TJU103体外诱导造血干细胞移植的免疫耐受*☆

体外诱导大鼠骨髓间充质干细胞分化为胰岛素分泌细胞*★

周健，涂三芳，郭坤元，孙明，胡亮杉，吴远彬，卢晓珣，王杨

相关链接：广州市政府科技计划项目“遗传上HLA半相合骨髓细胞优化移植技术平台建设”(200523-E0551)。前期的小鼠体内实验研究表明，TJU103可以明显降低异基因造血干细胞移植小鼠移植物抗宿主病的发生率和程度，并且不增加感染率，不影响小鼠的移植物抗白血病效应，从而明显延长小鼠移植后的生存期。

创新要点：移植物抗宿主病是影响异基因造血干细胞移植疗效的关键因素。目前主要是应用免疫抑制剂减轻急性移植物抗宿主病，但同时使增加了患者白血病复发和感染的机率；而慢性移植物抗宿主病的治疗尚没有特效药物。本实验通过TJU103特异性阻断CD4+ T细胞活化的抗原信号通路，打破CD4+T细胞与CD8+T细胞间的协同作用，降低移植物抗宿主病的发生率，诱导免疫耐受，结果显示，TJU103降低T淋巴细胞增殖反应的同时并不影响其抗白血病效应。

偏倚或不足：①单向混合淋巴细胞培养的样本数量还不够大。②由于本实验是细胞水平的体外实验研究，无法对TJU103是否影响造血干细胞移植后的感染率进行研究。

周健☆，男，1974年生，河南省南阳市人，汉族，南方医科大学在读博士，主要从事造血干细胞移植和血液肿瘤生物治疗方面的研究。
zhoujiandoctor@
163.com

通讯作者：郭坤元，教授，博士生导师，南方医科大学珠江医院血液科，广东省广州市 510282

摘要
目的:前期研究表明，吲哚亚甲基异烟腙(简称TJU103)可以明显降低异基因造血干细胞移植小鼠移植物抗宿主病的发生率和程度，明显延长小鼠移植后的生存期。实验拟观察TJU103诱导造血干细胞移植免疫耐受和对移植物抗白血病的影响，探索一条既能降低移植物抗宿主病又能保留移植物抗白血病的移植途径。
方法：实验于2007-07/10在南方医科大学珠江医院血液科实验室完成。①实验材料：人急性髓系白血病细胞株KG1a由中国医学科学院血液学研究所宋增璇教授惠赠。10份自愿捐献的健康人外周血白细胞由广州市中心血站提供，等分为供者与受者。②实验方法：采用梯度密度沉淀法常规分离人外周血单个核细胞。以供者外周血单个核细胞作为反应细胞，受者正常外周血单个核细胞作为刺激细胞，体外建立异基因造血干细胞移植中供、受者间的单向混合淋巴细胞反应体系，应用TJU103阻断CD4+T细胞激活的抗原信号通路，设单独刺激细胞和反应细胞对照以及1640完全培养基空白对照。③实验评估：于培养第1、3、5天应用MTT检测TJU103对供者淋巴细胞的增殖活性的影响，于第5天用乳酸脱氢酶释放法分别检测10∶1， 20∶1，40∶1效靶比时供者淋巴细胞对受者单个核细胞和急性髓系白血病细胞KG1a的细胞毒活性影响，同时采用流式细胞仪检测CD4+CD25+T细胞的百分比。
结果：第3天和第5天实验组A值低于对照组 (P < 0.05)。单向混合淋巴细胞5 d后实验组各效靶比供者T细胞杀伤受者外周血单个核细胞的活性明显低于对照孔 (P < 0.05)；二者对KG1a细胞的杀伤活性差异不显著 (P > 0.05)。TJU103对供者CD4+CD25+T细胞无影响。
结论：TJU103降低T淋巴细胞增殖反应的同时并不影响其抗白血病效应，有望用于临床异基因造血干细胞移植中移植物抗宿主病和移植物抗白血病的免疫调节。
关键词：干细胞移植；TJU103；T淋巴细胞增殖；细胞毒活性；移植物抗宿主病；移植物抗白血病；免疫耐受

周健，涂三芳，郭坤元，孙明，胡亮杉，吴远彬，卢晓珣，王杨.TJU103体外诱导造血干细胞移植的免疫耐受[J].中国组织工程研究与临床康复，2008，12(16):3049-3052 [www.zglckf.com/zglckf/ejournal/upfiles/08-16/16k-3049(ps).pdf]

中图分类号: R394.2
文献标识码: A
文章编号: 1673-8225
(2008)16-03049-04

Immunotolerance to haemopoietic stem cell transplantation induced by TJU103 in vitro

AIM:Pristine investigation demonstrated that TJU103 could markedly decrease graft versus host disease (GVHD) incidence and intensity, and obviously prolonge life span after allogenetic haemopoietic stem cell transplantation (allo-HSCT) in mice. This experiment is designed to explore the effects of TJU103 on tolerance and graft versus leukemia (GVL) in allo-HSCT in vitro in order to seek an effective access to transplantation remaining GVL and with less GVHD.
METHODS: Experiments were performed at the Department of Hematology of Zhujiang Hospital of Southern Medical University from July to October 2007. ①Human acute myelogenous leukemia lines KG1a was presented by professor Song in Hematology Institute of Chinese Academy of Medical Sciences. All 10 peripheral blood samples were collected from healthy volunteers at Guangzhou Blood Center, and were divided equally into donors and recipients. ② Peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) were obtained by traditional precipitation method discriminated by gradient density. Donor PBMCs and recipient PBMCs were took as responsive cell and antigenic stimulus cell，respectively. One-way mixture lymphocyte culture (MLC) response system between donor and recipient was modeled in vitro. The antigen activated pathway of CD4 positive T cell was blocked by TJU103. The blank control group of 1640 complete medium and control group of alone responsive cell and antigenic stimulus cell were set. ③Effects of TJU103 on donor T lymphocytes proliferation was estimated by MTT assay at MLC 1, 3, 5 days. Cytotoxicity of donor T lymphocytes blocked by TJU103 against recipient T lymphocytes and KG1a cell were measured by LDH releasing assay at different effector-to-target cell ratios (E:T, 10:1, 20:1 40:1) at MLC 5 days. Meanwhile, the ratio of donor CD4+CD25+ T lymphocytes was assayed by flow cytometry (FCM).
RESULTS: The A numerical values of experiment group were lower than control group at MLC 3 and 5 days (P < 0.05). Cytotoxicities of experiment group donor T cells against recipient PBMCs were significantly lower than control group at same E:T ratios at MLC 5 days (P < 0.05), but there was no difference in the ability of cytotoxicity against KG1a cell between them (P > 0.05). The ratio of donor CD4+CD25+ T lymphocyte was not affected by TJU103.
CONCLUSION: TJU103 may prohibit the T-cell proliferation significantly, but the ability of anti-leukemia is not influenced. TJU103 might be used to regulate the immune response of GVHD and GVL in clinical transplantation.

Zhou J, Tu SF, Guo KY, Sun M, Hu LS, Wu YB, Lu XX, Wang Y.Immunotolerance to haemopoietic stem cell transplantation induced by TJU103 in vitro.Zhongguo Zuzhi Gongcheng Yanjiu yu Linchuang Kangfu 2008;12(16):3049-3052(China)
[www.zglckf.com/zglckf/ejournal/upfiles/08-16/16k-3049(ps).pdf]

异基因造血干细胞移植是目前根治白血病、重型再生障碍性贫血、淋巴瘤等恶性血液系统疾病，以及某些遗传性疾病、免疫缺陷病、自身免疫性疾病的最有效方法之一[1]，但是，因供受者主要或次要组织相容性抗原存在差异而引起的移植物抗宿主病仍是影响异基因造血干细胞移植疗效的关键因素[2-4]。本实验室前期的研究表明，吲哚亚甲基异烟腙(以下简称TJU103)可以显著降低异基因造血干细胞移植小鼠移植物抗宿主病的发生率和程度，明显延长小鼠移植后的生存期[5-6]。本实验应用标准5 d的单向混合淋巴细胞培养体系，探讨TJU103对人T淋巴细胞增殖和细胞毒活性的体外影响，进一步研究TJU103的作用机制，为TJU103应用到异基因造血干细胞移植的临床实践中提供实验和理论依据。

设计：以细胞为观察对象的随机对照实验。
单位：南方医科大学珠江医院血液科实验室。
材料：实验于2007-07/10在南方医科大学珠江医院血液科实验室完成。主要试剂：吲哚亚甲基异烟腙(TJU103，MERCK公司)，噻唑蓝(MTT，Sigma公司)，淋巴细胞分离液(中国医学科学院血液学研究所)，胎牛血清(杭州四季青公司)。RPMI 1640 (Gibco公司)，LDH杀伤活性检测试剂盒(Promega公司)，丝裂霉素C(MMC，山东齐鲁制药厂)，FITC标记的鼠抗人CD4单抗(RPA-T4)和PE标记的鼠抗人CD25单抗(M-A251) (美国PharMingen公司)。主要设备和仪器：CO2恒温培养箱；超净工作台；倒置显微镜；流式细胞仪(Coulter公司)；酶标仪(Bio-Tek公司)。
设计、实施、评估：设计为第一、三作者，实施为全部作者，评估为第二、三作者。
方法：
实验细胞：人急性髓系白血病细胞株KG1a由中国医学科学院血液学研究所宋增璇教授惠赠，用含体积分数为0.10胎牛血清的RPMI1640培养基，于37 ℃、体积分数为0.05的CO2、充分湿度的孵箱中培养。实验用细胞均处于对数生长期。
外周血单个核细胞的制备：从广州市中心血站取10份自愿捐献的健康人外周血白细胞，等分成2组，分别作为供者和受者。用梯度密度沉淀法常规分离外周血单个核细胞，调整细胞密度为1×109 L-1备用。
实验分组：对照组、实验组(加TJU103处理组)。
刺激细胞的制备：作为刺激细胞的外周血单个核细胞，加入终浓度为25 mg/L的丝裂霉素C，37 ℃水浴，孵育30 min，用完全培养基洗3次去除残余的丝裂霉素C后，用体积分数为0.10胎牛血清RPMI 1640培养液调整至1× 109 L-1，备用。
单向混合淋巴细胞培养：分别取供者外周血单个核细胞100 μL作为反应细胞，受者正常外周血单个核细胞100 μL作为刺激细胞，接种至3块96孔板中行混合淋巴细胞培养，每实验组设5个复孔，加入TJU103使其终浓度为 25 mg/L[5-6]，另设单独刺激细胞和反应细胞对照以及1640完全培养基空白对照。在37 ℃、体积分数为0.05的CO2条件下孵育，于培养第1，3，

5天检测T淋巴细胞增殖抑制率。检测前6 h每孔加入 5 mg/L的MTT液20 μL，离心培养板，弃上清100 μL，加入等量二甲基亚砜(DMSO)，振荡5 min，酶标仪 492 nm处测吸光度(A)值。T淋巴细胞增殖抑制率(%) = (1－实验组A值/对照组A值)×100 %。
TJU103对供者T细胞细胞毒作用的影响：以丝裂霉素C处理的受者外周血单个核细胞和KG1a细胞为靶细胞，用5%胎牛血清RPMI 1640培养液调整细胞密度为 2×108 L-1，每孔50 μL，加于96孔板中。以单向混合淋巴细胞培养5 d后的细胞为效应细胞，按不同效靶比 (10∶1、20∶1、40∶1)分别加入相应数量的效应细胞各50 μL。效、靶细胞自然释放孔(效应细胞或靶细胞 50 μL，5%胎牛血清RPMI1640液50 μL)，靶细胞最大释放孔加10 μL裂解液，靶细胞、5%胎牛血清RPMI 1640各50 μL，各组均设3个平行孔。置于培养箱中培养4 h，1 000 r/min离心5 min，每孔吸取50 μL上清，转入96孔平底酶标板中，然后加入50 μL 乳酸脱氢酶底物反应液，室温下避光放置30 min，每孔加50 μL反应终止液终止反应，用波长492 nm的酶标仪检测A值。T细胞杀伤活性(%)=(实验组平均A值－靶细胞自然释放组平均A 值－效应细胞自然释放组平均A值)/(靶细胞最大释放组平均A值－靶细胞自然释放组平均A值)×100%。
流式细胞仪检测细胞表型(FACS)：取单向混合淋巴细胞培养72 h后的细胞悬液各200 μL，PBS洗涤2次，计数细胞，分管，每管按1 μg/106细胞浓度加入单抗RPA-T4和M-A251各2 μL双荧光染色，混匀后4 ℃避光孵育30 min，然后洗涤2次，经多聚甲醛固定，用流式细胞仪分析每个样本中1×104个细胞中阳性细胞数，计算荧光标记阳性细胞的百分率。为减少误差，重复实验 3次。
主要观察指标：①TJU103对单向混合淋巴细胞培养中供者T淋巴细胞增殖活性的影响。②TJU103对单向混合淋巴细胞培养后供者T淋巴细胞细胞毒活性的影响。③TJU103对单向混合淋巴细胞培养后供者CD4+CD25+T淋巴细胞的影响。
统计学方法：由第一作者采用SPSS 12.0软件处理实验数据。所有实验数据以_x±s表示，组间比较采用独立样本t检验分析。以P < 0.05为有统计学差异的检验标准。

2 结果

2.1 TJU103对单向混合淋巴细胞培养体系中供者T淋巴细胞增殖活性的影响将25 mg/L的TJU103加入单向混合淋巴细胞培养体系中，分别于培养1、3、5 d检测波长492 nm时的吸光度(A)值，计算淋巴细胞增殖抑制率分别为4.23%、19.43%和31.25%。第1天实验孔和对照孔的A值差异无显著性意义 (P > 0.05)；第3天和第5天实验孔和对照孔的A值差异有显著性意义 (P < 0.05)，见表1。

2.2 TJU103对单向混合淋巴细胞培养后供者T淋巴细胞细胞毒活性的影响观察25 mg/L的TJU103对供者T淋巴细胞细胞毒活性的影响，结果显示：在各效靶比时，单向混合淋巴细胞培养5 d后试验孔供者T细胞杀伤受者外周血单个核细胞的活性明显低于对照孔，二者之间差异有显著性意义(P < 0.05)；二者对KG1a细胞的杀伤活性差异无显著性意义 (P > 0.05)，见表2。

2.3 TJU103对单向混合淋巴细胞培养后供者CD4+CD25+T淋巴细胞的影响流式细胞仪检测单向混合淋巴细胞培养5 d后对照组和实验组供者CD4+CD25+T细胞分别为(4.92±1.03) %和(4.54±0.91) %，二者之间差异无显著性意义 (P > 0.05)。

移植物抗宿主病的发生是供者来源的T细胞识别受者的异体抗原(包括主要组织相容性抗原和次要组织相容性抗原，即MHC和iMHC)，从而被激活后大量增殖，并引发“细胞因子风暴”，通过释放细胞因子和直接杀伤等途径引起受者正常组织免疫损伤的免疫病理过程[7-9]。介导移植物抗宿主病的主要效应细胞是移植物中的供者源T细胞，因此，多采用去除移植物中T细胞和给予免疫抑制剂预防移植物抗宿主病。尽管这些措施降低了重度移植物抗宿主病的发生率，但患者的长期生存率并无改善[10-12]。
近年来的研究表明选择性去除T细胞的某一亚群T细胞如CD4+亚群（Th细胞）或CD8+亚群（Tc细胞），打破CD4+T细胞与CD8+T细胞之间的协同作用，可使移植物抗宿主病的发生率大大降低。CD4+T细胞在引发和放大移植物抗宿主病的过程中发挥重要作用，动物实验和临床实践初步证明，选择性去除CD4+细胞或阻断CD4+细胞活化可以有效降低移植物抗宿主病的发生[13-14]。TJU103是由Van Bergen等[8]通过计算机模拟分析和实验，从15万种有机化合物中筛选出的一种异烟腙类小分子有机化合物。体内外的研究证实[15-17]，TJU103能特异性地与CD4分子的CDR3区结合，阻断CD4和MHC-Ⅱ分子间的相互作用，抑制超抗原诱导CD8+T细胞活化。本实验在前期小鼠体内实验的基础上，进一步在体外模拟异基因造血干细胞移植中供、受者间的单向混合淋巴细胞反应体系，观察TJU103能否诱导移植免疫耐受。本实验结果显示，25 mg/L的TJU103加入MLC体系中，培养1、3、5 d后供者淋巴细胞增殖抑制率分别为4.23%、19.43%和31.25%。第1天实验孔和对照孔的A值之间无显著性差异(P > 0.05)；第3、第5天实验孔和对照孔的A值之间有显著性差异(P < 0.05)。提示TJU103与CD4+T细胞结合可能影响CD4+T细胞激活的早期阶段[18]，并且TJU103对供者T淋巴细胞增殖抑制作用随着时间延长不断增强，至于何时达到平台期，还有待研究。进一步观察TJU103对供者T淋巴细胞细胞毒活性的影响，结果显示：在各效靶比时，MLC 5 d后试验孔供者T细胞杀伤受者外周血单个核细胞的活性明显低于对照孔，二者之间有显著性差异(P < 0.05)；而二者对KG1a细胞的杀伤活性无显著性差异(P > 0.05)。由此可见，TJU103在抑制供者T淋巴细胞增殖和对受者外周血单个核细胞细胞毒活性的同时，并不影响其对白血病细胞的杀伤效果，即在降低移植物抗宿主病的同时不影响GVL效应。另外，流式细胞仪检测表明TJU103诱导移植免疫耐受不是通过促使CD4+CD25+T细胞增殖而起作用的。TJU103降低移植物抗宿主病的同时又保留了移植物抗白血病效应，其机制可能是T细胞仅对在TJU103存在下接触到的抗原无反应，如在移植时受者处于完全缓解期，体内肿瘤抗原微小，则T细胞有可能保留对它的反应性。
目前在动物实验中用于防治移植物抗宿主病的CD4/MHCⅡ阻断剂包括γD-mPGPtide、802-2等，均取得了较为满意的效果[19- 20]。但在临床前实践中用于阻断人类CD4和MHCⅡ类分子间的相互作用时效果并不理想，主要原因是分子量较大、结构不稳定、有一定的抗

原性。TJU103与其他作用于TCR的肽类物质相比，具有合成方便、保存容易、无抗原性等优点。

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