相关链接：美国Kao 等用自体周围神经移植治疗脊髓损伤，术后发现再生轴突通过移植的周围神经重新恢复了脊髓损伤的连续性，截痪的肢体功能有部分恢复。中国第二、三军医大学等探讨不同条件下周围神经移植修复脊髓损伤的能力，虽然能提高损伤脊髓的再生能力，但其作用微弱，无明显的功能性恢复。骨髓间充质干细胞可在中枢神经系统内成活并可分化成为神经样细胞，将其移植于脊髓损伤部位后，实验动物瘫痪肢体的肌力得到部分恢复，临床单独应用骨髓间充质干细胞移植治疗脊髓损伤安全有效，但临床效果不显著。进一步的研究表明，脊髓损伤后任何简单的介入策略都不能确保损伤传导束的再生和功能恢复。

创新要点：实验设计的自体周围神经与骨髓间充质干细胞联合移植治疗脊髓损伤，将国际前沿的干细胞技术与神经移植技术有机结合，采用手术与药物及物理相结合的治疗方案，综合考虑了脊髓损伤后继发损伤的防治、亚急性/慢性阶段的神经保护、轴索/神经元的持续再生以及神经回路的重建，以全新的角度、创新的思维来探索脊髓损伤的治疗。

偏倚或不足：本实验在临床上没有对照组，因为患者及家属都要求采用此方法帮助患者恢复。同时在临床上患者具有医疗知情权和选择治疗方法的权利，因此本文没有设对照组和单独的骨髓间充质干细胞和单独的外周神经移植组。

河南省人民医院，
1神经外科，2骨科，3生物研究所，4肌电图室，5血液研究所，河南省郑州市 450003

李志营★，男，1981年生，河南省杞县人，汉族，新乡医学院在读硕士，主要从事脑、脊髓损伤的治疗研究。
xiangyu_16888@
163.com

通讯作者：步星耀，主任医师，博士后，研究生导师，河南省人民医院神经外科，河南省郑州市
450003 buxingyao@
126.com

河南省科技攻关项目（05244200
54）*与河南省医学科技攻关计划资助项目*

摘要
目的:研究发现，应用骨髓间充质干细胞联合周围神经移植治疗脊髓损伤有协同作用。实验拟验证自体骨髓间质干细胞联合周围神经移植治疗脊髓损伤的临床疗效,为脊髓损伤的治疗开辟新途径。
方法: 选择2003/2004河南省人民医院神经外科干细胞移植治疗中心收治的78例完全性脊髓损伤患者。男52例，女26例，年龄18~52岁。其中颈髓损伤12例，胸髓损伤46例，腰骶髓损伤20例，损伤1周至60个月。患者对治疗知情同意，并要求采用该方法治疗。无菌条件下，自患者髂前上棘及髂后上棘通过骨髓穿刺抽取骨髓,分离、纯化、培养骨髓间充质干细胞。选取患者自体腓肠神经作为周围神经移植供体，将自身腓肠神经应用显微外科方法去除外膜、束膜，并剪神经，使神经组织的质地、外观类似于马尾组织，将其排列呈多条状、纵行植入已切开的脊髓处或原囊肿腔内，然后用分离纯化的骨髓间充质干细胞移植焊接移植的神经，对患者行自体骨髓间充质干细胞联合周围神经移植治疗,术后给予神经生长因子等药物应用, 疗程为1个月,以促进损伤神经的修复。实验评估：通过电话随访和患者定时回医院复查的方式，术后每3个月随访1次,随访1年。术前、术后和随访按国际截瘫医学会评分标准ASIA评分标准评分，评分的增高表示患者的运动和感觉的功能的恢复。同时进行神经电生理、影像学等方面对比分析。
结果: 78例患者中除1例严重复合伤患者出现并发症，经积极治疗无效死亡，其余患者术后均顺利出院，原有症状改善情况，未出现明显不良毒副反应。患者术后ASIA评分的平均数较术前提高。37例出现运动、感觉、影像学、神经电生理方面的不同改善,25例出现不同程度的运动，感觉、神经电生理方面的改善，9例出现神经电生理方面的改善,6例无变化,1例死亡；在随后的1年随访中，除2例失访外，其余患者均有不同程度进一步恢复的趋势，无明显毒副反应发生。
结论: 自体骨髓间质干细胞联合周围神经移植治疗脊髓损伤促进脊髓损伤患者的功能恢复,安全有效,有临床推广应用的价值。
关键词: 移植；骨髓间充质干细胞；周围神经；脊髓损伤

李志营，步星耀，张圣旭，梁庆华，李太平，陈书连，李六一，赵耀武，翟亚平，张永福.自体骨髓间充质干细胞联合周围神经移植治疗脊髓损伤[J].中国组织工程研究与临床康复，2008，12(16):3041-3044
[www.zglckf.com/zglckf/ejournal/upfiles/08-16/16k-3041(ps).pdf]

中图分类号: R394.2
文献标识码: A
文章编号: 1673-8225
(2008)16-03041-04

收稿日期：2007-12-05
修回日期：2008-01-16
(07-50-12-6748/GW·Q)

Autologous bone marrow mesenchymal stem cells in combination with peripheral nerve transplantation for treating spinal cord injury

Abstract

AIM:There are synergistic effects of bone marrow mesenchymal stem cells (BMSCs) combined with peripheral nerve transplantation for spinal cord injury (SCI). This article confirmed the therapeutic effect of BMSCs combining peripheral nerve transplantation on SCI. A new therapeutic method for SCI was authenticated.
METHODS: Totally 78 patients with complete SCI aged 18-52 years (52 males and 26 females) were enrolled at the Stem Cell Transplantation Center of Department of Neurosurgery of Henan People’s Hospital from 2003 to 2004. There were 12 patients with cervical cord injury, 46 patients with thoracic cord injury and 20 patients with lumbar sacral cord injury (injured for 1 week to 60 months). All patients singed informed consents. Bone marrow was sterilely collected from the anterior superior iliac spine and posterior superior iliac spine by bone marrow aspiration. BMSCs were harvested, purified and cultured. Autologous sural nerve was obtained from patients as donor for peripheral nerve transplantation. Adventitial coat of autologous sural nerve was removed, clustered and cut into cauda equina-like tissues, which were arranged stick-shape and longitudinally transplanted into the spinal cord or cystis. Patients received autologous BMSCs combined with peripheral nerve transplantation. These patients were treated with nerve growth factor after transplantation for one month to improve the restoration of injured nerve. Post-operative follow-up was performed by telephone or going back to hospital every three months, totally for 1 year. Preoperative and postoperative evaluation and follow-up were conducted according to International Medical Society of Paraplegia standards, American Spinal Injury Association (ASIA) scores, and the higher score represented the restoration of exercises and sensory function. Simultaneously, controlled analysis was done in imageology, and neural-electrophysiology.
RESULTS: All of the 78 patients were smoothly discharged except for 1 patient with serious compound wound died of complication after active treatment. Totally 77 patients were improved, and no obvious adverse events were found. Average ASIA score was higher after surgery than before surgery. Thirty-seven patients had improvement in motor, sensation, imageology and neural-electrophysiology. Twenty-five patients had improvement in motor, sensation and neural-electrophysiology. Nine patients had improvement in neural-electrophysiology. Six patients were ineffective. One patient died. In the one-year follow-up, two patients were dropped out, and the remaining was improved, and no obvious adverse events were found.
CONCLUSION: Peripheral nerve combining autologous BMSC transplantation can improve neural functional recovery of SCI patients. It is an effective and safe approach for treatment of SCI and worth to apply in clinic.

Li ZY, Bu XY, Zhang SX, Liang QH, Li TP, Chen SL, Li LY, Zhao YW, Zhai YP, Zhang YF.Autologous bone marrow mesenchymal stem cells in combination with peripheral nerve transplantation for treating spinal cord injury.Zhongguo Zuzhi Gongcheng Yanjiu yu Linchuang Kangfu 2008;12(16):3041-3044 [www.zglckf.com/zglckf/ejournal/upfiles/08-16/16k-3041(ps).pdf]

0 引言

随着神经的可移植性获得证明和分子生物学的迅速崛起,为脊髓损伤的治疗打开了新的思路。周围神经的移植可以诱发脊髓损伤患者的中枢神经系统的再生能力，但作用有限[1]。骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells, MSCs )以其取材方便，低免疫源性，潜在的多向分化潜力以及可自体移植等诸多优点，日益引起国内外学者的关注。同时研究发现应用骨髓间充质干细胞联合周围神经移植治疗脊髓损伤有协同作用[2]。近年来，作者单位通过自体骨髓干细胞移植联合周围神经移植治疗78例脊髓损伤患者，取得一定的临床疗效。

1 对象和方法

设计：以病历资料为调查对象，回顾性分析。
单位：河南省人民医院神经外科。
对象：选择2003/2004河南省人民医院神经外科干细胞移植治疗中心收治的78例完全性脊髓损伤患者。男52例、女26例。年龄在18~52岁，平均33.7岁。其中颈髓损伤12例、胸髓损伤46例、腰骶髓损伤20例。均为外伤性脊髓损伤。损伤后至治疗的时间间隔为1周至60个月，平均27月。患者及家属对治疗均知情同意，并要求采用该疗法治疗。患者治疗前后均按照美国脊髓损伤学会制定的评分标准（ASIA）评分。术前合并压疮8例，糖尿病2例。
设计、实施、评估者：实验设计、干预实验及评估均为本文全体作者，全部经过正规培训，未使用盲法评估。
方法：
术前检查：患者入院后采取常规术前检查，确定患者是否有手术禁忌证，并且行脊髓核磁共振和神经电生理检查，了解脊髓受伤节段软化程度和是否受压及脊髓残留功能等情况。其中MRI显示脊髓压迫的21例，脊髓出血水肿12例，脊髓软化灶14例，囊变或空洞17例，脊髓萎缩14例，同时行ASIA评分，综合判断患者损伤情况。
干细胞的分离纯化及培养扩增：无菌条件下自患者髂前上棘及髂后上棘通过骨髓穿刺抽取150 mL左右的骨髓, 肝素化骨髓，加入冰醋酸溶解红细胞，过200目/cm2滤网除去小凝血块，以PBS缓冲液洗涤2次，同时去除上层脂肪滴，再用含自体血清的DMEM/F12(Gibco公司)等倍稀释，以1.5∶1的比例缓慢加于Percoll分离液 (Phamacia公司，比重1.073 g/mL)的表面， 2 500 r/min 离心30 min，制备单个核细胞(MNCs)。用培养基洗涤细胞2次，将所获得的细胞记数，一部分用于术中移植，另外一部分按2×105/cm2的密度接种于一次性塑料培养瓶(Gibco公司)中，加入DMEM/F12培养液（含自体血清,100 U/mL青霉素, 100 U/mL链霉素），置37 ℃, 5% CO2，饱和湿度的培养箱中培养，3 d后弃去未贴壁细胞，更换培养液，以后每二三天换液1次；融合的MSCs达到近90%时视为原代，待需用时，用0.25%胰酶（Sigma）室温下消化5~8 min,1 500 r/min离心15 min，洗涤2次，并将所获得的细胞记数。自体周围神经联合干细胞移植方法：术前积极控制并发症。一般选取自体患者腓肠神经作为周围神经移植供体。全麻下，病变节段后方入路，逐层显

露，打开椎管，去除压迫，采用显微外科技术，切开硬脊膜，先探查脊髓有无受压及清除椎管内异物，然后将蛛网膜、软脊膜、齿状韧带、神经根起始段与脊髓的粘连彻底解除。将损伤段的脊髓行4~8个纵切口，深0.1~ 0.2 mm，长度超过损伤节段；若有脊髓内囊肿、则切开后吸出其中液体。然后，将自身腓肠神经用显微外科方法去除外膜、束膜，并剪开、使神经组织的质地、外观类似于马尾组织，将其排列呈多条状、纵行植入已切开的脊髓处或原囊肿腔内，然后用分离纯化的MSCs移植焊接移植的神经，明胶海绵覆盖，敞开硬脊膜，严密缝合切口，术后每日给予神经生长因子2 000 AU(nerve growth factor，NGF，厦门北大之路生物工程有限公司生产)肌注应以利修复。以促进损伤神经的修复。MSCs经离体扩增培养后，于术后第7，14天经腰穿椎管内置入，移植于蛛网膜下腔，使之随脑脊液到达病变部位，总疗程约1个月。通过电话随访和患者定时回医院复查的方式，术后每3个月随访1次,随访1年。采用美国脊髓损伤学会（ASIA）制定的评分标准，左右侧分开神经学检查，选择每侧28个关键感觉点，针对28个皮节；每侧10块肌肉针对10个肌节。术前和术后运动、轻触觉和痛觉功能评分对比；同时行影像学、神经电生理检查。性功能恢复根据患者自述是否可以正常勃起及持续时间长短来判定；大小便功能恢复通过患者是否有知觉及是否可以控制来判断。
主要观察指标：患者治疗前后ASIA评分与神经点生理检测。
统计学方法：由第一、第三作者采用SPAA 12.0统计软件包进行统计学分析，结果以P ＜ 0.05为有显著意义。术前术后ASIA评分和神经电生理比较用配对t检验。

2 结果

术前术后对比：78例患者中除1例严重复合伤患者出现并发症，经积极治疗无效死亡，其余患者术后均顺利出院，原有症状改善情况，未出现明显不良毒副反应，术后1月MRI表现：脊髓原病变界面不清，范围缩小，内可见脊髓斑点状生长和/或萎缩的脊髓周围增粗。患者术前和术后1个月的ASIA评分对比（表1）和神经电生理对比（表2）。37例患者感觉、肢体运动功能、神经电生理和影像学有恢复，患者表现为损伤平面的关键肌肌力的增加，损伤平面以下的运动功能有所恢复，运动评分增加; 感觉功能(触觉和痛觉)均有明显的恢复，感觉平面下降3~8个脊髓节段，感觉评分明显增加，19例患者尿便基本可以控制；13例脊髓损伤截瘫患者的性功能恢复明显，3例患者恢复接近正常，10例可以勃起，持续时间较短；另外25例患者出现不同程度的运动，感觉、神经电生理方面的改善的神经电生理、影像学方面的改善。9例出现神经电生理方面的改善；6例无效；在随后的一年的随访中，除2例失访外，其余患者均有不同程度进一步恢复的趋势，但恢复不是很大，无明显毒副反应发生。

3 讨论

研究发现脊髓损伤后仍存在一定的再生能力，其受诸多因素的影响，如脊髓中具有支持和引导神经生长的许旺氏细胞、基板、神经膜管、细胞外的基质成分及神经营养因子等[3-4]。周围神经植入成年哺乳动物损伤的脊髓内不仅可诱导和促进脊髓再生，而且可使再生的轴突沿着周围神经桥延伸较远的距离[5]，基础和临床研究显示用自体周围神经植入损伤的脊髓内不仅可诱导和促进脊髓再生，而且再生的轴突可沿着周围神经桥延伸到较远距离[6]。但受损节段的前角细胞功能和细胞与轴索功能修复并非因自体周围神经的移植可以完全替代[7-8]。发现应用MSCs移植治疗脊髓损伤安全显效[9-10]，但单一的MSCs移植不能达到理想的效果[2,7,11]。本实验在显微镜下去除脊髓内的瘢痕，松解黏连。用自体腓肠神经，镜下处理后，联合骨髓间充质干细胞移植于损伤脊髓两端行桥接固定，同时利用骨髓间充质的趋化性，多次间断腰穿椎管内植入骨髓间充质干细胞，促进移植的周围神经和骨髓间充质干细胞存活、迁移和分化，促进轴突的生长，改善脊髓损伤的功能，结果显示效果较单一的周围神经和单一的MSCs治疗效果好。
本组78例脊髓损伤患者术后约92﹪的患者的有改善，47﹪患者的功能有明显的改善，未出现明显不良毒副反应。患者损伤平面的关键肌肌力的增加，损伤平面以下的运动功能有所恢复,运动评分明显增加（P < 0.01），感觉功能(触觉和痛觉)均有明显的恢复，感觉评分明显增加(P < 0.01)。神经电生理的潜伏期和波峰也有明显的恢复（P < 0.01）。且临床治疗有效率有随时间延长而呈上升的趋势。在远期疗效观察发现，不完全性脊髓损伤的ASIA评分和神经电生理潜伏期和波峰以及影像学恢复明显好于完全性脊髓损伤。Fehings等[12]证实了脊髓损伤后只要恢复到5﹪~10﹪的轴突即可使脊髓的重要残留功能得以恢复，和本实验结果相吻合。说明不完全性脊髓损伤的功能恢复相对较好。由于临床病例有限，不能分组研究，但从本组研究中发现早期的移植（受伤1月内做细胞移植）的治疗效果要明显好于晚期（受伤1年后做细胞移植）的治疗效果。6例无效患者全部为慢性的完全性脊髓损伤，分析原因主要为后期神经纤维的变性坏死，胶质瘢痕增生、软化灶和脊髓空洞的形成，不利于脊髓损伤的修复，这和Syková等[13]结论相吻合，急性期移植治疗较慢性期移植治疗效果要好，同时不排除早期自体修复的存在。具体的最佳移植时间还有待于进一步的研究。另外年龄也是影响疗效的一个因素，年轻的患者恢复较好。Fehings等[14]研究也得出了相同的结论。由于观察和随访时间仅为1年，其远期疗效还有待于进一步观察。
骨髓间充质干细胞联合周围神经治疗脊髓损伤的可能机制为：纵向多条排列的自体周围神经组织具有良好导向及支架作用，同时周围神经中的许旺细胞起着关键作用，许旺细胞分泌多种神经营养因子和细胞外基质-具有保护和营养受损神经元，诱导轴突再生的作用[5]，同时移植的周围神经对损伤脊髓两端的再生连接起到了一个有效的桥梁作用，促使再生轴突延伸至较远距 离[7,15]，为神经再生、脊髓功能恢复创造了良好的微环境，对宿主脊髓神经元和移植的骨髓间充质干细胞具有良好的导向、桥接、营养、诱导、趋化的作用。骨髓间充质干细胞可以通过分泌神经营养因子，促进血管再生，抑制凋亡[16] 、促进神经再生，转化为神经细胞等作用[17-18]。作者通过外科手术解除黏连压迫，将组织移植和细胞移植相结合，二者相互促进，增强脊髓损伤的修复能力，同时术后应用神经生长因子，促进移植神经(许旺细胞)和骨髓间充质干细胞的存活，诱导MSCs向神经细胞转化和促进轴突的生长，但其作用机制尚需要大量的实验研究证实。
本实验发现本组多数患者在移植术后1周内即有自觉症状的改善，可能与植入的MSCs和周围神经（许旺细胞）分泌某些神经因子,启动了宿主自体的修复有关，尽管人们认为损伤的轴突的再生和突触的形成是整体功能恢复的必要条件[19]，但移植细胞的神经递质的释放也具有促进神经功能恢复的作用[20]，这些结果说明在局部微环境的作用下，有可能形成促进部分轴突的再生，而功能重建则是局限于一定范围的。

4 参考文献

1 Moissonnier P, Reviron T, Ye JH, et al. Motoneurons of the injured spinal cord of the adult dog can grow lengthy axons into an autologous peripheral nerve graft. A retrograde axonal tracing study. Spinal Cord 1996;34(6):320-325
2 Bu XR,Zhang YF.Shiyong Zhenduan Yu Zhiliao Zazhi 2004;18(4):259-261
步星耀，张永福．骨髓间质干细胞移植治疗脊髓损伤[J]．实用诊断与治疗杂志，2004，18(4)：259-261
3 Schwab ME．Repairing the injured spinal cord．Science 2002；8：1029-1031
4 Cheng H,Cao Y, Olson L. Spinal cord repair in adult paraplegic rats: partial restoration of hind limb function. Science 1996;273(5274):510-513
5 Hill CE,Moon LD, Wood PM, et al. labeled Schwann cell transplantation : cell loss, host Schwann cell replacement, and strategies to enhance survival. Glia 2006;53(3):338-343
6 Dezawa M. Future views and challenges to the peripheral nerve regeneration by cell based therapy. Rinsho Shinkeigaku 2005;45(11):877-879
7 Hamada H, Kobune M, Nakamura K,et al. Mesenchymal stem cells (MSC) as therapeutic cytoreagents for gene therapy. Cancer Sci 2005;96 (3):149–156
8 Bu XR,Huang ZQ,Zhang YF.Shiyong Zhenduan Yu Zhiliao Zazhi 2004;18(1):35-38
步星耀，黄志起， 张永福.骨髓基质细胞的生物学特性及应用研究[J].实用诊断与治疗杂志，2004，18(1)：35-38
9 Wu S, Suzuki Y, Ejiri Y, et al. Bone marrow stromal cells enhance differentiation of cocultured neurosphere cells and promote regeneration of injured spinal cord.J Neurosci Res 2003;72（3）：343
10 Cao Q, Ding P, Lu J, et al. 2', 3'-Cyclic nucleotide 3'-phosphodiesterase cells derived from transplanted marrow stromal cells and host tissue contribute to perineurial compartment formation in injured rat spinal cord. J Neurosci Res 2007 ;85(1):116-130
11 Ohta M, Suzuki Y, Noda T, et al. Bone marrow stromal cells infused into the cerebrospinal fluid promote functional recovery of the injured rat spinal cord with reduced cavity formation. Exp Neurol 2004;187(2):266-278
12 Fehlings MG, Perrin RG. The role and timing of early decompression for cervical spinal cord injury: update with a review of recent clinical evidence. Injury 2005;36 Suppl 2:B13-26
13 Syková E, Jendelová P, Urdzíková L, et al. Bone marrow stem cells and polymer hydrogels two strategies for spinal cord injury repair. Cell Mol Neurobiol 2006;26(7-8):1113-1129
14 Fehlings MG, Furlan JC. Effect of age on spinal cord injury.J Neurosurg Spine 2007;7(3):275-276
15 Lu P, Jones LL, Tuszynski MH. Axon regeneration through scars and into sites of chronic spinal cord injury. Exp Neurol 2007;203(1):8-21
16 Parr AM, Tator CH, Keating A. Bone marrow-derived mesenchymal stromal cells for the repair of central nervous system injury. Bone Marrow Transplant 2007;40(7):609-619
17 Caplan AI. Adult mesenchymal stem cells for tissue engineering versus regenerative medicine. J Cell Physiol 2007;213(2):341-347
18 Parr AM, Tator CH, Keating A. Bone marrow-derived mesenchymal stromal cells for the repair of central nervous system injury. Bone Marrow Transplant 2007;40(7):609-619
19 Im GI, Shin YW, Lee KB. Do adipose tissue-derived mesenchymal stem cells have the same osteogenic and chondrogenic potential as bone marrow-derived cells? Osteoarthritis Cartilage 2005;13(10):845-853
20 Zhang W, Zeng YS, Zhang XB, et al. Combination of adenoviral vector-mediated neurotrophin-3 gene transfer and retinoic acid promotes adult bone marrow cells to differentiate into neuronal phenotypes. Neurosci Lett 2006 ;408(2):98-103