课题背景：此项目是本文第一作者博士课题的分支和进一步延续，项目科研成果得到国内相关研究领域知名专家的肯定和一致好评，系列论文已在国内一流核心期刊发表多篇。研究应用中药干预脐血间充质干细胞的体外纯化、扩增并向神经元细胞分化，再进一步移植治疗缺氧缺血性脑损伤是一个崭新的研究领域，具有广阔的前景。相关研究成果的评定正在申报过程中，将为下一步申报国家自然课题基金起到铺垫作用。

相关链接：①种子优势。以往关于研究骨髓间充质干细胞体外扩增和分化的报道已有很多，近年来随着人们发现脐血间充质干细胞作为移植和基因治疗的种子来源具有较多优势后，研究脐血间充质干细胞逐渐成为热门。②诱导剂的不同。以往研究所用诱导剂多为单纯抗氧化剂、细胞因子，本课题筛选的中药黄芩苷具有两者的双重作用，可多途径诱导脐血间充质干细胞纯化、扩增和分化。

同行评价：：本实验通过广泛筛选，发现中药单体黄芩苷在脐血间充质干细胞体外扩增和向神经元细胞定向诱导中效果良好，且其诱导效果明显优于其他单纯的抗氧化剂，可能有另外的机制在起作用。但由于时间仓促、经费限制等因素，课题还未在细胞分子机制或基因水平上就其具体机制做深入分析，仅在理论上推测黄芩苷的诱导机制不仅是其抗氧化作用，可能与其在一定程度上活化NF-κB、激发产生一些细胞因子有关。

南昌大学第一附属医院，1儿科，2血液病学科，江西省南昌市 330006

颜小华☆，男，1966年生，江西省萍乡市人，汉族，2004年中南大学湘雅医学院毕业，博士，副主任医师，副教授，主要从事小儿神经性疾病方面的研究。
yanxiaohua456@
yahoo.com.cn

摘要
目的:体外诱导脐血间充质干细胞定向分化为神经元包括抗氧化剂法及细胞因子法，如何选择一种既能够如细胞因子般可广泛保护神经，又具有较强抗氧化作用的诱导剂？通过广泛筛选，观察中药单体黄芩苷对人脐血间充质干细胞体外纯化、扩增及向神经元样细胞诱导分化的作用。
方法：实验于2005-02/06在南昌大学第一附属医院神经内科实验室完成。①对象及药物：无内外科并发症和传染性疾病、无血液系统疾病、乙肝表面抗原阴性、非高危妊娠、年龄23~35岁的健康孕妇足月顺产儿的脐带血10份，由南昌大学第一附属医院产科提供，孕妇及其家属对治疗及实验均签署知情同意书，实验经医院医学伦理委员会批准。黄芩苷，分子量446，纯度 > 95%，由中南大学湘雅医学院药剂科提供。抗氧化添加剂β-巯基乙醇为SABC公司产品。②实验方法：无菌条件下采集胎儿脐带血，肝素抗凝，用明胶沉降+密度梯度离心两步法分离出脐血单个核细胞，经冷冻保存和复苏后，调整细胞浓度为1×109 L-1，以含20%胎牛血清、谷氨酰胺、B27、粒巨噬细胞集落刺激因子300 μg/L、干细胞因子300 μg/L的DMEM液体培养基进行纯化和扩增。按照抗氧化添加剂的不同分为4组：黄芩苷组加入黄芩苷100 μmol/L；空白对照组不添加抗氧化剂；β-巯基乙醇组添加β-巯基乙醇2 mmol/L；共培养组添加黄芩苷100 μmol/L、β-巯基乙醇2 mmol/L。连续培养4周。③实验评估：观察细胞形态学变化；采用流式细胞仪检测间充质干细胞表面标志；制作细胞爬片，采用免疫细胞化学染色评价神经细胞特异性烯醇化酶、神经微管相关蛋白2、胶质纤维酸性蛋白阳性细胞表达率。
结果：①细胞形态学观察：脐血单个核细胞培养第2~3天开始贴壁生长，2周左右达高峰，3周后细胞生长达80%~90%融合，此时脐血原始间充质干细胞呈较均一的长梭形。4周后，黄芩苷组原来呈梭形的胞体一部分发生收缩，细胞边缘出现细的突起；一部分胞体逐渐近似圆形、锥形、三角形，伪足有多个细长突起，且发出分支，形成圆锥状终末端。β-巯基乙醇组、共培养组细胞虽然也有上述类似形态学的改变，但少量细胞存在脱落、死亡现象，且随着培养时间延长呈逐渐增加的趋势。
②细胞表型检测：扩增培养4周后，空白对照组以CD45阳性细胞为主；其余3组均以CD29和CD83阳性细胞为主，其中共培养组最多，黄芩苷组次之，β-巯基乙醇组最少，组间两两比较差异有显著性意义（P < 0.01）；各组贴壁生长细胞中均未见CD34+阳性细胞。③细胞扩增培养过程中黄芩苷的预诱导效果：扩增培养4周后与黄芩苷组比较，空白对照组、β-巯基乙醇组神经细胞特异性烯醇化酶及神经微管相关蛋白2阳性细胞表达率均显著降低（P < 0.01），共培养组无明显差异 (P > 0.05)。各组胶质纤维酸性蛋白阳性细胞表达率均低于1％。
结论：100 μmol/L黄芩苷可促进脐血间充质干细胞体外扩增，且随抗氧化作用时间的延长效果显著增强，同时在一定程度上还能够诱导其向神经元样细胞方向分化。
关键词：脐血间充质干细胞；黄芩苷；神经元；β-巯基乙醇；预诱导

颜小华，黄瑞滨，陈启文.黄芩苷体外诱导人脐血间充质干细胞向神经元样细胞的分化[J].中国组织工程研究与临床康复，2008，12(16):3074-3078 [www.zglckf.com/zglckf/ejournal/upfiles/08-16/16k-3074(ps).pdf]

中图分类号: R394.2
文献标识码: A
文章编号: 1673-8225
(2008)16-03074-05

收稿日期:2007-09-07
修回日期:2008-02-10
(07-50-9-4666/ZS·Q)

Baicalin induces the differentiation of human umbilical cord blood mesenchymal stem cells into neuron-like cells in vitro

Abstract

AIM:Both the ways of antioxidant agent and cytokines can induce human umbilical cord blood mesenchymal stem cells (MSCs) to differentiate into neuron in vitro. But how to select an inductor, which has the ability of either neuro-protection like cytokines or powerful antioxidation, is a key now. After sieved extensively, this study investigated the effects of baicalin on in vitro purification, amplification and differentiation into neuron-like cells of human umbilical cord blood MSCs.
METHODS: Experiments were performed at the Laboratory of Department of Neurology of First Affiliated Hospital of Nanchang University from February to June 2005. ①Ten samples of cord blood were collected from healthy full-term normal delivery pregnant woman aged 23-35 years, who did not have the histories of complications and infectious disease, hematological system disease, positive hepatitis B virus surface antigen or high-risk pregnancy. The samples were provided by Department of Obstetrics of First Affiliated Hospital of Nanchang University. Informed consents were obtained from pregnant women and their family. The experiment was approved by Hospital’s Medical Ethics Committee. Baicalin (446 molecular weight, >95% purity) was offered by Department of Pharmaceutical Preparation of Xiangya Medical College of Central South University. Beta-mercaptoethanol was bought from SABC. ②Human cord blood was obtained sterilely with preservative-free heparin. Cord blood mononuclear cells were isolated by the two-step assay of gelatin sedimentation plus Ficoll centrifugation separation. After cryopreservation and resuscitation, cells were adjusted to 1×109 L-1 and purified and expanded in DMEM liquid culture medium containing 20% fetal bovine serum, glutamine, B27, granulocyte colony-stimulating 300 μg/L, stem cell factor 300 μg/L. According to the kind of antioxidant, experiments were divided into four groups as follows, a baicalin group (100 μmol/L baicalin), a blank control group, a β-mercaptoethanol group (2 mmol/Lβ-mercaptoethanol) and the co-culture group (100 μmol/L baicalin and 2 mmol/L β-mercaptoethanol). ③After four weeks, MSCs were observed. The surface antigen expression of MSCs was detected by flow cytometry. Four subgroups of MSCs were induced in the media. The expression of neuron specific enolase, microtubule associated protein 2 and glial fibrillary acidic protein was detected by immunocytochemistry.
RESULTS: ①Morphological observation: Cord blood mononuclear cells adhered to the wall 2-3 days after culture, and reached a peak 2 weeks later, formed a confluence of about 80%-90% 3 weeks after culture when the cord blood MSCs were mainly consisted of homogeneous long fusiform. Four weeks later, some fusiform cells in the baicalin group contracted with thin ecphyma, while some were round, cone, triangle, with several slender ecphyma that had branchs on the pseudopodia, forming cone-shape end. Except for above-mentioned appearances, a few cells defoliated and died, which became increased with time prolonged. ②Four weeks after culture, cells were positive for CD45 in the blank control group, while cells in other groups were positive for CD29 and CD83, especially in the co-culture group, followed by baicalin group andβ-mercaptoethanol group. There were significant differences in pairwise comparison (P < 0.01). Otherwise, there were no CD34+ cells appeared in the four groups. ③After culture for 4 weeks, the expression of neuron specific enolase and microtubule associated protein 2 were lower in the blank control group and β-mercaptoethanol group compared to the baicalin group (P < 0.01), and no significant difference was found in the co-culture group (P > 0.05). The percentage of cells expressed glial fibrillary acidic protein was lower than 1% in the four groups.
CONCLUSION: 100 μmol/L baicalin can promote in vitro amplification of cord blood MSCs, which can be greatly reinforced with the increase in antioxidation. Baicalin also can induce the differentiation of cord blood MSCs into neuron-like cells to some degree.

Yan XH, Huang RB, Chen QW.Baicalin induces the differentiation of human umbilical cord blood mesenchymal stem cells into neuron-like cells in vitro.Zhongguo Zuzhi Gongcheng Yanjiu yu Linchuang Kangfu 2008;12(16):3074-3078(China)
[www.zglckf.com/zglckf/ejournal/upfiles/08-16/16k-3074(ps).pdf]

0 引言

脐血间充质干细胞是目前倍受关注的一类具有多向分化潜能的组织干细胞，用其移植治疗缺血性脑损伤的动物实验已取得一定疗效[1-2]。在体外可以分化为神经元细胞等，体外诱导间充质干细胞定向分化为神经细胞有抗氧化剂法及细胞因子法[3-5]。本实验通过广泛筛选，发现中药单体黄芩甙可以作为脐血间充质干细胞诱导剂[6-7]，在脐血单个核细胞的体外培养中，诱导脐血单个核细胞向脐血间充质干细胞扩增和分化，部分还分化为神经元样细胞，这种在扩增过程中预诱导后的脐血间充质干细胞和神经元样细胞，用于静脉移植治疗新生鼠缺氧缺血性脑损伤以修复和替代损伤和死亡的神经细胞，可能具有积极的临床意义。

1 材料和方法

设计：随机对照，细胞观察。
单位：南昌大学第一附属医院儿科、血液科。
材料：实验于2005-02/06在南昌大学第一附属医院神经内科实验室完成。①对象：无内外科并发症和传染性疾病、无血液系统疾病、乙肝表面抗原阴性、非高危妊娠、年龄23~35岁的健康孕妇足月顺产儿的脐带血10份，由南昌大学第一附属医院产科提供，孕妇及其家属对治疗及实验均签署知情同意书，实验经医院医学伦理委员会批准。②主要试剂：黄芩苷，分子量为446，经高效液相色谱-荧光法测定纯度> 95%，由中南大学湘雅医学院药剂科提供；淋巴细胞分离液（Ficoll液），明胶，二甲基亚砜，β-巯基乙醇，DMEM，胎牛血清，干细胞因子，B27，粒巨噬细胞集落刺激因子，鼠抗人单抗，FITC羊抗鼠单克隆抗体（SABC公司）；神经细胞特异性烯醇化酶抗体，神经微管相关蛋白2抗体，胶质纤维酸性蛋白抗体（工作效价1∶1000）。
设计、实施、评估者：实验由第一作者设计，由第一、二作者共同实施和评估，均经过系统培训，未使用盲法评估。
方法：
脐血分离：取采取24 h内的脐血、采用明胶沉降+密度梯度离心两步法[8]分离脐血单个核细胞，首先用Hank’s液将肝素抗凝的脐血等体积稀释，轻轻震荡摇匀后，再等体积加入3％明胶液，充分摇匀后，静置20 min。取数个10 mL无菌带塞试管，先加入比重为1.077/cm3的淋巴细胞分离液4 mL；3％明胶沉降后，无菌吸管吸取上层液体，离液面约1 cm处缓慢滴加，20 ℃、 2 500 r/min 离心20~30 min，吸取中间的白膜层。收集界面层上的细胞，用7~10倍体积的Hank’s液或DMEM培养液、1 000 r/min离心洗涤10 min，两三次，弃上清，所得单个核细胞调整浓度为1×109 L-1接种于传代培养瓶中进行扩增培养。
脐血冷冻保存：制备20%的DMSO右旋糖苷40葡萄糖注射液，作为冷冻保护剂。把分离后的脐血置于冰水浴中，按1∶1（V/V）缓慢加入上述冷冻保护剂中，边加边混匀，加完后，取1 mL×5管放入2 mL冻存管中（检测用），其余装入低温冷冻袋中，置于程控降温仪中，先在4℃平衡5 min，开始以1℃/min的速率降温，至 -50 ℃时按5 ℃/min的速率降温至-100 ℃，取出放入液氮罐中保存。锥虫蓝染色计数细胞拒染率，以检测脐血单个核细胞活性。流式细胞仪测定CD34+及CD29细胞阳性率。
脐血单个核细胞的复苏：冻存后的脐血从液氮罐中取出后，立即投入37~42 ℃水浴中，迅速振荡，1 min内溶化。用7~10倍体积的pH为7.6的磷酸盐缓冲液离心洗涤两三次，弃上清，调整细胞浓度为1×109 L-1接种于传代培养瓶中进行扩增培养。
液体培养体系与细胞培养：DMEM液体培养体系含20%胎牛血清、谷氨酰胺、B27、粒巨噬细胞集落刺激因子300 μg/L、干细胞因子300 μg/L。细胞浓度为 1×109 L-1，上述体系接种于24孔板，1 mL/孔，每组设6个复孔，于37 ℃、体积分数为0.05的CO2饱和湿度孵箱内培养。1周后更换培养基，弃掉未贴壁细胞。以后每 3 d半量换液1次，连续培养4周。每周换液所得的细胞用于计数、检测。细胞生长至80%融合时，用1∶1的 2.5 g/L胰蛋白酶和0.2 g/L EDTA混合液消化，以8.0×103/cm2密度接种于传代培养瓶（T-25）中进行扩增培养。
实验分组：黄芩苷组，在上述液体培养体系中加入黄芩苷100 μmol/L；空白对照组，不添加抗氧化剂；β-巯基乙醇组，添加β-巯基乙醇2 mmol/L；共培养组，添加黄芩苷100 μmol/L、β-巯基乙醇2 mmol/L。
细胞表型流式细胞仪检测：培养第4周的贴壁脐血间充质干细胞，去掉培养液，以0.1 mmol/L磷酸盐缓冲液悬浮，调整细胞浓度为1×109 L-1，并加入0.5 mL离心管中，共6个管，每管100 μL，1号和2号管为阴性对照，不加一抗，加0.1 mmol/L磷酸盐缓冲液 40 μL；其余4管分别加入0.1 mmol/L 磷酸盐缓冲液稀释的一抗（CD29、CD34、CD83、CD45）40 μL，单抗标记浓度为5 mg/L。悬浮细胞置4℃冰箱暗处标记30 min后，磷酸盐缓冲液洗涤2次，各管加入FITC标记的羊抗鼠IgG二抗40 μL/管，二抗标记浓度为5 mg/L，悬浮细胞置4 ℃冰箱暗处标记30 min后，磷酸盐缓冲液洗涤2次，每管细胞悬于0.2 mL磷酸盐缓冲液中，流式细胞仪计数，检测细胞表型。
免疫细胞化学染色：各组分别取扩增培养4周的细胞爬片，去掉培养液后，细胞爬片用磷酸盐缓冲液洗3次，0.4％多聚甲醛固定15 min，磷酸盐缓冲液洗2次，含5％胎牛血清蛋白、0.1％tritonX-100和磷酸盐缓冲液的封闭液封闭60 min（室温）或于4 ℃冰箱过夜，去掉封闭液后，分别加入一抗、微管相关蛋白2单克隆抗体(1∶500)、神经细胞特异性烯醇化酶多克隆抗体 (1∶500)、胶质纤维酸性蛋白单克隆抗体，在37 ℃孵箱内孵育40 min，封闭液洗3次，加入二抗，微管相关蛋白2和胶质纤维酸性蛋白孔加入山羊抗小鼠IgG-cy2（发绿色荧光），神经细胞特异性烯醇化酶孔加入山羊抗兔IgG-cy3（发红色荧光），磷酸盐缓冲液洗3次后，再用去离子水洗1次，加入封片液封固，在荧光显微镜下观察，拍照。阴性对照不加一抗，另一组用未诱导的间充质干细胞爬片直接进行免疫细胞化学染色。
主要观察指标：①脐血单个核细胞的冻存效果。②细胞形态学观察。③细胞表型检测结果。④细胞扩增培养过程中黄芩苷的预诱导效果。
统计学方法：实验数据均以_x±s表示，由第一、二作者采用SPSS 11.5软件包经方差检验后，行单因素方差分析和两两比较，P < 0.05为差异有显著性意义。

2 结果

2.1 脐血单个核细胞的冻存效果 与冻存前比较，冻存后7，14，21，28 d脐血单个核细胞锥虫蓝拒染率均明显降低（P < 0.05），冻存后各时间点差异无显著性意义 （P > 0.05）。流式细胞仪检测结果见表1。

2.2 贴壁生长细胞的形态学观察 脐血单个核细胞培养第2、3天开始贴壁生长，呈小梭型、三角形、圆形等多种形态。继续培养后，大部分逐渐变成大小不等的圆形、椭圆形，小部分为梭形，细胞体积随着培养时间的延长而逐渐增大。随着细胞的迅速增殖，3周后细胞生长达80%~90%融合，此时的脐血原始间充质干细胞呈较均一的长梭形，形态类似于骨髓间充质干细胞，但体积稍小。培养4周后，空白对照组形态无明显变化；黄芩苷组原来呈梭形的脐血间充质干细胞胞体有一部分发生收缩，细胞边缘变得不规整，出现细的突起（图1a）。一部分细胞胞体已逐渐变成近似圆形，部分细胞成锥形或圆形、不规整的锥形、三角形，伪足形成细长突起，有的细胞有多个突起，而且发出分支，形成圆锥状终末端（图1b）；β-巯基乙醇组、共培养组细胞虽然也有上述类似形态上的改变，但可见有少量细胞脱落、死亡，且随着培养时间延长，脱落、死亡细胞有逐渐增加的趋势。

2.3 细胞表型检测结果 脐血单个核细胞培养4周后，空白对照组以CD45阳性细胞为主；其余3组均以CD29和CD83阳性细胞为主，其中共培养组最多，黄芩苷组次之，β-巯基乙醇组最少，三组间两两比较差异有显著性意义（P < 0.01）；各组贴壁生长细胞中均未见CD34+阳性细胞。见表2。

2.4 细胞扩增培养过程中黄芩苷的预诱导效果 扩增培养4周后，空白对照组基本不表达神经细胞特异性烯醇化酶，其余3组有一部分间充质干细胞呈神经细胞特异性烯醇化酶阳性表达，差异有显著性意义（P < 0.01）。空白对照组、β-巯基乙醇组基本不表达神经微管相关蛋白2，黄芩苷组、共培养组神经微管相关蛋白2阳性表达率均明显升高（P < 0.01）。各组胶质纤维酸性蛋白阳性细胞表达率均低于1％。见表3。

3 讨论

骨髓间充质干细胞可以为骨、软骨、肺、脑组织等的修复和重建提供细胞来源[9-10]。脐血间充质干细胞来源于中胚层，在体外却可以扩增并分化为中胚层和神经外胚层来源的组织细胞，如成骨细胞、脂肪细胞和神经细胞等。最近本科室研究发现，用中药单体黄芩苷作为诱导剂，在体外成功诱导脐血间充质干细胞分化为神经元样细胞；从尾静脉移植脐血间充质干细胞透过BBB直接进入缺氧缺血性脑损伤新生鼠脑组织内，发现移植进去的脐血间充质干细胞能够在缺氧缺血性损伤脑组织周围迁移、扩散和有机整合,对新生鼠缺氧缺血性脑损伤具有良好的治疗和保护作用。但单份脐血所含的单个核细胞数量有限，每100 mL脐血所含的干细胞量只能满足体质量不大于30 kg的患儿，成人应用因数量不足而受到限制[11]；且脐血间充质干细胞占单个核细胞的比例很小，仍很有必要寻找一种有效的促细胞扩增药物作为培养液添加剂，来提高脐血间充质干细胞的纯化和扩增效应。目前对脐血间充质干细胞的研究尚处于初级阶段，拟研究中药黄芩苷对脐血间充质干细胞的体外纯化、扩增以及移植前的预诱导分化作用。
本实验采用程序降温法冷冻保存脐血，明胶沉降加密度梯度离心两步法分离脐血单个核细胞，显著减少了单个核细胞损失，使细胞集落形成数明显高于常规分离法；另一方面，两步法所需淋巴细胞分离液可比常规分离法降低一个数量级，可显著降低分离成本，两步法被证明是一种更为有效的分离手段。从锥虫蓝拒染率和流式细胞仪测CD34+细胞结果看，冻存前和冻存后差别显著，但冻存后差别却不显著。说明脐血单个核细胞可长期冻存而不影响移植能力，这为建立脐血库提供了实验依据。
新近有研究发现[12-13]，抗氧化添加剂在培养细胞的增殖和分化中起重要作用。β-巯基乙醇和丁化羟基苯甲醚均为强的抗氧化剂，β-巯基乙醇可使血清中含硫的化合物还原成谷胱甘肽，诱导细胞增殖并避免过氧化物对细胞的损害，从而提高细胞生存能力和增殖能力；有实验表明，在培养神经细胞的无血清培养基中加入适当浓度的β-巯基乙醇（10~50 mmol/L）可以使神经细胞的存活率增加几倍到几百倍，这也与β-巯基乙醇的抗氧化作用有关[14-15]。以往研究表明，黄芩苷能抑制兴奋性氨基酸毒性、清除自由基和抗脂质过氧化等作用[16-17]。新近研究证实黄芩甙能作用于炎症反应的关键环节，抑制炎症反应的枢纽 NF-κB的过度激活，从而抑制脑损伤时大量的细胞因子和黏附分子等炎性递质的表达，具有很强的抗氧化作用，对感染性脑水肿具有保护作用[18-19]。本实验以β-巯基乙醇和黄芩苷为脐血单个核细胞体外扩增培养和预诱导添加剂，动态观察培养4周的脐血单个核细胞扩增效应，也证实了β-巯基乙醇和黄芩苷能提高脐血原始单个核细胞的体外生存和增殖能力。
基于黄芩苷能有效地调节细胞内即刻早期基因NF-κB的活性，结合本实验结果推测，黄芩苷作为一种细胞培养添加剂，其既具有与β-巯基乙醇相似的抗氧化作用，又具有调节即刻早期基因NF-κB继而刺激神经营养因子合成和分泌的作用，可能通过多种机制影响了脐血单个核细胞培养的微环境以及脐血间充质干细胞的纯化和扩增过程，如黄芩苷与细胞的直接接触，分泌营养生长因子形成细胞外基质及分泌多种细胞因子等,对间充质干细胞的增殖与分化起支持作用，直接或间接参与增殖和分化调控。
本实验结果还表明，脐血单个核细胞培养后，有的出现破骨样细胞，有的出现间充质样细胞。破骨样细胞胞体较大，呈圆形，多个核。间充质样细胞即所需间充质干细胞，胞体呈梭形，形态类似于骨髓间充质干细胞，但较骨髓间充质干细胞稍小。脐血间充质干细胞不表达CD34、CD45，强表达CD29，与骨髓间充质干细胞的表面抗原特性一致。脐血单个核细胞经黄芩苷添加培养4周后发现贴壁细胞中以表达CD29阳性细胞数最多，而表达CD83阳性细胞数次之，表达CD45 阳性细胞数最少；上述情况在对照3组表现得更加突出，而对照组则刚好相反，贴壁细胞中以表达CD45阳性细胞为主，而表达CD29 阳性细胞数较少，这表明黄芩苷能够使脐血单个核细胞主要向间充质干细胞而不是向破骨样细胞的方向扩增、成熟和分化，这种作用随着细胞培养添加剂抗氧化作用的增强而显著增强；黄芩苷组脐血间充质干细胞在体外扩增4周后已有一部分表达神经细胞特异性烯醇化酶和神经微管相关蛋白2的阳性细胞出现，这在脐血间充质干细胞促进体外扩增的同时在一定程度上黄芩苷起到了预诱导脐血间充质干细胞向神经元样细胞分化的作用。表明脐血间充质干细胞作为神经细胞分化的前体细胞，与神经细胞一样对氧化损伤同样敏感和脆弱，足以说明抗氧化添加剂黄芩苷和β-巯基乙醇在脐血间充质干细胞体外扩增和分化中起着重要的作用。这为进一步研究黄芩苷促进脐血间充质干细胞体外扩增并预诱导其向神经元细胞分化，进而移植治疗新生儿缺氧缺血性脑损伤提供了理论依据和技术支持，也将为黄芩苷和脐血的临床应用展现出更加广阔的前景。

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