课题背景：国家自然科学基金及江西省自然科学基金资助项目。课题名称分别为“骨髓基质细胞促进脑缺血后内源性神经干细胞增殖分化的调控机制”与“骨髓基质细胞促进中风后内源性神经干细胞增殖分化机制”。现阶段研究成果表明，骨髓干细胞能促进神经干细胞的增殖及向神经元的分化，骨髓干细胞移植能促进缺血性脑血管疾病缺血区血管新生,进而促进神经功能的恢复。

相关链接：内皮祖细胞是一种能定向分化为成熟内皮细胞的成体干细胞,具有很高的增殖潜能。内皮祖细胞不仅参与人胚胎血管生成,同时也参与出生后血管新生和机体损伤后的修复过程。因此, 内皮祖细胞为组织缺血性疾病提供了一条新的并且极有临床应用潜力的治疗途径，在血管组织工程、冠状动脉粥样硬化性心脏病、缺血性脑血管疾病、肿瘤、创伤愈合等过程具有广阔的临床应用前景。临床上通过内皮祖细胞移植治疗缺血性疾病已经获得成功,虽然有学者对此提出了"移植是轻率的、冒险的"疑问,但内皮祖细胞的研究正越来越多地受到人们的关注。

同行评价：：骨髓干细胞是重要的成体干细胞，但其成份复杂，其中内皮祖细胞数量稀少，而是否有可能将骨髓干细胞诱导分化为内皮祖细胞是干细胞研究的重要内容之一。本文建立了一种比较简单的体外将贴壁生长的骨髓单个核细胞诱导为内皮祖细胞样细胞的技术方法，结果对同行有一定的参考意义，重复性和稳定性良好，对相关研究甚至临床应用都有较大价值，但需要对所获得的细胞进一步进行功能分析，进一步明确是否是真正意义上的内皮祖细胞。

1南昌大学第二附属医院神经外科， 江西省南昌市 330006；2南昌大学第一附属医院泌尿外科研究所，江西省南昌市 330006

邓志锋☆，男，1963年生，江西省进贤县人，1995年同济医科大学毕业，博士，主任，教授，主任医师，主要从事脑血管疾病与干细胞研究。
dengzf63@
sina.com

通讯作者：汪 泱，南昌大学第一附属医院泌尿外科研究所，江西省南昌市 330006
wangy63cn@
sina.com

国家自然科学基金资助项目（30560
156）*；江西省自然科学基金资助项目(0540087)*

摘要
目的:目前内皮祖细胞主要从骨髓、脐带血和外周血获取，但其分离培养方法尚不成熟，外周血来源因损伤小、易获取而被普遍使用，但得到的内皮祖细胞纯度较低。实验拟探讨大鼠骨髓来源内皮祖细胞体外培养、诱导扩增和生物学特性鉴定方法。
方法：实验于2006-08/2007-08 在南昌大学第一附属医院泌外研究所完成。①实验材料：2周龄SD大鼠由南昌大学医学院动科部提供，雌雄不拘,清洁级，实验过程中对动物处置符合动物伦理学标准。②实验方法：应用梯度离心法采集大鼠骨髓单个核细胞，贴壁筛选法分离内皮祖细胞,置于添加了血管内皮细胞生长因子、人碱性成纤维细胞生长因子、白血病抑制因子、表皮生长因子的M199培养液中扩增培养,对培养2周的细胞采用免疫荧光染色鉴定细胞标志物血管性血友病因子、血管内皮生长因子受体-2、CD34、CD133， 采用RT-PCR法检测内皮细胞特异性分子标志血管性血友病因子、FLK-1、Tie-2、CD34、CD133、eNOS基因表达。
结果：①培养4 d,光电显微镜下可见细胞集落形成,梭形贴壁细胞从集落中央以放射状向外周生长。培养7~10 d,细胞集落相互连接,呈典型的"鹅卵石"样外观。2周左右可见细胞排列成条索状结构并可呈"微血管样"排列生长。②贴壁细胞免疫荧光染色鉴定细胞标志物血管性血友病因子、FLK-1、CD34、CD133阳性，RT-PCR法检测内皮细胞特异性分子标志血管性血友病因子、FLK-1、Tie-2、CD34、CD133、eNOS基因阳性表达。
结论：采用梯度离心法从骨髓中分离单个核细胞，经诱导培养可实现内皮祖细胞的分离培养和体外扩增。
关键词：内皮祖细胞；骨髓源性；体外培养

邓志锋,鲁友明, 汪泱,娄远蕾, 郭菲, 谢安.大鼠骨髓源性血管内皮祖细胞的体外培养与鉴定[J].中国组织工程研究与临床康复，2008，12(16):3069-3073 [www.zglckf.com/zglckf/ejournal/upfiles/08-16/16k-3069(ps).pdf]

中图分类号: R392.2
文献标识码: B
文章编号: 1673-8225
(2008)16-03069-05

收稿日期: 2007- 11-20
修回日期：2007-12-29
(07-50-11-6414/GW·A)

In vitro culture and identification of endothelial progenitor cells from rat bone marrow

Abstract

AIM:Current isolation and culture methods of endothelial progenitor cells (EPCs) from bone marrow, cord blood and peripheral blood are not mature. Peripheral blood is a common source for EPCs but the obtained cell purity is very low. This study investigated methods of isolating, culturing, differentiation and identification of EPCs from rat bone marrow.　
METHODS: The experiment was performed at Research Institute of Urinary Surgery, First Hospital of Nanchang University from August 2006 to August 2007. ①The mononuclear cells were collected from 2-week-old SD rat bone marrow (Nanchang University Medical College, clean grade) by Ficoll density gradient centrifugation. EPCs were isolated with adherence screening method and cultured in M199 culture medium with the supplement of human basic fibroblast growth factor, leukaemia inhibitory factor, and epidermal growth factor. After 2 weeks of culture, immunofluorescence was used to identify cell markers such as von Willebrand disease factor, vascular endothelial growth factor receptor-2, CD34, and CD133; RT-PCR was employed to identify cell specific molecular markers including von Willebrand disease factor, FLK-1, Tie-2, CD34, CD133, and eNOS gene expression.
RESULTS: ①After four days of culture, cell colony was observed using light electron microscopy; adherent cells showed fusiform and radiated from the centre to the outside of the colony. While cultured for 7 days to 10 days, cell colonies were interconnected with the shape of cobblestone. After 2 weeks of culture, cells arranged in strands and capillary vessel network. ②Adherent cells were identified positive for von Willebrand disease factor, FLK-1, CD34, and CD133 by immunofluorescence staining, and positive for von Willebrand disease factor, FLK-1, Tie-2, CD34, CD133, and eNOS gene expression by RT-PCR.
CONCLUSION: EPCs are isolated from bone marrow-derived mononuclear cells, and amplified in vitro.

Deng ZF, Lu YM, Wang Y, Lou YL, Guo F, Xie A.In vitro culture and identification of endothelial progenitor cells from rat bone marrow.Zhongguo Zuzhi Gongcheng Yanjiu yu Linchuang Kangfu 2008;12(16):3069-3073(China)
[www.zglckf.com/zglckf/ejournal/upfiles/08-16/16k-3069(ps).pdf]

0 引言

内皮祖细胞是能直接分化为血管内皮细胞的前体细胞，亦称血管母细胞。胚胎发育时，内皮祖细胞起源于胚外中胚层的卵黄囊血 岛[1]。出生后，内皮祖细胞主要定居于骨髓，外周血中的循环内皮祖细胞来源于骨髓，脐带血内皮祖细胞来源于胎肝。内皮祖细胞不仅在胚胎期参与血管生成,而且在出生后也参与血管新生过程。缺血、损伤和应激等内源性因素以及细胞因子和药物等外源性因素均可刺激骨髓中的内皮祖细胞，使其被动员至体循环中，并在各种趋化因子的作用下，逐步募集在缺血或损伤处分化为成熟的内皮祖细胞, 参与受损部位的血管发生和血管生成[2]。近年来内皮祖细胞在内皮功能受损和缺血性疾病中的治疗作用受到越来越多学者的重视，其基础研究亦备受关注。目前内皮祖细胞主要从骨髓、脐带血和外周血获取[2-4]，但其分离培养方法尚不成熟，外周血来源因损伤小、易获取而被普遍使用，但得到的内皮祖细胞纯度较低。故而，本实验拟从富含内皮祖细胞的骨髓液中分离培养内皮祖细胞，以探讨内皮祖细胞稳定生长及扩增的一种行之有效的分离培养方法，以期为将来内皮祖细胞治疗临床缺血性疾病提供理论基础。

1 材料和方法

设计: 以细胞为对象的开放性实验。
单位:南昌大学第二附属医院神经外科。
材料: 实验于2006-08/2007-08在南昌大学第一附属医院泌外研究所完成。选用2周龄SD大鼠10只，购于南昌大学医学院动科部，雌雄不拘,清洁级，实验前适应性喂养2 d, 自由饮食饮水，实验过程中对动物处置符合动物伦理学标准。主要试剂与仪器: 淋巴细胞分离液(Histopaque21083 ,Sigma 公司) ;M199 培养基, 纤维连接蛋白( Sigma公司); 血管内皮生长因子, 碱性成纤维生长因子(Peprotech 公司);兔抗人CD34抗体(Santa Cruz 公司); 兔抗人FLK-1 抗体(Santa Cruz 公司); 兔抗人vWF抗体(Santa Cruz 公司)、FLK-1 兔抗人CD133 单抗(Santa Cruz 公司); FITC 标记的山羊抗兔IgG( 1∶100, Vector 公司)， Olympus 普通光学显微镜, Nikon 荧光倒置显微镜,
设计、实施、评估者: 实验设计、干预为第一作者, 评估为全体作者, 均经过系统培训。未使用盲法评估。
方法：
内皮祖细胞的分离、诱导、培养：2周龄 SD大鼠肝素化后30 min 断颈处死, 无菌条件下取出四肢长骨,将骨髓细胞以无菌 PBS 液完全冲洗至离心管。收集稀释后的骨髓液，用 Ficoll 液 ( Histopaque21083, Sigma 公司) 以密度梯度离心法2 000 r/min, 20 min离心后管内分为3层,取上、中层界面处以单个核细胞为主的白色云雾层狭窄带置入另一离心管中,以PBS液离心洗涤细胞2次。末次离心后，弃上清,以含 10 %胎牛血清(Gibco公司) 肝素25 U/mL, 谷氨酰胺 2 mmol/L，以及多种促内皮细胞生长的诱导

因子，包括血管内皮细胞生长因子(vascular endothelialcell growth factor，VEGF，Sigma 公司)20 μg/L、人碱性成纤维细胞生长因子(Basic fibroblast growthfactor,bFGF， Peprotech 公司) 10 μg/L、 白血病抑制因子(leukemia inhibitory factor, LIF) 10 μg/L、表皮生长因子(epidermal growth factor, EGF) 10 μg/L，的M199培养液(Sigma 公司) 重悬细胞,并接种于包被人纤维连结素 (Chemicon公司) 的培养皿中, 37 ℃、体积分数为0.05的CO2条件下培养。细胞贴壁4 d后换液 ,弃去上悬液，贴壁细胞换以新的上述培养基培养。细胞均每三四天换液1次 ,每日观察细胞生长形态变化并摄影记录。
免疫荧光染色鉴定细胞标志物：贴壁细胞诱导培养约 2 周后传代,并将适量内皮祖细胞悬液至 24孔板的玻片上进行生长 ,贴壁完全后进行内皮祖细胞标志物血管性血友病因子、FLK-1(也称VEGFR一2或KDR)、CD34、CD133免疫荧光染色。用4%多聚甲醛+ 0.1% Triton X2100固定细胞20 min,0.5% BSA阻断非特异性结合40 min ,分别在不同培养孔中加入vWF一抗、CD34一抗、CD133一抗、FLK-1一抗(均为Santa Cruz公司)（浓度：一抗/PBS液=1∶100）,4 ℃孵育 2 h。PBS 液漂洗后再加入 FITC标记二抗(Vector 公司)（浓度：二抗/PBS液=1∶100）,4 ℃避光孵育1 h。PBS 液漂洗后在荧光显微镜下观察,显示绿色荧光的为阳性细胞。阴性对照时除加一抗用PBS代替外基本步骤同前。
RT-PCR法检测内皮细胞特异性分子标志：贴壁细胞诱导培养约 2 周后, 收集贴壁细胞, Trizol法提取总RNA,以RT-PCR法对内皮祖细胞的血管性血友病因子、FLK-1、Tie-2、CD34、CD133、eNOS 的mRNA表达进行PCR测定。主要步骤：①RNA提取:Trizol RNA抽提试剂常规提取细胞总RNA,经氯仿处理,异丙醇沉淀, 75%乙醇洗涤后,加入30 μL去离子水,测定浓度和RNA质量。②mRNA RT反应:总RNA 2 μg,随机引物3 μL 70 ℃孵育5 min后, 5×reaction buffer 5μL,10 mmol/L dNTP混合物2 μL, 200 U (1 μL)反转录酶,(25 ℃孵育 10 min)42 ℃处理60 min。70 ℃处理10 min,停止反应,放置冰上。③PCR反应:在冰上按下列顺序依次加入:去离子水13.2 μL,10×buffer 215 μL,dNTP混合物 1 μL, MgCl2 (25 mmol/L) 2 μL,上游引物1 μL,下游引物1 μL,内参up1μL,内参down 1μL, cDNA 2 μL,Taq聚合酶0.3 μL(0.2 μL),最终反应体系总体积为25 μL。所用引物见表1，以PCR反应体系均为:预变性94 ℃×5 min、变性94 ℃×45 min、退火57 ℃×45 min、延伸72 ℃×1 min ,扩增至30个循环后,72 ℃×10 min延伸, 4 ℃保存。④琼脂糖凝胶电泳:依次加入混合有标志物的扩增的PCR产物(加入溴酚蓝大约2 μL, PCR产物大约5~10μL),在电压为 100 V的条件下电泳30 min。取出电泳后的凝胶，放于紫外线看有无PCR扩增产物的条带,最后在KodakDigtal成像系统成像。

主要观察指标:PCR检测血管性血友病因子、FLK-1、Tie-2、CD34、CD133、eNOS基因表达及免疫荧光染色检测内皮祖细胞标志物血管性血友病因子、FLK-1、CD34、CD133的表达。

2 结果

2.1 大鼠骨髓源性内皮祖细胞的形态特点 刚分离的PBMC为圆形,体积较小,悬浮于培养液中。培养4 d后,弃去未贴壁细胞，镜下可见贴壁细胞呈梭形或多角形，核呈椭圆形, 部分细胞形成集落,其中心是多角形细胞,四周长梭形细胞呈放射样排列，见图1a;也有部分长梭形细胞首尾相连排列成直线，见图1b。至第10~20 天,群细胞逐渐增多，细胞呈索状排列或呈“鹅卵石”铺路石样排列，偶可见细胞围成“微血管样”结构生长，见图1c、1d。

2.2 免疫荧光染色检测内皮祖细胞标志物 见图2。 经过培养的内皮祖细胞固定后进行免疫荧光染色, 血管性血友病因子、FLK-1(也称VEGFR-2或KDR)、CD34、CD133细胞均呈阳性反应。

2.3 RT-PCR法检测内皮祖细胞特异性分子标志 内皮细胞特异性分子标志血管性血友病因子、FLK-1、Tie-2、CD34、CD133、eNOS mRNA均呈阳性表达，见图3。

3 讨论

内皮祖细胞由 Asahara等[5]于1997年首次在成人外周血中发现,其后的一系列研究又发现骨髓、胎肝、脐血中同样存在内皮祖细胞,而且外周血内皮祖细胞其实来源于骨髓[3-4,6-7]。

研究表明，内皮祖细胞和造血干细胞来源于共同的祖先细胞，两者之间共享许多细胞表面标志，如CD34和VEGFR-2，这两个抗原可被胚胎内皮前体细胞和造血祖细胞共同表达，但亦可在成熟内皮细胞上表达[8]。有研究用荧光标记的VEGFR-2 (鼠的对应抗原称fetal liver kinase-1, FLK-1) 和造血干细胞抗原(CD133)的单克隆抗体行双色流式细胞分析,发现几乎所有的CD34+FLK-1+细胞均表达CD133,体外培养时CD34+FLK-1+CD133+细胞逐渐分化为CD34+FLK-1+CD133-的成熟内皮细胞，故而认为CDl33可能是有别于成熟内皮细胞的表面标志,并且CD34+、FLK-1+、CD133+可代表内皮祖细胞亚群。但最近的研究表明，CD34-造血干细胞和CD34-/VEGFR-2+，CD133+间充质干细胞也可分化成血管内皮祖细胞，继而分化为成熟血管内皮细胞[2]；以CD133-、CD14+细胞或CD177+细胞或CD34+/CD144+细胞均可在体外培养中也具有分化成内皮祖细胞的特性[9-13]。因此，内皮祖细胞的特异性标志尚未有一个明确的规定，一方面内皮祖细胞和造血干细胞都来源于骨髓,含有一些相同的细胞标记,如CD34 ,VEGFR2 和CD133; 另外内皮祖细胞是一个向内皮细胞分化的过渡细胞表型,它与成熟内皮细胞也有共同表达的标记:VEGFR2、Tie1、Tie2、VE cad-herin等。内皮祖细胞表面标记的复杂性和不确定性,使造血干细胞、内皮祖细胞、成熟内皮细胞的分选及鉴定变得困难，但目前倾向于将CD34+、VEGFR2+、CD133+的细胞视为内皮祖细胞。
目前对内皮祖细胞的常用分离方法包括外周血单个核细胞贴壁分离法及包被CD133或CD34单抗的免疫磁珠吸附法[14]。外周血单个核细胞贴壁分离法易于操作，费用低，仪器要求不高，但得到的内皮祖细胞纯度较低，阳性率为（23±4）%，而免疫磁珠吸附法所得内皮祖细胞阳性率为（50±7）%，但费用昂贵、分选难度较大，内皮祖细胞获得量少,满足不了实验研究的需要，不易推广普及[15]。因而需一种兼备两者优点祛其缺点的可靠实用的新的培养方法。
骨髓中含有大量的干细胞和祖细胞 ,相对于外周血和脐血来说 ,其中内皮祖细胞的含量更为丰富 ,且增殖能力更强[16]。而且骨髓细胞具有易于获取和体外扩增 ,属自体来源 ,用于移植治疗无免疫排斥等特点 ,因此作者选择骨髓细胞作为 内皮祖细胞的来源。实验采用了添加有VEGF、EGF、bFGF等各种促内皮细胞生长因子的特殊内皮细胞培养基进行培养扩增,经此法培养后可获得较多数量的内皮祖细胞。实验表明了从骨髓中分离培养内皮祖细胞切实可行，不失为一种操作简便，重复性好的实验方法。
在鉴定内皮祖细胞方面，目前方法有很多，最主要的是通过免疫荧光或流式细胞仪检测内皮祖细胞特异性分子标志等方法[17-20]。本实验主要通过3方面：①内皮祖细胞的形态：典型的内皮祖细胞呈梭形或多角形，核呈椭圆形,群细胞可呈索状排列或呈“鹅卵石”，并可呈“微血管”样结构生长。②免疫荧光染色鉴定细胞标志物如血管性血友病因子、FLK-1(也称VEGFR-2或KDR)、Tie-2、CD34、CD133等均阳性表达。③RT-PCR法检测内皮细胞特异性分子标志，血管性血友病因子、FLK-1、Tie-2、CD34、eNOS、CD133等的基因均呈阳性表达。作者从蛋白水平、基因水平检测内皮祖细胞的特异性分子标志物，与别的方法，如流式细胞仪分析有异曲同工的效果，但操作相对简便，价格低廉，仪器要求不高，能满足一般的实验室的要求。
对于内皮祖细胞的分离培养方法及鉴定方法，本实验方法较其他方法具有简易可操作性及重复稳定性的特点，可以为多数实验室所借鉴，为内皮祖细胞的深入研究奠定基础。

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