson’s disease rats, and compared to the transplantation of embryonic mesencephalic DNs.
METHODS: Experiments were performed at the First Affiliated Hospital of Sun Yat-sen University between June 2006 and September 2007. ①Healthy adult male SD rats and pregnant 14-15 day SD rats were provided by Animal Experiment Center of Sun Yat-sen University. Animal intervention met the animal ethical standards.②NSCs derived from embryonic rats were cultivated in serum-free culture solution containing epidermal growth factor and basic fibroblast growth factor. The cells were passaged and differentiated to DNs in differentiate solution containing interleukin (IL) 1a, IL11, leukemia inhibitory factor (LIF) and glial cell line-derived neurotrophic factor (GDNF). The differentiated cells were detected by immunocytochemistry and flow cytometry. Rat models of Parkinson’s disease were established according to the methods of Sauer and Lee et al. Successful models were randomly divided into 3 groups, 9 in each group. Differentiated DNs (1×1011 L-1) were injected into rats of differentiated DNs group. Embryonic mesencephalic DNs (1×1011 L-1) were injected into rats of embryonic mesencephalic DNs group. DMEM/F12 medium was injected into rats of control group. ③The rotational asymmetry of Parkinson’s disease rats was observed 10, 20, 40 and 60 days after the surgery to assess the effect. In transplanted areas, Tyrosine Hydroxylase (TH) was detected with immunocytochemistry to assess the survival of transplanted cells in vivo.
RESULTS: ①In differentiate solution, the rat neural stem cell globes became attaching the dish, cells inside the globes grew out gradually and became irregular in shape. There were some TH positive cells in differentiated cells when detected with immunocytochemistry. The ratio of TH positive cells in cells differentiated for 6 days was (16.7±2.8)% when detected by flow cytometry. ②The rotational asymmetry was decreased obviously 20 days after transplantation of differentiated DNs into Parkinson’s disease rats (P < 0.05). 40 and 60 days after the surgery, the rotational frequencies had no significant difference between differentiated DNs group and embryonic mesencephalic DNs group（P > 0.05）. ③There were TH positive cells in the transplanted areas of Parkinson’s disease rats of differentiated DNs group and embryonic mesencephalic DNs group, most of them located in the margin of transplanted pin hole.
CONCLUSION: When grafted into the striatum of Parkinson’s disease rats, DNs differentiated from NSCs had the same effect as embryonic mesencephalic DNs.

Ke CL, Chen BL, Jin HW, Guo SL.Transplantation of dopaminergic neurons differentiated from neural stem cells versus embryonic mesencephalic dopaminergic neurons for treating Parkinson’s disease.Zhongguo Zuzhi Gongcheng Yanjiu yu Linchuang Kangfu 2008;12(16):3019-3023(China)
[www.zglckf.com/zglckf/ejournal/upfiles/08-16/16k-3019(ps).pdf]

帕金森病作为中老年人常见的神经系统疾患，正随着人口的日益老化而逐年增长。其基本病理改变是黑质的多巴胺能神经元发生退行性病变，使接受黑质多巴胺能神经元投射的纹状体多巴胺含量明显下降或纹状体受体退行性变，导致锥体外系功能失调，从而出现震颤、僵直、运动障碍等临床症状[1]。近年来随着神经干细胞技术的飞速发展，来源于胚胎和成体神经干细胞的成功分离、纯化、培养、传代、建立细胞系以及体外定向诱导分化等技术的成熟[2-4]，为神经细胞移植治疗帕金森病带来了新的希望。本实验应用神经干细胞体外诱导分化的多巴胺能神经元移植治疗帕金森病大鼠，并与胚胎中脑多巴胺能神经元移植治疗帕金森病大鼠进行细胞体内存活及移植疗效的比较研究，为细胞移植治疗帕金森病提供实验基础及理论依据。

设计：随机对照实验。
单位：中山大学附属第一医院神经外科。
材料：实验于2006-06/2007-09在中山大学附属第一医院完成。健康成年雄性SD大鼠及孕14~15 d的SD大鼠由中山大学动物实验中心提供，实验过程中对动物处置符合动物伦理学标准。试剂：DMEM/F12(1∶1) 无血清培养液、B27添加剂、表皮生长因子、碱性成纤维细胞生长因子、10%胎牛血清（Gibco公司）；0.1%多聚赖氨酸、10%小牛血清（Sigma公司）；20%二甲基亚砜（Gibco公司）；白细胞介素1a，白细胞介素11、胶质细胞源性神经营养因子 ( R&D公司)；白血病抑制因子( PEPROTECH公司)；酪氨酸羟化酶抗体(Santa Cruz公司)；巢蛋白抗体、微管相关蛋白2抗体、胶质纤维酸性蛋白抗体（CHEMICON公司）；6-羟基多巴胺、阿朴吗啡（Sigma公司）。
设计、实施、评估者：设计为第一作者，实施为第一、二作者，评估为第三、四作者，均受过专业培训。
方法：
帕金森病大鼠模型的制备：选择健康成年雄性SD大鼠，体质量220~260 g，以10%水合氯醛(3~ 4 mL/kg)腹腔注射麻醉后，固定于脑立体定向仪上，按Sauer[5]和Lee等[6]的方法，确定大鼠右侧中脑被盖腹侧区的注射座标为：前囟后5.0 mm，中线右侧旁开1.6 mm，硬膜下7.5 mm。颅骨钻孔暴露硬脑膜后，经微量注射器向该点注入5 μL（6 g/L）6-羟基多巴胺。术后3周、4周腹腔注射阿朴吗啡（0.5 mg/kg），诱发大鼠向健侧的单向旋转行为，计数30 min，以 2次旋转圈数均 > 7 次/min的大鼠作为成功帕金森病大鼠模型，2次旋转圈数求平均值，作为移植前的旋转圈数。
胚胎中脑多巴胺能神经元组织的分离：孕14 d的大鼠颈椎脱臼处死后，无菌条件下取出胎脑，置于D-Hank’s液中，解剖显微镜下剥离硬脑膜及血管，在中脑和间脑之间横断，以中脑曲为标志，取中脑腹侧脑组织[7]，眼科剪剪成碎块，离心弃上清后，加入 2.5 g/L胰蛋白酶室温消化20 min，离心弃上清后加入DMEM/F12培养液，用火焰刨光的玻璃吸管轻柔吹打分散细胞，100目滤网过滤制成单细胞悬液。椎虫蓝染色活细胞计数, 调整细胞浓度为1×1011 L-1，随即用于移植手术。
神经干细胞的分离、培养、传代及诱导向多巴胺能神经元分化：胚胎中脑神经干细胞的分离、培养、传代、诱导向多巴胺能神经元分化及其免疫细胞化学鉴定和流式细胞仪检测均见参考文后文献[8]。
移植手术：帕金森病大鼠随机分为分化细胞组、胚胎中脑组及手术对照组，每组各9只，以10%水合氯醛腹腔注射麻醉后，固定于脑立体定向仪上，采用两点移植法，定位于大鼠毁损同侧纹状体的座标为：第一点：前囟前1.0 mm，中线右侧旁开2.5 mm，硬膜下5.0 mm；第二点：前囟前0 mm，中线右侧旁开3.0 mm，硬膜下6.0 mm。颅骨钻孔暴露硬脑膜后，经微量注射器向坐标点注入移植物。分化细胞组向每一坐标点注入3 μL（1×1011 L-1）神经干细胞诱导分化的多巴胺能神经元；胚胎中脑组注入3 μL （1×1011 L -1）胚胎中脑多巴胺能神经元；手术对照组注入3 μL DMEM/F12细胞培养液，注射速度为 1 μL/min，留置空针10 min后退出，缝合头部皮肤，常规喂养。术后1周内分化细胞组大鼠死亡2只，胚胎中脑组及手术对照组各死亡1只。移植术后10、20、40、60 d分别给予大鼠腹腔注射阿朴吗啡（0.5 mg/kg），诱发大鼠向健侧的单向旋转行为，计数30 min，以圈数/ min表示。
纹状体移植区酪氨酸羟化酶免疫组织化学检测：移植术后60 d的大鼠灌注固定后取脑，移植部位连续冰冻切片，片厚5 μm，间隔20 μm。冰冻切片吹干后，在30 g/LH2O2中室温浸泡30 min，以灭活内源性过氧化物酶，蒸馏水冲洗3次。0.3% TritonX-100溶液室温孵育20 min，0.1 mmol/L磷酸盐缓冲液冲洗 3次。滴加体积分数为0.05的小牛血清封闭液，室温30 min。滴加一抗（兔抗大鼠TH抗体），4 ℃过夜，0.1 mmol/L磷酸盐缓冲液冲洗3次。滴加生物素化二抗(山羊抗兔免役球蛋白)，37 ℃ 20 min，0.1 mmol/L磷酸盐缓冲液冲洗3次。即用型链霉亲和素-生物素-过氧化氢酶复合物法显色系统显色。高倍显微镜下观察及摄片。
主要观察指标：①神经干细胞诱导分化细胞的形态变化及酪氨酸羟化酶染色阳性细胞的比率。②神经干细胞诱导分化的多巴胺能神经元及胚胎中脑多巴胺能神经元移植帕金森病大鼠后旋转行为的变化。③帕金森病大鼠纹状体移植区酪氨酸羟化酶染色阳性细胞的存活情况。
统计学方法：由第三作者采用SPSS 11.0统计分析软件进行单因素方差分析，数据以_x±s表示，以P < 0.05为差异有显著性意义。

2.1 神经干细胞的培养及诱导分化神经干细胞在无血清培养液中形成大小不等的悬浮神经球，见图1，神经球细胞巢蛋白染色呈强阳性，证实其具有神经干细胞的特异性标志。在诱导分化液中神经干细胞球贴壁生长，球内细胞从球体中央逐渐向四周分化扩展出形态各异的细胞。免疫细胞化学染色显示分化细胞中含有酪氨酸羟化酶染色阳性细胞，见图2，流式细胞仪检测诱导分化6d的细胞中酪氨酸羟化酶染色阳性细胞的比率为(16.7±2.8)%。
2.2 帕金森病大鼠移植后旋转行为的变化见表1。

手术对照组大鼠移植前后旋转行为无明显变化 (P < 0.05)。与手术对照组比较，移植后10 d胚胎中脑组大鼠不对称旋转行为即有显著性改善（P < 0.05）；移植后20 d分化细胞组大鼠不对称旋转行为开始明显下降（P < 0.05）。移植后10 d和20 d，胚胎中脑组大鼠的旋转圈数低于分化细胞组（P < 0.05）。移植后40 d和 60 d，胚胎中脑组大鼠的旋转圈数与分化细胞组比较差异无显著性意义（P > 0.05）。
2.3 移植区酪氨酸羟化酶染色阳性细胞的检测见图3。
分化细胞组和胚胎中脑组大鼠纹状体移植区可以见到酪氨酸羟化酶染色阳性细胞，多数细胞位于移植针道边缘，手术对照组未见酪氨酸羟化酶染色阳性细胞。

帕金森病是中老年人常见的中枢神经系统变性疾病，65岁以上的老人发病率达1%。目前其治疗方法仍以多巴胺替代类药物为主，虽然在多数病例初期试用有效，但并不能减缓黑质区神经元退行性变的进程，随着使用时间的延长，疗效将逐渐下降，且不良反应增强[9-10]。因此人们开始尝试通过神经组织移植替代变性的多巴胺能神经元。
神经干细胞是指具有分化为神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞的能力，能自我更新并提供大量脑组织细胞的细胞群[11]。通过筛选不同细胞因子的诱导分化作用发现，白细胞介素1、白细胞介素11、胶质细胞源性神经营养因子、白血病抑制因子配伍可明显诱导大鼠中脑神经干细胞定向分化成多巴胺能神经元[12-13]，然而目前对于体外诱导分化的多巴胺能神经元的生物学功能、体内存活状况以及与胚胎中脑多巴胺能神经元移植治疗帕金森病大鼠的疗效比较等方面尚缺乏深入的研究。
本实验成功从胚胎大鼠中脑腹侧脑组织中分离、培养神经干细胞及进行传代扩增，并且在体外定向诱导向多巴胺能神经元分化，流式细胞仪检测其诱导分化成多巴胺能神经元的比率达到(16.7±2.8)%，从而为移植治疗帕金森病大鼠提供了充足的细胞来源。在体内移植实验中，神经干细胞诱导分化的多巴胺能神经元移植到帕金森病大鼠纹状体后，大鼠旋转圈数由术前的11.36圈/min下降至术后20 d的8.86圈/min及术后 60 d的6.22圈/min，与手术对照组比较有显著性差异（P < 0.05），证实分化的多巴胺能神经元移植对帕金森病大鼠具有治疗效果。移植后大鼠纹状体内可以见到酪氨酸羟化酶染色阳性细胞，大部分位于移植区周围，较少向脑实质内迁移，其结果进一步从免疫组织化学水平证实神经干细胞诱导分化的多巴胺能神经元在帕金森病大鼠脑内可以存活，但已丧失了神经干细胞所具有的迁移能力。最近的研究还发现[14]，神经干细胞体外诱导分化的多巴胺能神经元移植治疗帕金森病的疗效好于直接应用神经干细胞移植。
在本实验中，胚胎中脑多巴胺能神经元移植帕金森病大鼠10 d后，由阿朴吗啡诱导的不对称旋转圈数开始显著下降，并持续至术后60 d，移植治疗效果良好。胚胎中脑多巴胺能神经元组织移植治疗帕金森病动物模型始于20世纪70年代末，在猴及鼠的动物实验中，移植的神经元能够自然存活，在它们新生出的轴突所抵达的部位合成多巴胺，恢复递质的运输、释放，并能改善症状[15-16]。
20世纪90年代初开始的胎儿中脑组织移植治疗帕金森病也取得了令人鼓舞的进展。然而，这一方法仍有极大的局限性，主要原因是细胞存活率低，移植后90%~95%的神经元死亡，以及受到伦理道德及供体来源的限制[17-18]。在本实验中，神经干细胞诱导分化的多巴胺能神经元移植帕金森病大鼠后，早期旋转行为的改善不如胚胎中脑多巴胺能神经元组织，但移植后40 d和 60 d，其不对称旋转圈数已接近胚胎中脑多巴胺能神经元组织移植组，显示诱导分化的多巴胺能神经元在功能上趋向成熟。应用神经干细胞诱导分化的多巴胺能神经元替代胚胎中脑多巴胺能神经元组织，既解决了胎脑移植数量不足的问题，同时避免了伦理学方面的争论；移植过程中因凋亡所造成的细胞损失还可以通过增加细胞的移植量来弥补[19-20]，因此对治疗帕金森病具有深远的应用前景。进一步的研究需要探索如何提高诱导分化细胞在体内的存活率。已有学者尝试将胶质细胞源性神经营养因子转染神经干细胞再诱导其分化成多巴胺能神经元后进行移植治疗[21]。Akerud等[22]报道将GDNF-c17.2神经干细胞系移植到PD小鼠后发现，胶质细胞源性神经营养因子过表达的神经干细胞可以阻止黑质注射6-OHDA后多巴胺能神经元的变性坏死，并缓解阿朴吗啡和安非他明诱导的旋转行为。

1 Backer JH. The symptom experience of patients with Parkinson's disease. J Neurosci Nurs 2006;38(1):51-57
2 Nagato M, Heike T, Kato T, et al. Prospective characterization of neural stem cells by flow cytometry analysis using a combination of surface markers. J Neurosci Res 2005; 80(4):456-466
3 Zhu J, Wu X, Zhang HL. Adult neural stem cell therapy: expansion in vitro, tracking in vivo and clinical transplantation. Curr Drug Targets 2005; 6(1):97-110
4 Wada T, Haigh JJ, Ema M,et al. Vascular endothelial growth factor directly inhibits primitive neural stem cell survival but promotes definitive neural stem cell survival. J Neurosci 2006;26(25):6803-6812
5 Sauer H, Oertel WH. Progressive degeneration of nigrostriatal dopamine neurons following intrastriatal terminal lesions with 6-hydroxydopamine: a combined retrograde tracing and immunocytochemical study in the rat. Neuroscience 1994;59(2):401-415

6 Lee CS, Sauer H, Bjorklund A. Dopaminergic neuronal degeneration and motor impairments following axon terminal lesion by intrastriatal 6-hydroxydopamine in the rat. Neuroscience 1996;72(3):641-653
7 Carvey PM, Ling ZD, Sortwell CE, et al. A clonal line of mesencephalic progenitor cells converted to dopamine neurons by hematopoietic cytokines: a source of cells for transplantation in Parkinson's disease. Exp Neurol 2001; 171(1):98-108
8 Ke CL,Huang ZS,Jin HW,et al.Zhongguo Zuzhi Gongcheng Yanjiu Yu Linchuang Kangfu 2006;10(29):13-15
柯春龙，黄正松，金华伟，等.冻存时间对复苏后胚胎大鼠神经干细胞体外诱导向多巴胺能神经元分化的影响[J].中国组织工程研究与临床康复，2006，10（29）：13-15
9 Brotchie JM, Lee J, Venderova K. Levodopa-induced dyskinesia in Parkinson's disease. J Neural Transm 2005;112(3):359-391
10 Fahn S, Oakes D, Shoulson I, et al. Levodopa and the progression of Parkinson's disease. N Engl J Med 2004;351(24):2498-2508
11 Mckay R. Stem cells in the central nervous system. Science 1997;276:66-71
12 Ling ZD, Potter ED, Lipton JW, et al. Differentiation of mesencephalic progenitor cells into dopaminergic neurons by cytokines. Exp Neurol 1998;149:411-423
13 Xiao CH, Wang YQ, Liu HM,et al.Intrastriatal glial cell line-derived neurotrophic factors for protecting dopaminergic neurons in the substantia nigra of mice with Parkinson disease. Neural Regen Res 2007，2（4）：207
14 Yu XQ,Yuan HZ,Cai WQ,et al.Disan Junyi Daxue Xuebao 2004;26(9):749-752
余小强，阮怀珍，蔡文琴，等.移植诱导中脑NSCs分化的多巴胺能神经元对PD大鼠治疗作用的实验研究[J].第三军医大学学报，2004，26（9）：749-752
15 Studer L,Tabar V, Mckay RD. Transplantation of expanded mesencephalic precursors leads to recovery in Parkinsonian rats. Nature Neurosci 1998; 1(4):290-295
16 Fei L, Jiang CC, Feng LY, et al. Transplantation of primary cultured embryonic mesencephalic neural precursor cells for treating Parkinsonian rats. Neural Regen Res 2006;1（1）：6
17 Rawal N, Parish C, Castelo-Branco G, et al. Inhibition of JNK increases survival of transplanted dopamine neurons in Parkinsonian rats. Cell Death Differ 2007; 14(2):381-383
18 Piccini P, Pavese N, Hagell P, et al. Factors affecting the clinical outcome after neural transplantation in Parkinson's disease. Brain 2005; 128(pt12):2977-2986
19 Yu Y, Gu S, Huang H, et al. Combination of bFGF, heparin and laminin induce the generation of dopaminergic neurons from rat neural stem cells both in vitro and in vivo. J Neuro Sci 2007; 255(1-2):81-86
20 Wang X, Lu Y, Zhang H, et al. Distinct efficacy of pre-differentiated versus intact fetal mesencephalon-derived human neural progenitor cells in alleviating rat model of Parkinson's disease. Int J Dev Neurosci 2004; 22(4):175-183
21 Roussa E, Krieglstein K. GDNF promotes neuronal differentiation and dopaminergic development of mouse mesencephalic neurospheres. Neurosci lett 2004; 361(1-3):52-55
22 Akerud P, Canals JM, Snyder EY, et al. Neuroprotection through delivery of GDNF by neural stem cells in a mouse model of Parkinson's disease. J Neurosci 2001; 21(20): 8108-8118