茶黄素对兔骨髓基质干细胞向脂肪细胞诱导分化的影响*★

李府，尚希福，谢涛

课题背景：课题为2007~2008度安徽省自然科学基金资助项目，编号070413083，课题名称“茶黄素对激素性股骨头缺血性坏死防治作用的基础研究”，资助基金5万元，单位补贴5万元。于2007年1~5月完成动物实验的一部分，在安徽医科大学学报上发表论文“茶黄素抑制激素性股骨头坏死的实验研究”。

创新要点：文章从细胞学角度探讨茶黄素对兔骨髓基质干细胞向脂肪细胞诱导分化的影响，未就其具体作用机制做更深一步的分析，后续试验将从基因水平观察茶黄素作用后兔骨髓基质干细胞基因表达的变化。

相关链接：茶黄素（Theaflavins，TFs）是一类具有苯骈卓酚酮结构的化合物的总称，由红茶中的多酚类及其衍生物酶促氧化缩合而来，是红茶中发挥生物学作用的主要物质，具有降低体内总胆固醇、三酰甘油和低密度脂蛋白的作用，还可抑制高脂饮食导致的血脂升高、减少食物摄入和脂肪体内的沉积。

李府★，男，1982年生，安徽省萧县人，汉族，安徽医科大学在读硕士，主要从事股骨头坏死方面的研究。
lifufly@yahoo.
com.cn

通讯作者：尚希福，博士，教授，主任医师，硕士生导师，安徽医科大学附属安徽省立医院骨科，安徽省合肥市 230001
shangxifu@163.
com

摘要
目的:茶黄素是红茶中的主要成分，具有调节血脂、抗氧化、抗肿瘤、抗心脑血管疾病等多种药理活性。以往茶黄素对人体内脂肪代谢的影响多数属于宏观分析，实验在细胞水平上探讨茶黄素对兔骨髓基质干细胞向脂肪细胞分化的影响。
方法：实验于2007-05/09在安徽医科大学附属省立医院中心实验室完成。①动物：清洁级4~8周龄家兔10只，由安徽医科大学动物试验中心提供，实验过程中对动物的处置符合动物伦理学标准。②实验方法：兔全身肝素化后麻醉状态下处死，取双侧股骨胫骨和肱骨，去除软组织，切除包括骺板在内的两侧骺端，采用全骨髓法分离培养骨髓基质干细胞，按2×108 L-1密度接种，当细胞生长至80%~90%融合时消化传代。取传至3代的细胞按1×105/cm2密度接种，加入含重组人胰岛素 10 mg/L、地塞米松10-6 mol/L、0.5 mmol/L IBMX的DMEM成脂诱导液培养2周。设立3组：脂肪对照组单纯放入成脂诱导液1 mL；茶黄素组向1 mL成脂诱导液中加入500μg/L茶黄素；空白对照组仅加入等量普通DMEM培养液。③实验评估：取第2代培养细胞绘制生长曲线；油红O染色对诱导的脂肪细胞进行鉴定，计算脂肪细胞转化率。
结果：①细胞生长曲线：骨髓基质干细胞具有旺盛的增殖能力，培养1 d为细胞适应期，3 d后为对数增长期，8 d时进入平台期，之后细胞增殖迅速减慢，细胞数下降。②脂肪细胞油红O染色鉴定结果：脂肪细胞中的脂滴被染成橙红色，胞核为蓝色。脂肪对照组多数骨髓基质干细胞诱导为脂肪细胞，转化率为（64.8±4.8）%，茶黄素组仅为（32.0±3.4）%，空白对照组未见明显脂肪细胞形成。
结论：茶黄素可明显抑制兔骨髓基质干细胞向脂肪细胞方向的分化。
关键词：骨髓基质干细胞；茶黄素；脂肪细胞；诱导分化

李府，尚希福，谢涛.茶黄素对兔骨髓基质干细胞向脂肪细胞诱导分化的影响[J].中国组织工程研究与临床康复，2008，12(16):3061-3064 [www.zglckf.com/zglckf/ejournal/upfiles/08-16/16k-3061(ps).pdf]

中图分类号:R394.2
文献标识码:A
文章编号:1673-8225
(2008)16-03061-04

Effect of theaflavins on the differentiation of rabbit bone marrow mesenchymal stem cells into adipocytes

AIM:Theaflavins are the major constituent of black tea, and have a lot of pharmacological activities, for example, regulating blood fat, anti-oxygen, anti-tumor, resisting cerebrovascular disease, and so on. Previously, theaflavins' effect on human fat metabolism mostly belongs to macro-analysis, but this experiment try to find out the effect of theaflavins on the differentiation of rabbit mesenchymal stem cells (MSCs) into adipocytes in terms of cells.
METHODS: The experiment was completed in the center laboratory of Anhui Provincial Hospital Affiliated to Anhui Medical University from May to September in 2007.①Ten rabbits of cleaning grade and 4-8 weeks old were provided by the animal experiment center of Anhui Medical University. The disposal of animals in process of experiment referred to the ethical standard of animals.②The heparinized rabbits were sacrificed in drugged state, then bilateral femur, tibia and humerus were obtained and their soft tissues were removed, cutting epiphysis of two sides including epiphyseal plate. The MSCs were isolated and cultured with whole bone marrow culture method, inoculated at a density of 2×108 L-1. When the cells grew to the fusion of 80%-90%, digesting and passage culture were performed. Cells of the third generation were collected and inoculated at a density of 1×105/cm2 to be cultured for 2 weeks with DMEM adipocyte-induced liquid, which contained recombinant human insulin 10 mg/L, dexamethasone 10-6 mol/L, and IBMX 0.5 mmol/L. Three groups were set up: adipocytes control group in 1 mL adipocyte-induced liquid; theaflavins group with the 500 μg/L theaflavins in 1 mL adipocyte-induced liquid; blank group in equal amount of ordinary DMEM culture medium.③The cultured cells of the second generation were selected to draw growth curve; oil O staining was used to identify the induced adipocytes and calculate the differentiation efficiency of adipocytes.
RESULTS: ①Cell growth curve: MSCs had vigorous reproductive activity, 1 day of the culture was the cell adaptive phase, 3 days was the increased logarithmic phase, and 8 days was the platform phase. After 8 days, cell proliferation quickly stepped down and cells reduced.②Identification of adipocytes by oil O stain: Lipid droplets in adipocytes were stained into salmon pink, and the nucleus was stained into blue. Most of MSCs in adipocyte control group were induced into adipocytes, the differentiation efficiency was (64.8±4.8)%, while that in theaflavins group was only (32.0±3.4)%. No adipocytes obviously formed in blank control group.
CONCLUSION: Theaflavins can obviously inhibit differentiation from rabbit MSCs to adipocytes.

Li F, Shang XF, Xie T.Effect of theaflavins on the differentiation of rabbit bone marrow mesenchymal stem cells into adipocytes.Zhongguo Zuzhi Gongcheng Yanjiu yu Linchuang Kangfu 2008;12(16):3061-3064
[www.zglckf.com/zglckf/ejournal/upfiles/08-16/16k-3061(ps).pdf]

茶黄素是红茶中的主要成分，对红茶的色香味及品质起着决定性的作用，而且它具有良好的医药保健功能，而表棓儿茶素没食子酸酯是茶黄素分解中间产物[1]。现已发现，茶黄素具有调节血脂、抗氧化、抗肿瘤[2]、抗心脑血管疾病的多种药理活性，以及调节机体免疫、抗菌[3]、抗病毒等多方面的药理作用[4]，并在多种相关疾病防治上具有确切疗效。茶黄素对人体内脂肪代谢的影响，都是从宏观上对人体进行研究，而在细胞水平上的研究报道较少。本试验探讨茶黄素对骨髓基质干细胞向脂肪细胞分化的影响，以为激素性股骨头坏死的治疗提供一种新的方法。

设计：细胞观察实验。
单位：安徽医科大学附属安徽省立医院骨科。
材料：实验于2007-05/09在安徽医科大学附属省立医院中心实验室完成。①动物：清洁级4~8周龄家兔10只（由安徽医科大学动物试验中心提供，动物质量合格证号：SCXK(皖2007-001)），体质量约0.4 g，雌雄不拘，实验过程中对动物的处置符合动物伦理学标准。②主要试剂与仪器：H-DMEM (Hyclone)；胎牛血清(杭州市四季青生物工程有限公司)；磷酸盐缓冲液自行配制；胰蛋白酶(Gibco)；地塞米松(Sigma公司)；重组人胰岛素(Novo Nordisk 公司)；3-异丁基-1-甲基黄嘌呤（IBMX，Sigma公司）；倒置显微镜(Olympus LX270，日本)；超净工作台（美国科学仪器厂）。
设计、实施、评估者：实验设计、干预实施均为第一作者，由第三作者予以协助，结果评估由第二作者完成，均经过系统培训，未使用盲法评估。
方法：
兔骨髓基质干细胞的体外分离培养：家兔全身肝素化后麻醉状态下处死，无菌条件下取双侧股骨胫骨和肱骨，去除软组织，切除包括骺板在内的两侧骺端。用7号针头接5 mL一次性注射器，抽取细胞完全培养液，由髓腔内反复冲洗，将骨髓液收集到无菌培养皿中，用无菌玻璃吸管抽吸吹打骨髓液10次左右，使骨髓液混匀。细胞计数，调整细胞浓度，以2×108 L-1密度接种于25 cm2 培养瓶中，以全骨髓培养法培养，加入含10%胎牛血清、1 00 U/mL青霉素和100 mg/L链霉素的DMEM培养液，在37 ℃、体积分数为0.05的CO2饱和湿度孵育箱内培养。48 h后半量换液，以后每两三天全量换液，每日用倒置显微镜观察细胞生长情况，当细胞生长至80%~90%融合时消化传代。
骨髓基质干细胞的生长曲线测定：取第2代贴壁的骨髓基质干细胞，消化成单细胞悬液后，以1×107 L-1密度接种于24孔塑料板，1 mL/孔，每天取3孔进行胰蛋白酶消化，计数细胞数均值，连续测10 d，以时间为横轴、细胞数为纵轴绘制生长曲线。
骨髓基质干细胞向脂肪细胞方向诱导分化：取传至3代的骨髓基质干细胞，按1×105/cm2密度接种于放置有经严格清洁并高压灭菌处理的盖玻片的6孔板内，制备细胞爬片。成脂诱导液为含重组人胰岛素10 mg/L、地塞米松10-6 mol/L、0.5 mmol/L IBMX的DMEM培养液。设立3组：脂肪对照组，单纯放入成脂诱导液1 mL；茶黄素组，向1 mL成脂诱导液中加入500 μg/L茶黄素；空白对照组，仅加入等量普通DMEM培养液。共诱导培养2周。
特异性脂肪细胞染色鉴定：取细胞爬片用

磷酸盐缓冲液充分洗涤，40 g/L甲醛-钙固定10~15 min，60%异丙醇媒染，油红O染色30 min，体积分数为0.75的乙醇分色，蒸馏水洗，淡苏木精(常用液1∶5稀释)复染核，流水充分漂洗返蓝，甘油明胶封固。100倍光镜下观察拍照，随机记数10个非重复视野内脂肪细胞占总细胞数的比例，实验重复3次。
主要观察指标：①骨髓基质干细胞的培养情况。②骨髓基质干细胞的生长曲线。③骨髓基质干细胞向脂肪细胞方向分化的形态学观察。④脂肪细胞油红O染色鉴定结果。
统计学方法：由第一作者运用SPSS 10.0软件进行方差齐性检验，实验数据以_x±s表示，取α=0.05为显著性检验水准。

2.1 实验动物数量分析实验选取的10只家兔中，有3只因骨髓基质干细胞分离过程中细胞污染而被淘汰，余均获得成功。
2.2 骨髓基质干细胞的培养情况细胞培养第1次半量换液前，培养液中有大量的圆形悬浮细胞漂浮，2 d后半量换液，可见悬浮细胞减少，有少量椭圆形、多边形及短梭形细胞贴壁生长，相互交织成网状，此即为所需的骨髓基质干细胞。培养1周后，有大量的细胞小集落形成，贴壁生长的细胞数量明显增加，细胞生长活跃，胞核及核仁清晰，细胞变长，呈形态均一的长梭形，其排列具有一定的方向性。2周时细胞之间相互融合，几乎铺满整个瓶底，呈旋涡状排列（图1）。

2.3 骨髓基质干细胞的生长曲线绘制生长曲线表明骨髓基质干细胞具有旺盛的增殖能力，培养1 d时细胞数稍有减少，为细胞的适应期；3 d后细胞数迅速增加，为对数增长期；8 d时达到顶点进入平台期；之后细胞增殖迅速减慢，细胞数下降。第2代骨髓基质干细胞生长曲线见图2。

2.4 骨髓基质干细胞向脂肪细胞方向分化的形态学观察脂肪对照组加入成脂诱导液48 h后，倒置显微镜下可观察到细胞胞质内有高折光性的小脂滴出现，主要集中在细胞核周围，随着诱导时间的延长含脂滴细胞逐渐增多，胞内小脂滴逐渐聚集成大的脂滴，细胞体积增大，由原来的长梭形变为圆形或多角形。茶黄素组加入成脂诱导液和茶黄素共培养4 h后未见有脂滴出现，随着培养时间的延长细胞内逐渐有小脂滴出现，但不及脂肪对照组明显。空白对照组始终无明显变化，细胞内没有脂滴出现或极少。
2.5 脂肪细胞油红O染色鉴定结果脂肪细胞中含大小不等的脂肪滴，经油红O染色，脂滴被染成橙红色，胞核为蓝色，见图3。计数结果显示，脂肪对照组多数骨髓基质干细胞诱导为脂肪细胞，转化率为（64.8± 4.8）%，茶黄素组仅为（32.0±3.4）%，空白对照组未见明显脂肪细胞形成。

试验为课题前期进行的初步动物实验，故暂选取常用的家兔来提取骨髓基质干细胞[5]，对其脂肪诱导分化时行茶黄素干预。研究表明兔骨髓基质干细胞经体外分离、诱导培养可定向分化为脂肪细胞[6-7]。本实验在其基础上观察茶黄素对骨髓基质干细胞向脂肪细胞诱导分化过程中的影响。
茶黄素具有降低体内总胆固醇、三酰甘油和低密度脂蛋白的作用[8]，也可抑制高脂饮食导致的血脂升高[9-10]，减少食物摄入和脂肪体内的沉积[11-12]。表棓儿茶素没食子酸酯具有抑制前脂肪细胞向脂肪细胞方向转化和诱导成熟脂肪细胞凋亡的作用[13]。茶黄素对脂肪细胞形成的可能机制包括丝裂原激活的蛋白激酶，特别是胞外信号调节激酶，它通过生长相关的信号而被激活。表棓儿茶素没食子酸酯抑制表皮和肥大细胞系ERK1/2和AKT激酶的磷酸化[14-15]。Hung等[16]的研究表明，表棓儿茶素没食子酸酯减少3T3-L1前脂肪细胞内磷酸化ERK1和磷酸化ERK2的水平，扮演着抑制脂肪细胞ERK信号传导通路的作用，从而抑制脂肪细胞的形成，这可能是本实验茶黄素组脂肪细胞转化生成量变少的根本原因之一。
最近的研究发现，在欧洲常饮茶者可降低髋部骨折的发生率[17-18]，另一项流行病学研究发现绝经后妇女习惯性饮茶者比不饮茶者骨矿物质密度要高[19]，然而茶叶对骨再建的有效成分和作用机制仍不是太清楚。Chen 等[20]的研究结果表明，表棓儿茶素没食子酸酯增加了骨髓基质干细胞向成骨细胞方向的转化，这可以间接说明茶黄素不增加脂肪细胞的形成。随着医学的不断发展和激素在临床的广泛应用，激素所致的股骨头坏死表现出逐渐增多的趋势，现已占非创伤性股骨头坏死的首位。文良元等[21]经研究发现皮质激素的使用能引起机体内脂代谢紊乱、高脂血症等, 继之出现股骨头内细胞的脂肪变、坏死，从而引起股骨头坏死。
骨髓基质干细胞具有多向诱导分化潜能，可以向成骨、软骨、软骨细胞等方向分化，本实验通过用地塞米松、重组人胰岛素及IBMX诱导兔骨髓基质干细胞向脂肪细胞方向分化，并用茶黄素进行共同培养对比。加入500 μg/L茶黄素的脂肪诱导液培养骨髓基质干细胞明显比未加茶黄素的脂肪对照组阳性细胞数少，说明茶黄素具有明显抑制兔骨髓基质干细胞向脂肪细胞方向分化的作用。
结合前人试验的结果，茶黄素具有降低血脂、抑制骨髓基质干细胞向脂肪细胞方向分化并促进其向成骨细胞方向分化的潜能，为激素性股骨头坏死或骨质疏松症等疾病的治疗开辟了新的治疗途径，具有广阔的应用前景。然而茶黄素对骨髓基质干细胞向脂肪细胞分化的具体作用机制仍不太清楚，有待进一步深入分析。

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