嗅鞘细胞移植术后脊髓损伤患者功能的评价★

刘超，郑遵成，高瑞，张林，张坤，张磊，魏树刚，张立清，匡乃峰，宋延军

课题背景：课题是第一作者在新疆医科大学攻读博士后项目的一部分，获新疆维吾尔自治区高校科研计划重点项目基金资助，编号XJEDU2006I33，主要研究内容是比较嗅黏膜嗅鞘细胞移植和嗅黏膜移植对大鼠脊髓损伤修复的影响。

应用要点：①采用改良Nash差速贴壁法成功获得移植所需的嗅鞘细胞，方法简单经济，为课题下一步实验奠定基础。②实验所用细胞取自嗅黏膜，不需开颅取嗅鞘，使人的自体嗅黏膜嗅鞘细胞移植修复脊髓损伤更好的应用于临床。

术语解析：差速贴壁法是利用成纤维细胞、星形胶质细胞和成鞘细胞的贴壁时间不同而将它们分离，成纤维细胞的贴壁能力强，在细胞接种1 h之内就可直接贴壁在未被包被的光滑玻璃平面上，星形胶质细胞一般在接种的24 h左右贴壁，而嗅鞘细胞则需要96~120 h内贴壁，采用此法嗅鞘细胞的分离率可达93%。

刘超★，男，1974 年生，山东省枣庄市人，汉族， 2005年山东大学医学院毕业，硕士，主治医师，主要从事脊髓脊柱损伤修复研究。
Liuchao1826@
tom.com

摘要
目的:目前国际上应用最广泛的神经功能评估标准是2000年美国脊髓损伤学会制定的ASIA标准。通过实践作者发现ASIA标准主要偏重于神经学检查的评估，对于植物神经功能如大小便功能、出汗及皮肤营养等功能性的情况不能很好的评估。作者也曾经制定了ASIA标准的功能观察补充表，虽然此表能够较好的反映出脊髓损伤患者嗅鞘细胞移植术后植物神经功能的变化，但是必须要和ASIA标准同时使用，互为补充，使用较为繁琐。观察北京西山脊髓功能量表的使用效果。
方法：选择2007-07/11来源于全国各地的陈旧性脊髓损伤患者21例，男17例，女4例，年龄8~54岁，损伤时间0.5~18年。受伤原因：创伤性脊髓损伤17例，手术创伤1例，生物源性损伤即脊髓炎3例。损伤节段：颈段8例，胸腰段13例。脊髓损伤程度：14例为完全性脊髓损伤，7例为不完全性脊髓损伤。13例曾行脊髓减压手术治疗。21例均接受过不同种类的神经营养因子等治疗。患者自愿接受细胞移植治疗并签自愿接受协议书。4~6个月中期引产胚胎由家属自愿捐献，并经过医院伦理委员会批准。取胚胎嗅球，经细胞分离、培养、纯化7~14 d，最后消化成单细胞混悬液，然后在手术显微镜下移植到患者损伤脊髓区域的上下方。术后1~2个月，采用北京西山医院脊髓损伤功能量表进行术前和术后评定对比，该量表共9大项16小项，采用4分制，正常3分，最差为0分，总分0~48分，0~16分为重度残障，17~32分为中度残障，33~47分为轻度残障，48分正常，能全面地体现患者的功能变化，不仅包括运动感觉的变化，还包括了膀胱、直肠、肌张力、皮肤营养状况、泌汗、性功能、疼痛、生存和生活质量的评价。
结果：21例患者均进入结果分析。嗅鞘细胞移植术后1~2个月，21例患者的脊髓功能评分都有明显提高（术前：21.33±10.29，术后：25.19±11.16，P < 0.01）
结论：西山医院脊髓功能量表能较全面的反映出术后脊髓患者功能的变化，使用较简便。
关键词：脊髓损伤；嗅鞘细胞；细胞移植；功能评价

刘超，郑遵成，高瑞，张林，张坤，张磊，魏树刚，张立清，匡乃峰，宋延军.嗅鞘细胞移植术后脊髓损伤患者功能的评价[J].中国组织工程研究与临床康复，2008，12(16):3037-3040
[www.zglckf.com/zglckf/ejournal/upfiles/08-16/16k-3037(ps).pdf]

中图分类号: R394.2
文献标识码: A
文章编号: 1673-8225
(2008)16-03037-04

Neurofunctional evaluation in spinal cord injury patients after olfactory ensheathing cell transplantation

AIM:Now the American Spinal Injury Association (ASIA) scoring standard formulated in 2000 is generally utilized internationally. But according to the practice, author find that ASIA standard is major for the evaluation of neurological examination, but is not enough for the evaluation of autonomic nerve function, such as urination and defecation function, sweating and skin. Author had formulated the additional function observation scale for ASIA. Although this additional scale can reflect the changes of the autonomic nerve function after the transplantation of olfactory ensheathing cells, the additional scale must be used with ASIA at the same time, so it is very complex. We observe the effects of the spinal cord injury functional rating scale of Xishan Hospital.
METHODS: Totally 21 patients with old spinal cord injury were selected from July to November 2007, who came from all over the country, including 17 males and 4 females, aged 8-54 years. The disease course was 0.5-18 years. Causes of injury included traumatic cord injury in 17 cases, iatrogenic cord injury in 1 case and myelitis in 3 cases. The injury sites were cervical segment (n=8), thoracic segment and lumbar segment (n=13). There were 14 cases of complete spinal cord injury and 7 cases of incomplete spinal cord injury. There were 13 cases who had been received the decompression procedure. Twenty-one patients had received the treatment of various neurotrophic factors. All the patients were voluntary to receive transplantation of the olfactory ensheathing cells and signed the informed consent. Olfactory bulb of aborted fetus (4-6 months induction of labour in second trimester, family member was voluntary to donate, Ethics Committee of hospital licensed) was digested into single olfactory ensheathing cells, which were then cultured and purified for 7-14 days, and finally made into single cell suspension. Then the cultured olfactory ensheathing cell suspension was transplanted into corresponding regions using microscope. Comparison was performed at preoperative and postoperative 1-2 months by the spinal cord injury functional rating scale of Xishan Hospital. Xishan hospital spinal cord injury functional rating scale includes 9 categories with 16 items in total, deploy 4 points, 3 points as normal, the lowest score is 0 point. The total score is 48 ponits. Patients with the score ranged from 0 to 16 points represented severe degree of functional handicap (significant impact on daily life); patients with the score ranged from 17 to 32 points meant moderate degree of functional handicap (some dependency indicated); patients with the score ranged from 33 to 47 points is mild degree of functional handicap (mostly independent); patients with the score of 48 points had normal function. This scale can roundly reflect the changes of neurological function. This scale not only involves sensory function, motor function, but also bladder control, bowel control, muscular tension, sweating, skin condition, pain, sexual function and the quality of life.
RESULTS: Twenty-one patients were involved in the result analysis. Scoring of 21 patients with old spinal cord injury neurological function by Xishan Hospital spinal cord injury functional rating scale was higher 1-2 months after olfactory ensheathing cell transplantation (Preoperative: 21.33±10.29，postoperative：25.19±11.16，P < 0.01) .
CONCLUSION: Xishan Hospital spinal cord injury functional rating scale can completely represent the changes in spinal cord function in postoperative patients. It is simple and convenient.

Liu C, Zheng ZC, Gao R, Zhang L, Zhang K, Zhang L, Wei SG, Zhang LQ, Kuang NF, Song YJ.Neurofunctional evaluation in spinal cord injury patients after olfactory ensheathing cell transplantation.Zhongguo Zuzhi Gongcheng Yanjiu yu Linchuang Kangfu 2008;12(16):3037-3040(China) [www.zglckf.com/zglckf/ejournal/upfiles/08-16/16k-3037(ps).pdf]

脊髓损伤之后，将引起损伤平面以下运动、感觉、以及植物神经功能的障碍，但是其治疗一直是科学家和临床医师面临的难题，近年来随着基础研究的飞速发展，使脊髓损伤后神经功能的修复有了突破性的进展[1-3]，而嗅鞘细胞移植被认为是治疗脊髓损伤最有前途的方法之一[4]，作者于2004年6月开始用嗅鞘细胞移植治疗陈旧性脊髓损伤，并采用2000年美国脊髓损伤学会制定的ASIA标准进行术前、术后评估[5]，取得了满意的效果[6-7]，从2007年7月作者开始同时采用北京西山医院脊髓损伤功能量表对21例陈旧性脊髓损伤患者进行术前、术后评价[8]。

设计：非随机自身对照。
单位：山东省泰安荣军医院神经外科。
对象：选择2007-07/11来源于全国各地的陈旧性脊髓患21例，男17例，女4例，年龄8~54岁，平均36岁，损伤时间为0.5~18年，平均1.5年。受伤原因：创伤性脊髓损伤17例，手术创伤1例，生物源性损伤即脊髓炎3例。损伤节段：颈段8例，胸腰段13例。脊髓损伤程度：14例为完全性脊髓损伤，7例为不完全性脊髓损伤。13例曾行脊髓减压手术治疗。21例均接受过不同种类的神经营养因子等治疗。所有患者均自愿接受细胞移植治疗并签自愿接受协议书。
方法：
细胞培养及鉴定：取4~6个月中期引产胚胎（由家属自愿捐献，并经过医院伦理委员会批准）的嗅球，剥膜后机械性剪碎，培养在含有10%~15%胎牛血清的D/F-12 培养液（GIBICO产品）内,3 d后换无血清DMEM纯化培养液，每3 d半量换液1次，继续培养7~ 10 d。消化细胞并制成单细胞悬液，其细胞浓度1× 1010 L-1左右。对纯化培养的细胞选择p75抗体作免疫组织化学染色，阳性者为嗅鞘细胞，纯度95%~98%。
外科手术和细胞移植：术前常规行MRI检查，根据MRI确定脊髓病变的部位。全麻下行病变节段后正中入路，去除病变部位的棘突和椎板，切开硬膜，显露脊髓。用手术显微镜在脊髓正常部位和脊髓病变交界处分多点注入约100 μL嗅鞘细胞悬液，约1×106个嗅鞘细胞，关闭硬膜和严密缝合各层。术后给与止血、抗感染等处理。
脊髓神经功能评定：嗅鞘细胞移植术前1 d及术后1.0~2.0个月，采用北京西山医院脊髓损伤功能量表进行术前和术后评定对比。

2.1 参与者数量分析 21例患者全部纳入结果分析。
2.2 患者神经功能评分结果嗅鞘细胞移植术前1 d及术后30~60天，在使用西山医院脊髓损伤功能量表的同时也使用了ASIA标准量表和作者的补充量表进行术前和术后评定对比，术前：21.33±10.29，术后：25.19±11.16，结果统计学差异具有显著性意义，t= -5.726，P=0）。

ASIA标准量表和作者的补充量表可以分别的统计运动、感觉及植物神经功能的变化，但是使用起来相对的比较繁琐。
2.3 统计学对比均发现嗅鞘细胞移植术后患者的运动、感觉和植物神经功能都有明显的改善见表2（P < 0.01）。

嗅鞘细胞是近年来发现的一种特殊的胶质细胞，它起源于嗅基底膜，分布在嗅球、嗅神经并可伴随嗅束迁徙入脑，目前可以应用很多种方法均能培养成功[9-11]，嗅鞘细胞除了具有许旺细胞的功能特点外，还具备星形胶质细胞的功能，能分泌神经生长因子(NGF)，脑源性神经营养因子（BDNF），神经营养素3(NT3)和神经营养素4（NT4）等因子促进损伤神经纤维的再生[12]，同时又能在损伤段为再生神经纤维形成髓鞘，引导轴突穿越胶质瘢痕，保护其不受局部抑制因子的影响[13]。实验证实嗅鞘细胞能够促进损伤脊髓感觉、运动功能的恢复[14]。国内的黄红云[15-16]教授首先将嗅鞘细胞移植到陈旧性脊髓损伤患者，术后运动、感觉及植物神经功能都有不同程度的改善，作者于2004年6月也开展了此项工作，结果和黄红云教授报道的一致，而后作者又将嗅鞘细胞移植应用到脊髓炎后遗症[17]、肌萎缩侧索硬化症、高血压脑出血等神经疾病患者，也取得了喜人的效果[18]。
脊髓损伤后的病理生理过程极其复杂，这就给早期诊断、分类、治疗、评估带来了很大的困难，及时准确地神经功能的评价，对于损伤程度的判断、拟定治疗方案及评估手术的效果有着重要的指导意义，同时对于临床科研及医生之间的交流也十分重要[19-21]。目前国际上应用最广泛的神经功能评估标准是2000年美国脊髓损伤学会制定的ASIA标准[5]，它被认为是对脊髓损伤神经功能敏感度最高的一种评价标准[22-23]。作者从开展嗅鞘细胞移植治疗陈旧性脊髓损伤以来，一直采用ASIA标准进行术前术后的评估，但是通过实践作者发现ASIA标准主要是偏重于神经学检查的评估，可以判定脊髓损伤所涉及的脊髓节段，并可以确定神经损害的各项指标并对其进行评定，这包括神经损伤水平，感觉损伤水平、运动损伤的平面等，但是对于植物神经功能如大小便功能、出汗及皮肤营养等功能性的情况不能很好的评估。而所有接受嗅鞘细胞移植的陈旧性脊髓损伤患者手术后最早出现的功能就是植物神经功能的改善，然后才是感觉和运动的缓慢恢复，这些植物神经功能的改善一般出现在移植后 1~7 d，最快的在术后24 h之内就可以出现[6]，这些改善同孙天胜[24]教授提出的观点相一致，即脊髓内移植嗅鞘细胞后可以获得轻度至中等程度的功能改善，功能恢复和可能性由高到低为：皮肤营养状况、痉挛、膀胱和肠道功能、浅感觉（最长达10个节段）、运动，这与进化论是完全吻合的。
作者自己也曾经制定了ASIA标准的功能观察补充表（见表1）[6]，此表能够较好的反映出脊髓损伤患者嗅鞘细胞移植术后植物神经功能的变化，但是必须要和ASIA标准同时使用，互为补充。而北京西山医院脊髓损伤损伤功能量表是一套专门应用于脊髓损伤患者功能的评价量表，该量表9大项16小项，采用4分制，能全面地体现患者的功能变化，不仅包括运动感觉的变化，还包括了膀胱、直肠、肌张力、皮肤营养状况、泌汗、性功能、疼痛、生存和生活质量的评价。同时此量表对于医护人员和患者及其家属比较容易和理解，即使没有医护人员的参与，其家属也能自己作出评价，这样对术后长期的随访有很大的帮助，大大减轻了医务工作者的负担。
作者在使用西山医院脊髓损伤功能量表的同时也使用了ASIA标准量表和作者的补充量表，统计学对比均发现嗅鞘细胞移植术后患者的运动、感觉和植物神经功能都有明显的改善（P < 0.01），ASIA标准量表和作者的补充量表可以分别的统计运动、感觉及植物神经功能的变化，但是使用起来相对的比较繁琐，而西山脊髓功能量表使用简单，可以总体的观察到嗅鞘细胞移植术后患者脊髓功能性的改变。同时作者还发现21例患者中术后重度残障由6例变为5例，中度残障由13例变为12例，轻度的由2例增加到4例，虽然例数的变化不是很大，但是在评分时候发现很多患者的残障分度虽然没有改变，但是评分已有明显的增加，并且已经接近于该级评分的上限，这也许和作者统计的例数尚少有一定的关系，需要在以后的工作中继续观察完善。
西山医院脊髓功能量表是一套专门应用于脊髓损伤患者的功能量表，它侧重于脊髓功能性恢复的评估，能全面、精确的反映出术后脊髓患者功能的变化，对于脊髓损伤患者治疗方案的制定以及手术效果的评价有着重要的指导意义，且该量表简单易行，易于术后患者的随访，减轻了医务工作者的负担，值得推广应用。

1 Polentes J,Gauthier P. Transplantation of olfactory glial cells after spinal injury. I--From experimental data to repair strategy after central injury. Neurochirurgie 2005; 51(5):421-434
2 Ramon-cueto A, Cordero MI, Santos-Benito FF, et al . Functional recovery of paraplegic rats and motor axon regeneration in their spinal cords by olfactory ensheathing glia. Neuron 2000;25(2):425-435
3 Keyvan-Fouladi N, Raisman G, Li Y. Functional repair of the corticospinal tract by delayed transplantation of olfactory ensheathing cells in adult rats. J Neurosci 2003;23(28):9428-9434
4 陈宾，刘忠军.嗅鞘细胞在脊髓损伤修复重建中的研究现状及最新进展[J].中华骨科杂志，2007，27（9）: 711-713
5 Maynard FM Jr, Bracken MB, Creasey G, et al. International Standards for Neurological and Functional Classification of Spinal Cord Injury. American Spinal Injury Association. Spinal Cord 1997;35(5):266-274
6 郑遵成，刘超，张振兴，等.嗅鞘细胞移植治疗陈旧性脊髓损伤48例.[J] 中国组织工程研究与临床康复，2006，10：170-172
7 郑遵成，刘超，张林，等.嗅鞘细胞移植治疗陈旧性脊髓损伤106例：年龄、性别、病程、损伤类型及部位间的效果差异[J].中国神经再生研究(英文版)，2007，2(6):380-384
8 黄红云，郗海涛，陈琳，等.西山医院脊髓损伤功能功能量表内容介绍[J].中国组织工程研究与临床康复，2007，11（30）：5928-5930
9 Ramer LM, Au E, Richter MW，et al.Peripheral olfactory ensheathing cells reduce scar and cavity formation and promote regeneration after spinal cord injury.J Comp Neurol 2004;473(1):1-15
10 Au E, Roskams AJ. Olfactory ensheathing cells of the lamina propria in vivo and in vitro.Glia 2003;41(3):224-236
11 Bianco JI, Perry C, Harkin DG，et al. Neurotrophin 3 promotes purification and proliferation of olfactory ensheathing cells from human nose.Glia 2004 ;45(2):111-123
12 Ramon-cuteo A, Avila J. Olfactory ensheathing glia: properties and function. Brain Res Bull 1998;46(3):175-187
13 Ramon-Cueto A , Plant GW, Avila J, et al . Long-distance axonal regeneration in the transected adult rat spinal cord is promoted by olfactory ensheathing glia transplants.J Neurosci 1998；18（10）:3803-2815
14 Li Y, Field PM, Raisman G.. Repair of adult rat corticospinal tract by transplants of olfactory ensheathing cells.Science 1997；277:2000-2002
15 黄红云，陈琳，王洪美，等.嗅鞘细胞移植改善晚期脊髓损伤患者神经功能的近期效应[J].中国组织工程研究与临床康复，2006，10（13）：190-192
16 黄红云，王洪美，陈琳，等.嗅鞘细胞移植治疗晚期脊髓损伤临床试验初步报告[J].立体定向和功能性神经外科杂志，2004，17（6）：348-350
17 刘超，郑遵成，丁娜，等.嗅鞘细胞移植治疗脊髓炎后遗症的初步报告[J].中国民康医学，2006，18（8）：571-572
18 黄红云，陈琳，王洪美，等.嗅鞘细胞移植治疗肌萎缩侧索硬化症：88例近期结果报告[J]. 中国组织工程研究与临床康复，2006，10（1）：39-41
19 Kirshblum S,Millis S,McKinley W,et al. Late neurologic recovery after traumatic spinal cord injury. Arch Phys Med Rehabil,2004,85(11):1811-1817
20 王方永，李建军，洪毅，等.采用ASIA2000标准对脊髓损伤患者步行能力的预后评估[J].中国脊髓脊柱杂志，2006，16（4）：276-279
21 周天健，李建军.脊柱脊髓损伤现代康复与治疗[M].北京：人民卫生出版社，2006：716-725
22 Tozato F, Tobimatsu Y,Wang CW, et al. Reliability and validity of the Craig handicap assessment and reporting technique for Japanese individuals with spinal cord injury . Tohoku J Exp Med 2005；205(4): 357-366
23 王方永，李建军，洪毅.ASIA2000标准信度分析[J].中国康复理论与实践，2006，12（2）：140-142
24 孙天胜.以进化论的观点评价细胞移植治疗脊髓损伤[J].中国脊柱脊髓杂志，2007，17（9）：651-653