体外诱导大鼠骨髓间充质干细胞分化为胰岛素分泌细胞*★

张伟1，苏本利2，孟秀香1,3，刘奔3，刘丹丹3，王莺燕3，范颖3

相关链接：辽宁省教育厅资助项目：骨髓干细胞诱导分化为胰岛素分泌细胞的实验研究（2004D138；资金：3万元）。课题试图探索一种不应用细胞因子，简单易行的诱导骨髓干细胞分化为胰岛素分泌细胞方法。

创新要点：实验未应用细胞因子而仅通过DMSO和高糖环境对骨髓干细胞进行诱导，国内鲜见报道。实验采用全骨髓细胞进行诱导，并采用双硫腙染色作为检测胰岛细胞的一种方法，这种方法通常用于活体胰岛细胞的检测，而很少用于诱导的胰岛细胞检测，具有一定的创新。

偏倚或不足：目前在诱导骨髓干细胞分化为胰岛素分泌细胞的研究领域中还涉及着许多热点问题，包括骨髓干细胞是否能诱导分化为胰岛细胞，诱导出的胰岛细胞是否具有天然胰岛细胞的各种功能及是否能通过移植骨髓干细胞诱导的胰岛细胞来治疗糖尿病等。

1大连医科大学检验医学院，辽宁省大连市 116044；2大连医科大学附属二院内分泌科，辽宁省大连市 116027；3大连医科大学诊断学实验中心，辽宁省大连市 116044

张伟★，女，1980年生，辽宁省营口市人，汉族，2007年大连医科大学毕业，硕士，主要从事骨髓干细胞诱导与分化研究。

通讯作者：孟秀香，教授，大连医科大学检验医学院，辽宁省大连市116044 xiuxiang_meng@
sina.com

摘要
目的:国内外对骨髓间充质干细胞体外成功诱导分化为胰岛素分泌细胞的报道屡见不鲜，但这些诱导方法都比较繁琐，而且大多都应用了细胞因子。实验拟验证体外非细胞因子方法诱导骨髓间充质干细胞分化为胰岛素分泌细胞的可能性。
方法：实验于2005-11/2007-01在大连医科大学诊断学实验中心，校一级实验室完成。①实验材料：4~6周龄Wistar大鼠由大连医科大学实验动物中心提供，实验过程中对动物处置符合动物伦理学标准。②实验方法：无菌条件下取大鼠的骨髓细胞，并通过贴壁时间差异性去除单核细胞从而获得骨髓干细胞。应用二甲基亚砜及高糖环境依次对大鼠骨髓间充质干细胞进行体外诱导，以直接加入含体积分数为0.10胎牛血清的L-DMEM培养基培养的为对照。③实验评估：通过形态、双硫腙染色、免疫组织化学及RT-PCR方法对诱导后的细胞进行检测，采用ELISA方法对诱导后细胞分泌的胰岛素进行检测。
结果：①培养10 d时，诱导组细胞呈细胞团样改变，内层的细胞为圆形，外层的细胞呈长梭形并包绕着内层细胞。对照组细胞也呈团样改变，但形态不规则，呈发散状，细胞呈梭形类似骨髓间充质细胞。②诱导组的细胞团双硫腙染色后呈明显猩红色，对照组形成的细胞团双硫腙染色不显色。③诱导组成团及单个存在的圆形和梭形细胞中有胰岛素存在，对照组细胞团及未成团细胞中无胰岛素存在。④在内参蛋白GAPDH表达量大致相等的条件下，诱导组诱导的细胞表达Ins1和Ins2，对照组培养的细胞不表达Ins1和Ins2。⑤ELISA法证实诱导后细胞向胞外分泌胰岛素，与对照组比较差异显著（P < 0.05）。
结论：大鼠骨髓间充质干细胞体外经过二甲基亚砜和高糖环境诱导可分化为胰岛素分泌细胞。
关键词：胰岛素分泌细胞；骨髓间充质干细胞；分化；胰岛细胞

张伟，苏本利，孟秀香，刘奔，刘丹丹，王莺燕，范颖.体外诱导大鼠骨髓间充质干细胞分化为胰岛素分泌细胞[J].中国组织工程研究与临床康复，2008，12(16):3053-3056 [www.zglckf.com/zglckf/ejournal/upfiles/08-16/16k-3053(ps).pdf]

中图分类号: R394.2
文献标识码: A
文章编号: 1673-8225
(2008)16-03053-04

In vitro differentiation of rat bone marrow mesenchymal stem cells into insulin-producing cells

AIM:A variety of methods by which bone marrow mesenchymal stem cells (BMSCs) are induced into insulin-producing cells have been reported, and most are very complicated and cytokines are used as the induction factor limiting its clinical application. In this experiment, we tried to explore the possibility of BMSCs in vitro differentiating into insulin-producing cell without cytokine.
METHODS: Experiments were performed at the Experimental Center of Diagnostics, Dalian Medical University from November 2005 to January 2007. ①4-6 weeks Wistar rat were bought from Experimental Animal Center of Dalian Medical University. All procedure was accordant with experiment guideline of animal ethical standards. ②BMSCs were harvested from bone marrow cells of rats by taking out monocytes by difference in adherence. In vitro rat BMSCs were induced by Dimethyl Sulfoxide (DMSO) and high-glucose culture in turns. Cells cultured in L-DMEM medium containing volume fraction of 0.10 fetal bovine serum (FBS) were served as control. ③Differentiated cells were detected by morphological changes, dithizone staining, immunocytochemistry and reverse transcription-polymerase chain reaction (RT-PCR). Insulin excreted from differentiated cells was tested with enzyme-labeled immunosorbernt assay (ELISA).
RESULTS: ①At day 10, there were cells in clusters in the induction group, and inter-layer cells were round, outer-layer cells were long fusiform. There were irregular cell clusters in the control group, and the cells were divergent fusiform. ②Cell masses were scarlet in the induction group after dithizone staining, and non-stained in the control group. ③Insulin was found in the single round and fusiform cells in the induction group, but no insulin was found in the control group. ④With the same expression of glyceraldehydes phosphate dehydrogenase (GAPDH), Ins1 and Ins2 expression were found in the induction group, but no Ins1 and Ins2 were seen in the control group. ⑤ELISA demonstrated that insulin was excreted from differentiated cells and there were significant differences between both groups (P < 0.05).
CONCLUSION: Rat BMSCs can differentiate into insulin-producing cells in vitro by DMSO and high-glucose culture.

Zhang W, Su BL, Meng XX, Liu B, Liu DD, Wang YY, Fan Y.In vitro differentiation of rat bone marrow mesenchymal stem cells into insulin-producing cells.Zhongguo Zuzhi Gongcheng Yanjiu yu Linchuang Kangfu 2008;12(16):3053-3056(China)
[www.zglckf.com/zglckf/ejournal/upfiles/08-16/16k-3053(ps).pdf]

目前的研究表明多种来源的干细胞都可以通过体外诱导分化为胰岛细胞[1-7]，这为胰岛移植提供了新的来源。因骨髓间充质干细胞具有多种分化潜能、取材容易、可以避免免疫排斥反应等优势成为诱导分化为胰岛细胞的最佳候选干细胞。国内外对骨髓间充质干细胞体外成功地诱导分化为胰岛素分泌细胞的报道屡见不鲜[8-13]。但这些诱导方法都比较繁琐，而且大多都应用细胞因子。

设计：以细胞为对象的对照观察实验。
单位：美国弗罗里达大学医学院,韩国大学生物学技术与生命科学学院, 华中科技大学同济医学院附属协和医院普外科, 暨南大学医学院血液病研究所, 中山大学附属第二医院内科内分泌,军事医学科学院输血研究所等。
材料：实验于2005-11/2007-01在大连医科大学诊断学实验中心（校一级实验室）完成。4~6周Wistar大鼠购于大连医科大学实验动物中心，实验过程中对动物处置符合动物伦理学标准。DMEM-低糖培养基, DMEM-高糖培养基，胎牛血清，购自Gibco公司；二甲基亚砜，购自天津市天河化学试剂厂；双硫腙，购自Sigma公司；兔抗鼠胰岛素多克隆抗体，购自北京博奥森生物技术有限公司；过氧化物酶标记的链酶卵白素染色试剂盒，购自北京中山金桥生物技术有限公司；浓缩型DAB试剂盒，购自天津灏洋生物制品科技有限责任公司；TRIzol试剂，购自Invitrogen公司；LAtaq酶、各种引物合成、RT-PCR试剂盒(RNA PCR Kit (AMV)Ver 3.0)、DNA Marker均购自大连宝生物工程公司；大鼠胰岛素ELISA酶联免疫测定试剂盒，购自Mercodia公司。
设计、实施、评估者：实验设计由第二、三作者共同完成，由第一作者实施，在本实验室接受实验培训。
方法：
骨髓细胞的分离及诱导：无菌条件下取4~6周Wistar大鼠胫骨和股骨，用L-DMEM无血清培养基冲出骨髓，并充分吹打成单细胞悬液。将单细胞悬液用L-DMEM无血清培养基洗一遍后用含体积分数为0.10胎牛血清的L-DMEM培养基37 ℃孵育1 h。诱导组：取孵育后的未贴壁细胞去除含血清培养基后加入无血清L-DMEM培养基洗1遍，然后按1× 1010 L-1的密度接种于含1%DMSO的L-DMEM无血清培养基中，37 ℃、体积分数为0.05的CO2条件下置于涂鼠尾胶原的玻片上或铺鼠尾胶原的六孔板中培养3 d。弃去未黏附于鼠尾胶原的细胞，加入含10%胎牛血清的H-DMEM培养基，37 ℃，体积分数为0.05的CO2条件下培养7 d，二三天换液1次。在第10天收集培养上清液，储存于-20 ℃，留作ELISA检测。对照组：孵育后的未贴壁细胞直接加入含体积分数为0.10胎牛血清的L-DMEM培养基，37 ℃、体积分数为0.05的CO2条件下置于涂鼠尾胶原的玻片上或铺鼠尾胶原的六孔板中培养10 d，二三天换液1次。在第10天收集培养上清液，储存于-20 ℃，留作ELISA检测。每天在倒置显微镜下观察诱导细胞在形态上的变化。
双硫腙染色：取50 mg双硫腙粉末溶于 5 mL DMSO中，过滤，分装贮存于-20 ℃。诱导第10 d，按照100∶1（培养基：贮存液）的比例向诱导组及对照组的培养基中加入双硫腙贮存液，置37 ℃孵育15 min，弃去培养基，用PBS洗3次，显微镜下观察细胞的着色情况。
免疫组织化学染色：取出诱导组及对照组培养10 d的细胞爬片，4%多聚甲醛，4 ℃固定 30 min,参照SP-9001 HistostainTM-Plus Kits试剂盒及浓缩型DAB试剂盒的操作方法进行免疫组织化学染色。兔鼠胰岛素抗体稀释倍数为1∶400。RT-PCR：Primer5.0设计引物，Ins1上游引物(F)：5' CAAGTCCCGTCGTGAAGTGG 3'，下游引物(R)：5' CCAGTTGGTAGAGGGAGCAG 3'，扩增长度为161 bp；Ins2上游引物（F）：5' ATCCGCTTCCTGCCCCTGCTG 3'，下游引物(R)：5'TCCCAGTGCCAAGGTCTGAAGG 3'，扩增长度为236 bp ；GAPDH，上游引物(F)：5' GCTGAGTATGTCGTGGAGTC 3'，下游引物(R)：5' CAACCTGGTCCTCAGTGTAG 3', 扩增长度为571 bp。用Trizol试剂分别提取诱导组和对照组的总RNA，参照RT-PCR试剂盒的说明书进行RT-PCR，扩增产物2%琼脂糖凝胶电泳分析。
ELISA检测：收集诱导组及对照组培养 10 d时的培养液上清，以含体积分数为0.10胎

牛血清的L-DMEM培养液作为空白对照，检测胰岛素的含量。
主要观察指标：细胞形态学变化、双硫腙染色、免疫组织化学染色、RT-PCR、ELISA测定结果。
统计学方法:由第一作者采用 SPSS 13.0 进行统计学处理，胰岛素含量用_x±s表示,采用小样本t检验分析。

培养10 d时，诱导组细胞呈细胞团样改变，内层细胞为圆形，外层细胞呈长梭形并包绕着内层细胞。对照组细胞虽然也呈团样改变，但形态不规则，呈发散状，细胞呈梭形类似骨髓间充质细胞。
2.2 细胞双硫腙染色结果见图 2。

诱导组细胞团双硫腙染色后呈明显得猩红色，提示细胞中有锌离子，有胰岛素的合成，而对照组形成的细胞团双硫腙染色不显色。
2.3 细胞免疫组织化学染色见图 3。
在诱导组成团及单个存在的圆形和梭形的细胞中有胰岛素存在。对照组细胞团及未成团细胞中无胰岛素存在。
2.4 细胞RT-PCR检测见图 4。

从图中可以看到在内参蛋白GAPDH表达量大致相等的条件下，诱导组诱导的细胞表达Ins1和Ins2，而对照组培养的细胞不表达Ins1和Ins2。
2.5 ELISA法测定分泌到胞外的胰岛素含量由于培养用的胎牛血清中可能也含有胰岛素，因此用含体积分数为0.10胎牛血清的培养基作为空白对照。诱导组细胞分泌到培养液上清中的胰岛素量为（2.01±0.77）μg/L(n=11),对照组细胞分泌到培养液上清中的胰岛素量为（0.63±0.43）μg/L（n=7）,两者比较差异显著（P < 0.05）。

3 讨论

因骨髓间充质干细胞具有多种分化潜能[14-15]、取材容易、可以避免免疫排斥反应等优点，使其成为诱导分化胰岛细胞的最佳候选干细胞。各国学者都在寻找一种有效的体外诱导骨髓间充质干细胞分化为胰岛细胞的方法。Tang等[16]将骨髓间充质干细胞的单克隆细胞簇置于高糖环境中培养2~4个月后，再用尼克酰胺和Exendin-4促使其分化成熟，结果在6个骨髓间充质干细胞克隆中有4个分化为分泌胰岛素的细胞克隆。这种诱导方法虽然成功的诱导出了胰岛素分泌细胞而且诱导的成功率也较高，但整个诱导过程需要2~4个月，这在实践中很难实现。Choi等[17]从施行胰腺切除术后的大鼠的新生胰腺中获得胰腺提取物，并用其诱导骨髓间充质细胞，得到了分泌胰岛素的分化细胞簇。这种诱导方法虽然获得的胰岛细胞功能较好，但它所需要的新生胰腺提取物很难获取，需进一步研究其中的有效成分才能在实践中得以应用。国内学者一般都选用多种细胞因子联合诱导[18-19]。目前细胞因子的获得主要通过生物工程的方法，造价较为昂贵，因此主要应用于科学研究，很少应用于实践。鉴于上述原因，本实验希望探索一种简单、快速、有效且不应用细胞因子的诱导方法。
本实验通过DMSO和高糖环境对骨髓间充质干细胞进行诱导，国内鲜见报道。国外仅见1篇相关报道[20]，但其方法的细节、检测项目及实验结果均与本实验不同。为了使整个操作简单易行，作者未对骨髓间充质干细胞进行分离而是取全骨髓细胞进行诱导。本实验通过细胞形态、DTZ染色、免疫组织化学、RT-PCR及ELISA的方法对诱导后细胞进行鉴定，同时设立了对照组来排除骨髓细胞在体外自然分化所引起细胞的变化。本实验发现诱导组第7天开始出现细胞团，其形状近似于圆形。细胞团外层上皮样细胞包绕着内层圆形的细胞，在形态上与胰腺的胰岛十分相似。对照组也可以形成细胞团，但其形状不规则，呈星状发散，可能是骨髓间充质干细胞形成的克隆。用双硫腙对诱导组和对照组细胞团进行染色，发现诱导组细胞团呈猩红色而对照组的细胞团不着色，这提示诱导组的细胞团中有胰岛素的合成。为了进一步检测诱导组及对照组细胞在蛋白水平上是否表达胰岛素，对诱导组及对照组细胞进行了免疫组织化学染色。结果表明诱导组除了细胞团中有胰岛素外，在圆形、椭圆形和部分梭形的细胞中也有胰岛素的存在。这提示在细胞未成团时，诱导的骨髓细胞中已经开始合成胰岛素了。对照组的细胞不存在胰岛素。为了检测诱导组及对照组细胞在mRNA水平上是否表达胰岛素，本实验采用RT-PCR的方法进一步检测。结果表明诱导组细胞在mRNA的水平上也表达胰岛素，对照组不表达。胰岛素只有分泌到细胞外才能发挥其生理作用，因此必须进一步检测细胞外的胰岛素量。本实验用ELISA的方法分别检测了诱导组和对照组细胞分泌到培养基中的胰岛素含量，其中诱导组平均为 (2.01±0.77）μg/L，而对照组平均为（0.63±0.43）μg/L，两者有显著差异（P < 0.05）。这说明诱导后的细胞不但合成胰岛素，而且能够向胞外分泌胰岛素。
综上所述，本实验结果表明，DMSO和高糖环境能够诱导骨髓间充质干细胞分化为胰岛素分泌细胞，但诱导率不高。最近Moriscot等[13]将一些调控胰岛发育的基因导入骨髓间充质干细胞中，联合一定的培养条件可以大大地促进胰岛素的表达。在后续的研究将在此诱导方法的基础上向骨髓间充质干细胞中导入一系列胰岛细胞发育的调控基因，希望能使此诱导方法更加完善。

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