相关链接：教育部科学技术研究重点项目（01058）、福建省科技厅重点项目（2002Y014）和福州市科技局项目（2002-14）资助的“骨髓间质干细胞移植治疗脊髓损伤的实验研究”的子课题，前期实验表明骨髓间充质干细胞移植治疗脊髓损伤能明显改善脊髓的神经功能，移植的骨髓间充质干细胞能向损伤部位移行，并能分化为神经样细胞和分泌神经营养物质。

应用要点：已有实验表明，通过一些诱导方式脂肪干细胞完全可以向神经系细胞分化。因此实验选用脂肪干细胞作为移植细胞，制作便于控制温度以及时间的冷冻伤模型，很好的模拟了脑外伤以后的原发和继发性脑损伤。脑损伤后移植脂肪干细胞，结果发现其可以很好的在宿主体内存活、分化并且迁移到达受损病灶部位，并发现血管内皮生长因子、脑源性神经营养因子等基因的表达上调。

同行评价：有研究表明，干细胞具有在体内外诱导分化成神经元样细胞的潜能。干细胞移植修复神经损伤，成为近年来神经科学领域中倍受学者关注的研究热点之一。本文通过制作大鼠脑冷冻伤模型，采用体外培养并传代SD大鼠脂肪干细胞并移植入大鼠脑内，检测BrdU阳性细胞和凋亡细胞及血管内皮生长因子、脑源性神经营养因子表达，选题较新颖，有一定学术创新和临床应用意义。

中南大学湘雅医院， 1神经外科， 2心内科，湖南省长沙市 410008

周向阳☆，男，1978年生，湖南省衡阳市人，汉族，中南大学湘雅医院神经外科在读博士，主要从事干细胞在神经创伤中的应用研究。
hyzxy@sina.com

通讯作者：方加胜，教授，中南大学湘雅医院神经外科，湖南省长沙市 410008

摘要
目的:脂肪干细胞来源于成脂细胞，取材容易，已经成为干细胞研究一个新的方向。观察脂肪干细胞移植脑冻伤大鼠的脑组织局部组织学变化以及神经行为学变化。
方法：实验于2006-01/2007-08在中南大学湘雅医院神经病学实验室完成。①实验材料：SD大鼠，雌雄不限，体质量300 g左右，由中南大学湘雅医学院动物学部提供。实验过程中对动物处置符合动物伦理学标准。②实验方法：体外培养并传代SD大鼠脂肪干细胞,并用BrdU标记。制作大鼠的脑冷冻伤模型，实验组在冷冻伤动物脑内移植脂肪干细胞，对照组在冷冻伤动物脑内移植培养基，假手术组仅行颅骨开窗，每组15只。③实验评估：分别在移植细胞后1，3，5，7，14，30 d对实验动物进行NSS神经行为学评分，并制作脑组织切片，行免疫荧光染色检测BrdU阳性细胞。采用Tunel染色检测凋亡细胞，脑组织RT-PCR检测血管内皮生长因子、脑源性神经营养因子等因子mRNA表达。
结果：①与对照组相比，实验组大鼠在3~14 d NSS神经行为学评分降低（P < 0.05）。②免疫荧光检测显示，Brdu标记的脂肪干细胞在大鼠脑组织内存活并且迁移。③Tunel法检测显示，3 d后实验组凋亡细胞数目明显少于其他组。④RT-PCR检测显示，与其他两组比较，移植脂肪干细胞的大鼠脑组织中血管内皮生长因子、脑源性神经营养因子表达更高。
结论：脂肪干细胞可以在中枢神经系统中存活，并分化为神经元样细胞，它可以引起血管内皮生长因子、脑源性神经营养因子等因子的高表达从而减少细胞凋亡，加速神经功能修复过程并达到保护脑组织的目的。
关键词：脂肪干细胞；脑冷冻伤；凋亡; 移植；神经行为学

周向阳，邓永文，方芳，王飞，陈若琨，宋涛，方加胜.自体脂肪干细胞移植脑冻伤大鼠脑内的作用[J].中国组织工程研究与临床康复，2008，12(16):3024-3028 [www.zglckf.com/zglckf/ejournal/upfiles/08-16/16k-3024(ps).pdf]

中图分类号:R394.2
文献标识码:A
文章编号:1673-8225
(2008)16-03024-05

收稿日期：2008-01-11
修回日期：2008-02-14 (08-50-1-285/GW·Q)

Autologous adipose tissue-derived stem cell transplantation for treatment of rats with brain cold injury

Abstract

AIM:Adipose tissue-derived stem cells (ADSCs) can be easily separated from the fat tissue and now become a new direction of the research on stem cells. This study aimed to investigate the histologic and neurological changes in SD rats with brain cold injury after transplanting the ADSCs into the brain.
METHODS: Experiments were performed at the Neurology Lab of Xiangya Hospital of Central South University from January 2006 to August 2007. ①SD rats of about 300 g of either gender were provided by the Experimental Animal’s Department of Xiangya Medical College of Central South University. The disposal to the animals was accorded with the ethical standards. ②ADSCs from SD rats were cultured and labeled with BrdU in vitro, and then transplanted into the SD rats with brain cold injury were induced previously. Animals were divided into 3 groups, an experimental group (ADSCs was transplanted), a control group (medium was transplanted) and a sham operation group (only craniotomy was executed without transplantation) with 15 rats in each group. ③Neurological Severity Scores (NSS) were evaluated at 1, 3, 5, 7, 14 and 30 days after cell transplantation to the experimental animals. The brain tissues of the animals were sliced after being executed death. Immunofluorescence was used to detect the BrdU positive cells. Frozen brain sections were subjected to Tunel staining to investigate the apoptosis cells. Reverse transcription-polymerase chain reaction (RT-PCR) was used to find the mRNA expression of vascular endothelial growth factor (VEGF) and brain-derived neurotrophic factor (BDNF).
RESULTS: ①The decrease in NSS were found in rats of the experimental group in 3-14 days (P < 0.05). ②BrdU labeled stem cells survived in rat brain tissue and can be transferred detected by immunofluorescence. ③The apoptosis was obviously inhibited in the experimental group through Tunel investigation 3 days later. ④The expressions of VEGF and BDNF were higher in the brain tissue of the experimental group than the control and sham operation groups detected by RT-PCR.
CONCLUSION: ADSCs can survive and differentiate into neuron-like cells in the central nervous system. ADSCs transplantation can reduce apoptosis by evoking the high expression of factors like BDNF and VEGF, through which neural regeneration is accelerated and then brain is protected in injury finally.

Zhou XY, Deng YW, Fang F, Wang F, Chen RK, Song T, Fang JS.Autologous adipose tissue-derived stem cell transplantation for treatment of rats with brain cold injury.Zhongguo Zuzhi Gongcheng Yanjiu yu Linchuang Kangfu 2008;12(16):3024-3028
[www.zglckf.com/zglckf/ejournal/upfiles/08-16/16k-3024(ps).pdf]

0 引言

中枢神经系统损伤后的修复一直是神经科学的一大难题，干细胞的发现和研究给这类疾病带来了曙光。然而干细胞取材困难和伦理问题一直限制着干细胞研究，脂肪干细胞来源于成脂细胞，取材容易，已经成为干细胞研究的一个新的方向，本实验就是移植脂肪干细胞治疗脑冷冻损伤并观察相关指标，为脂肪干细胞在神经系统损伤的治疗方面奠定基础。

1 材料和方法

设计：随机对照观察实验。
单位：中南大学湘雅医院神经外科。
材料：实验于2006-01/2007-08在中南大学湘雅医院神经病学实验室完成。试剂：DMEM/low glucose培养基(GIBCO )，胶原酶II (Sigma)，胎牛血清 (Hyclone)，B-巯基乙醇(BME)（PeproTech EC Ltd），重组人表皮生长因子（EGF）（PeproTech EC Ltd），重组人碱性成纤维生长因子（bFGF）（PeproTech EC Ltd），小鼠抗大鼠NSE (Chemicon)， Brdu(Sigma)，Cy3标记山羊抗小鼠IgG和Fitc标记山羊抗Brdu IgG(博士德)，RT-PCR试剂盒 (TOYOBA)，Tunel 试剂盒 鼎国。动物：SD大鼠，雌雄不限，体质量300 g左右，由中南大学湘雅医学院动物学部提供。实验动物分组: 实验组：冷冻伤动物脑内移植脂肪干细胞; 对照组：冷冻伤动物脑内移植培养基; 假手术组: 仅行颅骨开窗。每组15只。实验过程中对动物处置符合动物伦理学标准。
设计、实施、评估者：实验的设计由第一作者完成、由神经外科干细胞实验组成员共同完成，由方加胜教授完成评估。实验成员在神经病学实验室以及湘雅医院中心实验室接受培训。
方法:
脂肪干细胞的培养和传代：实验大鼠过量麻醉处死，无菌条件下取腹股沟脂肪组织，剪碎脂肪组织， D-hank’s缓冲液反复冲洗，0.1％ 胶原酶37 ℃水浴45 min（间歇振荡），1 000 g离心10 min，弃上清，DMEM-L培养基终止消化，重悬细胞，400目筛网过滤，1 000 g离心5 min，弃上清，用含有10%FBS 的DMEM-L培养基重悬细胞。调整细胞密度，以1×105/ cm2接种于50 mL培养瓶中，置于37 ℃，体积分数为0.05的CO2，饱和湿度的培养箱中，24 h后更换培养液,细胞90%融合后传代培养[1-2]。
脂肪干细胞的诱导分化：分别取制备的细胞爬片用于诱导分化，预诱导培基：bFGF20 μg/L+EGF 20 μg/L + 2 nmol/L BME+无血清DMEM培养基。诱导剂： 10 nmol/L BME +无血清DMEM培养基。诱导分化步骤：预诱导24 h+诱导剂5 h[3-4]。
大鼠冷冻伤模型的制作：实验动物用10%水合氯醛腹腔麻醉，正中切口暴露双侧额骨和顶骨，左侧矢状线旁开5.5 mm,冠状缝后方2.5 mm为冷冻中心，用直径5 mm铜探头（液氮预冷,-196 ℃）行颅骨外冷冻时间约1 min[5-6]。
脂肪干细胞移植：收集传代纯化的脂肪干细胞,移植前24 h加入Brdu(10 μmol/L)孵育，在大鼠脑冻伤后24 h移植。将大鼠固定在立体定位装置上，在以冷冻位置为中心开直径5 mm的骨窗。调整细胞浓度为（2.0× 1011 L-1），用微量加样器在骨窗边缘分3点加入细胞，每点加入2 μL,进针3 mm,留置针10 min[7]。
神经行为学评分：采用NSS神经行为学评分方法[8],在大鼠冷冻伤前，伤后1，3，7，14，30 d分别对大鼠进行评分。最高分18分，最低0分，分值越高表示损伤程度越重。
免疫荧光染色：细胞移植前和移植后各时间点将大鼠用4%多聚甲醛灌注固定，石蜡包埋做脑组织切片 (10 μm)。细胞爬片取出后用PBS漂洗3次，4 %的多聚甲醛固定30 min，0.1％Triton X-100处理20 min；0.6％H2O2甲醇室温孵育15 min以消除内源性过氧化物酶。组织片和细胞片检测方法相似，都以正常山羊血清37 ℃孵育30 min，不洗，倾去山羊血清后分别滴加小鼠抗NSE抗体（1∶40）,小鼠抗Brdu抗体（1∶200），4 ℃过夜或 37 ℃孵育1 h；滴加抗小鼠Cy3（1∶150），以及抗小鼠Fitc 37 ℃孵育30 min；上述步骤后均用0.01 mmol/L PBS缓冲液振洗3次。荧光显微镜下观察。
Tunel凋亡检测：按照Tunel试剂盒方法检测细胞凋亡。切片脱蜡后用20 mg/L蛋白酶K37 ℃ 消化20 min。PBS洗后加入0.3%H2O2(甲醇溶解)之后，0.1% Triton X-100处理,PBS洗2次，每次2 min。凉干滴加10 μL反应液 (1 μL酶和9 μL反应缓冲液混匀)置于湿盒37 ℃ 60 min。依次加入凋亡试剂盒的Buffer A,显色剂，buffer B，显色剂。之后，核固红复染20 s，水洗,梯度已醇脱水，透明，封固。显微镜下观察有蓝紫色颗粒者为阳性。
RT-PCR：TRIZOL提取病灶区域脑组织细胞的总RNA，primer 5 设置引物β-actin:sense5’ CTG TCC CTG TAT GCC TCT G 3’，anti sense 5’ATG TCA CGC ACG ATT TCC 3’，product length: 218 bp。BDNF:sense 5’TCC CAC AGC TTG TAT CCG 3’，anti sense 5’ CCG AAC CTT CTG GTC CTC 3’，product length: 425 bp。VEGF:sense5’GGC TTT ACT GCT GTA CCT CC 3’，anti sense 5’CAA ATG CTT TCT CCG CTC T 3’，product length: 435 bp。反转录过程采用20 μL体系，含总RNA 2 μL、5×RT buffer 4 μL、dNTPmix 2.0 μL、随机引物1 μL、RNA inhibitor 0.5 μL、Revertra Ace 1.0 μL以及其余量用DEPC水补足RT产物放-20 ℃保存或者直接进行PCR。PCR体系为50 μL，5 μL模板、DEPC水 32 μL、Buffer 5 μL、上下游引物各1 μL、Taq酶 1 μL、MgCl2 3 μL、dNTP 2 μL。PCR产物跑琼脂糖电泳照相，并进行灰度分析。
主要观察指标：①动物神经行为学评分情况。② Tunel法凋亡检测及RT-PCR基因检测。
统计学方法：统计学处理由第一作者完成，结果采用_x±s表示,应用SPSS 11.0统计学软件进行对实验结果进行组间方差分析，P < 0.05为差异有显著性意义。

2 结果

2.1 体外分化细胞的鉴定 脂肪干细胞在体外可以分化为神经元样细胞，并发出神经突起，见图1，经碱性成纤维细胞生长因子和表皮生长因子等因子诱导后可以检测到NSE阳性细胞，提示脂肪干细胞在体外可以向神经元样细胞转化，见图2。
2.2 Brdu标记细胞移植入宿主体内 移植脂肪干细胞后不同时间点处死大鼠，做成脑组织石蜡切片，行Brdu和NSE等标记物检测发现24 h内Brdu阳性细胞多集中在针道附近，之后逐渐向病灶中心部分转移，分别见图3，4。表明脂肪干细胞在移植入宿主体内后可以在宿主体内存活并且具有向目标位置迁移的能力。

2.3 动物行为学评分情况 采用NSS神经行为学评分法则，发现伤后1d实验组和对照组动物评分没有显著差异，而与假手术组相比有显著差异，表明冷冻伤后动物存在神经功能的缺失。3 d和7 d大鼠实验组与对照组评分差异有显著性意义 (P < 0.01)，实验组动物评分低于对照组。14 d后开始实验组与对照组相比评分差异无显著性意义(P > 0.05)。见表1。

2.4 Tunel法凋亡检测结果 每组随机选取5张玻片，每张玻片随机选取5个高倍视野计算凋亡细胞个数。发现 3 d以后时间点脂肪干细胞干预组凋亡细胞数目明显少于其他组。见图5，6。

2.5 RT-PCR基因检测 在移植3d后用RT-PCR的方法对大鼠脑组织的血管内皮生长因子、脑源性神经营养因子的mRNA表达进行了分析。分析结果表明实验组的血管内皮生长因子、脑源性神经营养因子的表达明显上调和对照组有显著差异，而对照组和假手术组的表达相比较也明显上调。分别见图7，8。

3 讨论

神经系统损伤引起的神经功能障碍可以由原发性损伤和继发性损伤引起。原发性损伤是损伤造成的急性神经细胞死亡，这种死亡是不可逆的。继发性损伤通常由神经细胞的凋亡引起，因此采取有效措施避免或者减少继发性凋亡而达到神经系统保护作用显得尤为关键。
本次实验旨在制作大鼠的脑冷冻伤模型，并对脑内移植脂肪干细胞后对冷冻引起的脑损伤的干预作用进行观察。脑冷冻伤后有类似脑外伤的原发性细胞死亡和程序性细胞凋亡的过程。本实验发现体外培养的大鼠脂肪干细胞可以很好的在宿主体内存活、分化并且迁移到达受损病灶部位。与对照组相比，移植脂肪干细胞后的冷冻伤大鼠显示更好的早期神经功能恢复能力。组织学和RT-PCR等方法观察发现，移植脂肪干细胞后冷冻伤大鼠脑组织凋亡细胞数目明显减少，并且早期血管内皮生长因子、脑源性神经营养因子等基因的表达上调。
大鼠脑组织在冻伤后会发生急性的细胞死亡以及由血管源性脑水肿而导致的迟发性细胞凋亡[9]。凋亡是中枢神经系统疾病的进展过程一个重要的环节。细胞凋亡会在损伤后0.5 h开始出现并于72 h达到高峰，凋亡带也从病灶的中心向周围发展并且可以波及相邻的正常脑组织[10]。因此凋亡相对于损伤直接引起的细胞死亡所带来的神经系统损伤常常是迟发的并且持久的，因此如果能有效的抑制脑损伤后细胞的凋亡就可以明显缓解神经系统损伤所引起的症状[11]。
脂肪干细胞促使神经功能改善的具体机制目前仍然不十分明确，考虑有以下3种可能：一是移植的细胞可以迁移至损伤区域并替代受损的脑组织；二是移植的细胞能够分泌具有神经营养作用的蛋白分子提供神经保护作用；三是形成新的血管改善局部缺血所造成的继发性损伤[12]。
在原位移植脂肪干细胞后，脑冷冻伤大鼠病变区域细胞凋亡在72 h明显减少，因此带来相应时间段大鼠神经功能评分的改善。为探求脂肪干细胞引起这些改变的原因，作者设计实验进行了血管内皮生长因子、脑源性神经营养因子等基因的检测。实验发现血管内皮生长因子、脑源性神经营养因子等基因的表达上调。
脑源性神经营养因子是神经修复过程中起重要作用的神经细胞因子，BDNF可以从多方面对神经元起保护作用,Kishino等[13]发现脑源性神经营养因子具有对抑制受损神经元的胞体萎缩,阻止神经递质相关酶类的减少,促进轴突生长的作用。Novikova等[14]发现脑源性神经营养因子可以阻止一氧化氮合成,阻断NMDA依赖的神经退变途径,减少运动神经元的凋亡。
移植脂肪干细胞后实验组脑源性神经营养因子的表达较对照组显著上调，可以相信脂肪干细胞的介入引起的脑源性神经营养因子表达上调在减少程序性细胞死亡过程中发挥了重要作用。
脂肪干细胞移植激活的神经系统修复是一个及其复杂的过程，它不单单是一个脑源性神经营养因子的激活过程。Jin等[15]认为,VEGF有神经营养作用,它在新血形成之前,对神经组织有直接保护作用,这有助延长细胞学的存活时间,直到新血管形成。Harrigan等[16]认为血管内皮生长因子可以减轻脑水肿以及抑制凋亡。血管内皮生长因子移植凋亡的机制可能是血管内皮生长因子使血管内皮细胞再生增多、增快,新生毛细血管形成,改善局部缺血缺氧状态,促进了物质交换,恢复了正常的血脑屏障。本实验中检测到血管内皮生长因子的上调意味着脂肪干细胞还激活了血管的再生，血管再生在晚期的神经系统修复过程中起关键作用[17]。
实验组动物在3 d和7 d的时候显示了较对照组更好的恢复情况，表明移植脂肪干细胞在主要这一段时间发生作用，包括移植细胞凋亡的而实现神经修复的作用。实验发现一个月后冻伤大鼠的神经功能都能基本恢复，并且实验组对照组没有显著差异，这是由于大鼠的神经自我修复功能比人类要强大的多，大鼠脑皮质的局限性损伤通常都能够自我修复[18]。
脂肪干细胞取材方便，增殖分化能力强，易于体外培养，可以跨系分化。在脑损伤等疾病中的应用前景广阔。但是目前尚未找到特异表面标志物[19]，对脂肪干细胞的鉴定还有一定困难，除了要进一步开展这方面研究，下一步还将对脂肪干细胞的安全性、伦理学问题以及深一步的作用机制进行研究。

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