课题背景：教育部科学技术研究重点项目（01058）、福建省科技厅重点项目（2002Y014）和福州市科技局项目（2002-14）资助的“骨髓间质干细胞移植治疗脊髓损伤的实验研究”的子课题，前期实验表明骨髓间充质干细胞移植治疗脊髓损伤能明显改善脊髓的神经功能，移植的骨髓间充质干细胞能向损伤部位移行，并能分化为神经样细胞和分泌神经营养物质。

同行评价：目前骨髓间充质干细胞的基因转染技术问题还面临着一定的难关。病毒介导的基因转染技术转染率高，但具有潜在的生物风险和免疫原性；非病毒式，包括显微注射法、颗粒轰击法、电穿孔法、裸露DNA直接注射法、脂质体包埋放等载体虽然相对安全，但转染率低，已转入细胞内的DNA易被细胞内的DNA酶融解，导致目的基因不能在细胞内稳定存在和表达，又限制了非病毒介导法的应用。

应用要点：实验采用梭华-Sofast转染骨髓间充质干细胞。实验结果表明：①Sofast介导绿色荧光蛋白转染骨髓间充质干细胞的转染率较Jet PEI、Superfect 和Lipofectamine 2000等转染试剂的转染率高。②Sofast介导绿色荧光蛋白转染骨髓间充质干细胞后，骨髓间充质干细胞的存活分数较Jet PEI、Superfect 和Lipofectamine 2000等转染试剂的存活分数高。

1福建卫生职业技术学院解剖学教研室，福建省福州市 350101；2福建医科大学人体解剖与组织胚胎学系，福建省福州市 350004

吴碧莲，女，1970年生，福建省福安市人，汉族，1991年福建医科大学毕业，讲师，主要从事干细胞的基础研究。
Lian319@163.com

教育部科学技术研究重点项目（01058）*

摘要
目的:梭华-Sofast是新一代阳离子聚合物转染试剂，具有高效率转染所必备特征，如浓缩DNA，将DNA运送到细胞内，并使其在细胞核内释放等，且细胞毒性很低，很稳定，不被血清清除等特点。观察梭华-Sofast介导绿色荧光蛋白转染骨髓间充质干细胞的转染效果及细胞毒性。
方法：实验于2006-03-01/12-31在福建医科大学神经生物学研究中心完成。①实验材料：实验动物选用清洁级健康雄性SD大鼠10只，二三月龄，体质量150~250 g,由福建医科大学实验动物中心提供。实验过程中对动物处置符合动物伦理学标准。②实验方法：SD大鼠10只，用密度梯度离心及贴壁法相结合的方法分离纯化大鼠骨髓间充质干细胞，分别以Sofast、阳离子聚合物Jet PEI、Superfect和阳离子脂质体Lipofectamine 2000为转染试剂，转染绿色荧光蛋白入骨髓间充质干细胞，倒置荧光显微镜下检测转染细胞的绿色荧光蛋白基因表达，并通过MTT法检测转染细胞毒性。
结果：梭华-Sofast、阳离子聚合物Jet PEI、Superfect和阳离子脂质体Lipofectamine 2000介导的绿色荧光蛋白能有效转染入骨髓间充质干细胞，转染效率分别为（85.62±8.76 ）%、（73.34±7.32）%、（75.61±7.79）%和（76.62±8.21）%，梭 华-Sofast转染率最高（P < 0.05）；转染细胞的存活分数分别为(92.18±9.27)%、(86.98±8.54)%,(87.84±8.59)%和(87.17±8.61)%,梭华-Sofast细胞毒性最低（P < 0.05）。
结论：梭华-Sofast介导绿色荧光蛋白转染骨髓间充质干细胞具有高转染效率和低细胞毒性的优点。
关键词：Sofast;绿色荧光蛋白；骨髓间充质干细胞；转染

吴碧莲，陈少强，贾小力.梭华-Sofast介导绿色荧光蛋白转染骨髓间充质干细胞的转染效果[J].中国组织工程研究与临床康复，2008，12(16):3029-3032 [www.zglckf.com/zglckf/ejournal/upfiles/08-16/16k-3029(ps).pdf]

中图分类号: R394.2
文献标识码: A
文章编号: 1673-8225
(2008)16-03029-04

收稿日期: 2007-10-25
修回日期：2007-12-05
(07-50-10-5828/GW·Q)

Transfection efficiency of Sofast by transfecting green fluorescent protein into bone marrow mesenchymal stem cells

Abstract

AIM:Sofast is a new kind of cationic polymer transfection reagent, characterized by high transfection efficency, such as condensing DNA. DNA is transported into cells, and releases in cellular nucleus, with low cytotoxicity, stability, cannot be cleaned with serum. This article investigates the transfection efficiency and cytotoxicity of green fluorescent protein (GFP) transfected bone marrow mesenchymal stem cells (BMSCs) by Sofast.
METHODS: Experiments were performed at the Research Center of Neurobiology of Fujian Medical University from March to December 2006. ①Ten clean healthy male SD rats aged two or three months (150-250 g) were provided by Experimental Animal Center of Fujian Medical University. Animal intervention met the Animal Ethical Standards. ②BMSCs obtained from SD rats were isolated and purified in vitro by Percoll density gradient centrifugation combined with adherent method. GFP was transfected into MSCs by Sofast, cationic polymer Jet PEI and Superfect and cationic liposome Lipofectamine 2000. Expression of GFP was examined by inverted fluorescence microscope and the cytotoxicity of the trasfected cells was determined with MTT assay.
RESULTS: The transfection efficiency of Sofast, cationic polymer Jet PEI, Superfect and cationic liposome Lipofectamine 2000 was about (85.62±8.76)%，(73.34±7.32)%，(75.61±7.79)% and (76.62±8.21)%，and the transfection efficiency of Sofast was the highest (P < 0.05); the exist score of the trasfected cells was about (92.18±9.27)%，（86.98±8.54）%,（87.84±8.59）% and （87.17±8.61）%, and the cytotoxicity of Sofast was the lowest （P < 0.05）.
CONCLUSION: Sofast is a high efficiency but low cell toxicity transfection by transfecting GFP into BMSCs.

Wu BL, Chen SQ, Jia XL.Transfection efficiency of Sofast by transfecting green fluorescent protein into bone marrow mesenchymal stem cells.Zhongguo Zuzhi Gongcheng Yanjiu yu Linchuang Kangfu 2008;12(16):3029-3032(China)
[www.zglckf.com/zglckf/ejournal/upfiles/08-16/16k-3029(ps).pdf]

0 引言

绿色荧光蛋白转染标记骨髓间充质干细胞(marrow mesenchymal stem cells,MSCs)是用于定位和示踪体内移植的MSCs的常用方法之一，目前常用的基因转染方法主要包括病毒载体法和脂质体介导法。病毒载体法的转染效率最高，但病毒的安全性问题阻碍了它的推广应 用[1]，而且病毒载体制备方法复杂，价格昂贵也严重限制了其在基因转染中的应用[2]。脂质体是近年来基因转染的主要转染试剂，然而阳离子脂质体在体内使用时，能在肺组织内累积，诱发强烈的抗炎反应[3]，这将导致剧烈的毒性反应[4-5]。梭华-Sofast（以下简称Sofast）是新一代阳离子聚合物转染试剂，具有高效率转染所必备特征，如浓缩DNA，将DNA运送到细胞内，并使其在细胞核内释放等，且细胞毒性很低，很稳定，不被血清清除等特点。为了研究Sofast的转染效果，本实验拟以阳离子聚合物Jet PEI、Superfect和阳离子脂质体Lipofectamine 2000为对照，转染绿色荧光蛋白入MSCs，通过荧光显微镜观察报告基因的表达，评价Sofast的转染效果，通过MTT法检测细胞的存活分数，评价Sofast的细胞毒性。

1 材料和方法

设计：随机对照实验。
单位：福建卫生职业技术学院解剖学教研室。
材料：实验于2006-03-01/12-31在福建医科大学神经生物学研究中心完成。
实验动物：实验动物选用清洁级健康雄性SD大鼠10只，出生2.0~3.0个月，体质量150~250 g,由福建医科大学实验动物中心提供，实验过程中对动物处置符合动物伦理学标准。大鼠饲养条件为室温18~23 ℃，饲喂标准大鼠饲料。主要试剂：αMEM培养基、胎牛血清FBS(美国HyClone公司)；胰蛋白酶（Trypsin1:250,Amersco）；PBS、Ficoll-Paque分离液（美国Pharmacia公司）；转染试剂Lipofectamine 2000（美国Invitrogen公司），Jet PEI(美国Qbiogene公司)，Superfect（美国Qiagen公司）， Sofast （厦门太阳马生物工程有限公司）；MTT（美国Amersco公司）；质粒pEGFPN1和感受态细胞DHα5由福建医科大学杨菊华博士提供。主要仪器：显微镜(OLYMPUS SMZ）、倒置相差荧光显微镜（OLYMPUS IX70）、电冰箱（SIEMENS）、AIR TECH无菌操作台（苏净集团安泰公司）、低速自动平衡离心机（LDZ5-2、北京）、Thermo Forma CO2孵育箱（3111、USA）。
设计、实施、评估者：设计为第一作者，实验实施和评估为全部作者。评估者均受过专业知识培训。
方法：
细胞培养与传代：大鼠氯胺酮（60 mg/kg）腹腔注射麻醉，浓碘伏消毒。取双侧四肢骨，剪除干骺端，暴露骨髓腔，用10 mL培养液（含1万单位肝素）冲洗骨髓腔。将所获骨髓缓慢加入已含Ficoll-Paque分离液(密度：1.077 g/mL) 3 mL的试管内梯度离心（2 000 r/min， 30 min），吸取富含粒细胞中间界面层， PBS洗涤3次，制成单细胞悬液接种。培养条件为37 ℃、饱和湿度、体积分数为0.05 CO2，培养液为α-MEM（含有10﹪FBS，100 U/mL青霉素，100 g/L链霉素）。每三四天更换1次培养液，去除未贴壁细胞，至细胞融合时胰酶消化收集细胞并传代。
质粒提取：质粒pEGFPN1转化感受态细胞DHα5， 37 ℃ 200 r/min摇菌过夜，质粒微量抽提试剂盒提取质粒，紫外分光光度计测定纯度及浓度后，-20 ℃保存备用。
细胞转染：将第3代MSCs细胞种植于24孔细胞培养板中，每孔种植2.0×105个细胞，细胞培养液总体积 500 mL。将细胞放置在37 ℃，体积分数为0.05的CO2孵育16~24 h，细胞密度约40%~50%。随机分为Sofast组、Lipofectamine 2000组、Jet PEI组和Superfect组，分别以Sofast、Lipofectamine 2000、Jet PEI和Superfect为转染试剂，将pEGFPN1转染入MSCs。将0.6 mg质粒DNA(pEGFPN1质粒)和转染试剂分别稀释于30 mL αMEM中，然后将30 mL转染试剂稀释液滴加到30 mL质粒DNA的稀释液中，边加边用旋涡振荡器振荡，室温温育15 min。转染试剂用量参照厂家说明书。将转染试剂/DNA 混合物（60 mL）加入细胞培养液中，轻轻摇匀，置于37 ℃，5体积分数为0.05的CO2孵育48 h，基因表达分析。
转染后48 h，用倒置荧光显微镜观察绿色荧光蛋白表达并计算转染效率：将转染的细胞调整细胞密度（100~200）×105之间，胰酶消化，血球计数板普通显微镜下计细胞数A,换荧光下相同视野计荧光细胞数a,计算转染效率（转染效率=a/A×100%）
转染后24 h将各孔细胞胰酶消化后分别吸出，按每孔种植2.0×105个细胞种植于96孔细胞培养板中，至48 h每孔细胞中加入5 g/L MTT，37 ℃，体积分数为0.05的CO2孵育培养3~4 h。小心弃去所有液体，晾干，加入DMSO，溶破细胞，用酶联仪测定A550。以未转染细胞为对照孔，计算基因转染后细胞存活的分数（细胞存活的分数=转染细胞A/对照细胞A×100%）[6]。
主要观察指标：①Sofast介导绿色荧光蛋白转染MSCs的转染率，评价Sofast的转染效果。②MTT法检测细胞的存活分数，评价Sofast的细胞毒性。
统计学方法：实验数据用_x±s表示，由第一作者作者采用SPSS 11.0软件进行统计分析，采用单因素方差ANOVA进行组间比较，P < 0.05表示差异有显著性意义。

2 结果

2.1 MSCs的体外培养 培养的骨髓间充质干细胞，24 h后逐渐出现贴壁细胞，其他血细胞通过换液逐渐除去，此时贴壁细胞共同特点是呈巨单核细胞，细胞形态不一，可有梭形、多角形或星芒状突起，为单个或多个细胞的克隆，细胞增殖迅速，12~14 d，细胞90%以上融合，融合细胞都呈梭形，原代可获得(1~2)×106 大鼠MSCs。传代的细胞于24 h内完全贴壁，形态多呈梭形，10~12 d融合，见图1。
2.2 各组基因转染效率及细胞存活分数 绿色荧光蛋白基因表达的产物能激射峰值508 nm的绿色荧光，可于荧光显微镜下直接观察，见图2，3。绿色荧光蛋白基因表达阳性细胞越多，表明转染率越高。各组绿色荧光蛋白转染MSCs的转染率见表1。结果表明，Sofast的转染率最高，阳性细胞为（85.62±8.76）%。Jet PEI，Superfect和Lipofectamine 2000的转染效率分别为（73.34±7.32）%、(75.61±7.79)%和（76.62±8.21）%，比Sofast低。各组MSCs的存活分数见表1，研究表明， Jet PEI，Superfect 和Lipofectamine 2000 细胞存活率分别为(86.98±8.54)% ，(87.84±8.59)%和（87.17±8.61）%, 细胞毒性很低，而Sofast的存活率为（92.18±9.27）%，毒性最低。

3 讨论

绿色荧光蛋白是从发光水母分离出来的荧光蛋白，在蓝光或近紫外光照射下，不加任何反应底物就能发射荧光。由于绿色荧光蛋白基因作为报告基因转染活细胞具有观察简单、方便、直观、荧光强度强、持续时间长，并能对活细胞进行观察等优点，近年来在生命科学领域得到广泛应用[7]。MSCs具有来源广泛、取材容易、在体外长期培养过程中始终保持其多向分化潜能、体内移植反应弱、克服了有关伦理学及免疫排斥问题等优点[8-9]，是组织工程和细胞移植治疗的最佳种子细胞,同时也是基因治疗较为理想的靶细胞[10-19]。绿色荧光蛋白转染标记MSCs是用于定位和示踪体内移植的MSCs的常用方法，在MSCs移植研究中具有重要作用。目前常用的基因转染方法主要包括病毒载体法和脂质体介导法。病毒载体法的转染效率最高，但逆病毒潜在的致癌性和腺病毒体内应用易引起免疫反应的安全性问题阻碍了它的推广应用[1]，而且病毒载体制备方法复杂，价格昂贵也严重限制了其在基因转染中的应用[2]。脂质体介导法在体外基因转染中有很高的效率，且操作简便，是近年来基因转染的主要转染试剂。然而，阳离子脂质体在体内使用时，它能迅速被血清清除，并在肺组织内累积，诱发强烈的抗炎反应[3]，这将导致剧烈的毒性反应[4-5]。
Sofast是一种新型的阳离子聚合物，它能够浓缩DNA，促进细胞吞噬聚合物/DNA复合体。由于阳离子聚合物能在细胞内涵体中形成吸收质子的“海绵”，从而使之蹦解，而使DNA 免受内涵体酶解，并使其在细胞核内释放，从而提高基因表达水平[20]。本实验结果表明，Sofast介导绿色荧光蛋白转染MSCs的转染率为(85.62±8.76)%，较Jet PEI，Superfect 和Lipofectamine 2000等转染试剂的转染率高，说明Sofast介导绿色荧光蛋白转染MSCs具有很好的转染效果。
细胞毒性是基因转染过程中一个非常重要的参考指标，转染效率高但细胞毒性大的转染试剂，对基因转染的研究毫无意义。本实验结果表明，Sofast介导绿色荧光蛋白转染MSCs后，MSCs的存活分数为（92.18±9.27）%，较Jet PEI，Superfect 和Lipofectamine 2000等转染试剂的存活分数高，说明Sofast介导绿色荧光蛋白转染MSCs的细胞毒性很低。
综上所述，Sofast介导绿色荧光蛋白转染MSCs具有高转染效率和低细胞毒性的优点。本实验结果为应用Sofast介导绿色荧光蛋白转染MSCs提供了理论依据。

4 参考文献

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