课题背景：2005年高等学校博士学科点专项科研基金资助项目（0631004），资助经费6.0万元，立项题目为“Oct-4基因对原始生殖细胞增殖分化调控作用的研究”。课题组自2000年开始从事胚胎干细胞的研究工作，已成功建立了自流产胎儿、小鼠胚胎生殖嵴分离纯化原始生殖细胞，体外长期培养的实验平台。对Oct-4等关键基因对原始生殖细胞增殖分化的分子调控机制也进行了初步研究。

相关链接：胚胎干细胞是从早期胚胎内细胞团或胚胎原始生殖细胞分离克隆出来的一种具无限增殖能力及多向分化潜能包括种系嵌合能力的细胞系。利用胚胎干细胞进行细胞谱系分化、基因发育功能探讨的发育生物学研究以及胚胎干细胞定向诱导分化的组织工程研究已成为当前干细胞生物学研究的热点，但胚胎干细胞培养条件的优化仍亟待解决。利用基因修饰严格控制胚胎干细胞定向分化和选择、提纯特异性分化细胞是胚胎干细胞走向临床应用的关键。

同行评价：自小鼠胚胎原始生殖细胞分离克隆胚胎干细胞国内报道不多，现有文献的原始生殖细胞大多取材于胚龄11.5 d、12.5 d胎鼠生殖嵴。本文系统地比较了胚龄8.5~12.5 d胎鼠原始生殖细胞的分离培养效率，并进一步比较了与周围组织共培养法和生殖嵴分离培养法两种方法对胚龄11.5 d，12.5 d胎鼠胚胎生殖细胞克隆的影响。

重庆医科大学组胚教研室，重庆市 400016

王 璐☆，女，1974年生，重庆市人，汉族，重庆医科大学在读博士，讲师，主要从事干细胞生物学研究。
wanglu99@sina.
com

通讯作者：王亚平，教授，博士生导师，重庆医科大学组胚教研室，重庆市 400016。
ypwang@public.
cta.cq.cn

2005年高等学校博士学科点专项科研基金资助项目（0631004）*

摘要
目的:应用原始生殖细胞进行全能干细胞的研究具有与胚胎干细胞同样广阔的前景，尤其适合于难以从囊胚内细胞团中分离培养胚胎干细胞的动物。但胚胎生殖细胞体外培养条件一直是制约这方面发展的瓶颈。实验设计了体外有效扩增小鼠原始生殖细胞的方法，拟搭建稳定高效的原始生殖细胞培养平台。
方法：实验于2006-10/2007-08在重庆医科大学组织胚胎学教研室重庆市生物化学分子药理学重点实验室完成。①实验材料：清洁级昆明孕鼠由重庆医科大学动物实验中心提供，见阴栓计为0.5 d胚龄,实验过程中对动物处置符合动物伦理学标准。②实验方法：取胚龄8.5 d胎鼠尾端尿囊及周围组织, 取胚龄9.5~10.5 d胎鼠后肠及周围组织，取胚龄11.5 d，12.5 d胎鼠生殖嵴及周围组织，分别经0.25%胰酶-0.02%EDTA消化并接种于0.1%明胶包被的培养皿中。比较不同妊娠时间点取材对原代、F1代胚胎生殖细胞克隆形成的影响。采用SSEA-1免疫组织化学法计数细胞阳性率，计数胚胎生殖细胞克隆联合MTT法比较胚龄11.5 d，12.5 d两个时间点原始生殖细胞的增殖能力。比较上述两种取材培养方法对胚龄11.5 d，12.5 d原始生殖细胞扩增的影响。采用碱性磷酸酶染色、免疫组化检测SSEA-1、免疫荧光检测Nanog，体外分化实验鉴定分化能力。
结果：①胚龄11.5 d，12.5 d胎鼠原代和F1代集落形成率较胚龄8.5~10.5 d高，扩增效率显著提高(P < 0.01)。②免疫组织化学法检测分离的胚龄11.5 d，12.5 d原始生殖细胞 SSEA-1阳性率差异不显著 (P > 0.05)。原代第3天克隆计数显示，胚龄11.5 d胎鼠高于12.5胚龄胎鼠 (P < 0.01)，MTT数据显示11.5胚龄组稍高于12.5胚龄组。③两种方法对胚龄11.5 d，12.5 d胎鼠胚胎生殖细胞集落形成无显著性差异(P > 0.05)，但生长方式有所不同。④克隆胚胎生殖细胞呈典型的胚胎干细胞样集落生长，能稳定传代；碱性磷酸酶、SSEA-1、Nanog表达强阳性；体外能分化为囊状类胚体。
结论：胚龄11.5 d和12.5 d胎鼠，尤其是胚龄11.5 d胎鼠扩增原始生殖细胞效率较高，在这两个时间点运用与周围组织共培养法和生殖嵴分离培养法均适宜。
关键词：原始生殖细胞；胚胎生殖细胞；扩增；小鼠

王璐，刘永刚，李芳菲，姜蓉，王亚平. 胚龄及分离方法对小鼠胚胎生殖细胞扩增效率的影响[J].中国组织工程研究与临床康复，2008，12(16):3083-3088 [www.zglckf.com/zglckf/ejournal/upfiles/08-16/16k-3083(ps).pdf]

中图分类号: R394.2
文献标识码: A
文章编号: 1673-8225
(2008)16-03083-06

收稿日期：2007-08-02
修回日期：2007-10-29
(07-50-8-4168/GW·Q)

Influences of embryo age and isolation method on amplification efficiency of mouse embryonic germ cells

Abstract

AIM:Studies on totipotential stem cells using primordial germ cells (PGCs) have the same application prospect as embryonic stem cells, especially for the animals difficult to isolate embryonic stem cells from blastula. In vitro culture condition of embryo germ cells is the key to control this. This study designs a method to effectively amplify PGCs of mice in vitro and establishes an effective culture method of PGCs.
METHODS: Experiments were carried out in the Department of Histology and Embryology of Chongqing Medical University and Key Laboratory of Biochemistry and Molecular Pharmacology from October 2006 to August 2007. ①Clean Kunming pregnant mice (embryos 0.5 dpc) were provided by Animal Experimental Center of Chongqing Medical University. Experimental procedures met the animal ethical standards. ②Allantois and surrounding tissues of 8.5 day post coitum (dpc) embryos, the hindhut and surrounding tissues of 9.5 dpc and 10.5 dpc embryos, the gonadal ridges and surrounding tissues of 11.5 dpc and 12.5 dpc embryos were collected and digested with 0.25%pancreatin-0.02%EDTA, then the cells were cultured in the plastic petridishes which are pretreated with 0.1% gelatine. The formation ratio of primary and the first passaged Embryonic germ (EG) clones were compared among those different time points. The SSEA-1 positive ratio of isolated cells was compared between the two days by immunohistochemical method. The assays of clone numbers counting and MTT were used to compare the different proliferation ability of PGCs from the 11.5 dpc and 12.5 dpc embryos. The effects of expanding PGCs from 11.5 dpc and 12.5 dpc embryos by those two ways above were compared. The EG clones were analyzed by the expression of alkaline phosphatase and the immunologic marker SSEA-1，the undifferentiated marker Nanog and the differentiation ability in vitro were also tested.
RESULTS：①The formation ratio of primary and the first passaged EG clone from 11.5 and 12.5 dpc embryos was higher than that from 8.5 to 10.5 dpc embryos and efficiency of expansion was increased (P < 0.01). ②The SSEA-1 positive ratio of isolated PGCs from 11.5 and 12.5 dpc embryonic gonadal ridges had no significant difference by immunohistochemical method (P > 0.05). On the third day, the number of the primary EG clones from 11.5 dpc embryos was higher than that from 12.5 dpc embryos (P < 0.01). MTT showed the same results. ③The EG clones formation ratio of 11.5 dpc and 12.5 dpc embryos by two different ways was similar (P > 0.05), but the two groups had different characteristics. ④The EG clones have representative morphology with high level of alkaline phosphatase activity and SSEA-1, Nanog expression, which can differentiate into the cystic embryoid body.
CONCLUSION: 11.5 dpc and 12.5 dpc mouse embryos, especially 11.5 dpc embryos are the optional time points to expand PGCs efficiently. Co-culturing with the tissue and isolating the gonadal ridges both of these two ways are practicable.

Wang L, Liu YG, Li FF, Jiang R, Wang YP. Influences of embryo age and isolation method on amplification efficiency of mouse embryonic germ cells.Zhongguo Zuzhi Gongcheng Yanjiu yu Linchuang Kangfu 2008;12(16):3083-3088(China)
[www.zglckf.com/zglckf/ejournal/upfiles/08-16/16k-3083(ps).pdf]

0 引言

原始生殖细胞（Primordial Germ Cells, PGCs）是指在进入与体细胞有密切接触的生殖腺成为真正的生殖细胞之前，短暂存在于胚胎的双倍体生殖细胞前体。它具有双重身份：其一，在体内PGCs最终发育为成熟的雌、雄性生殖细胞，毫无疑问它是生殖细胞的前体细胞；其二，PGCs在体外合适的环境下能增殖为胚胎生殖细胞,原始生殖细胞与源于囊胚内细胞团的胚胎干细胞一样具有多向分化潜能，并能形成胚胎嵌合体从而具有发育全能性，因此从某种意义上讲它是一种多能干细胞。
早期生殖系发育机制长期以来是发育生物学中备受关注的课题，对生殖系肿瘤等的诊疗有重要临床指导意义。作为胚胎干细胞，由于单个胚胎中PGCs数量多存在时间长，应用PGCs进行全能干细胞的研究具有与胚胎干细胞同样广阔的前景，尤其适合于难以从囊胚囊胚内细胞团中分离培养胚胎干细胞的动物[1-2]。但原始生殖细胞体外培养条件苛刻一直是制约这两方面发展的瓶颈。本实验探讨不同分离时间、不同分离培养方法对体外扩增小鼠PGCs效率的影响，旨在为进行上述领域的研究建立高效的PGCs体外扩增平台。

1 材料和方法

设计：对照观察实验。
单位：重庆医科大学组织学教研室，重庆市生物化学分子药理学重点实验室。
材料：实验于2006-10/2007-08在重庆医科大学重庆市生物化学分子药理学重点实验室完成。实验动物为清洁级昆明孕鼠, 见阴栓计为胚龄0.5 d，由重庆医科大学动物实验中心提供,实验过程中对动物处置符合动物伦理学标准。主要试剂：knockout DMEM培养基、knockoutTM血清（Gibco），bFGF、SCF、LIF(chemicon)，L-谷氨酸、青链霉素、非必需氨基酸(Hyclone)，β－巯基乙醇（Sigma），丝裂霉素C（Kyowa Hakko Kgyo），抗SSEA-1（Chemicon），抗nanog(abcam), 兔抗羊IgG-FITC、 DAB显色试剂盒（中杉），BCIP/NBT显色试剂盒（博士德）。
设计、实施、评估者：实验设计为第一作者，干预实验为全部作者，由重庆医科大学专家组评估，全部经过系统培训，未使用盲法评估。
方法：
胎鼠成纤维细胞饲养层制备：取3代内对数生长期成纤维细胞，终浓度10 mg/L丝裂霉素C处理3.5 h，D-PBS充分洗涤，消化细胞调整细胞浓度为2×108 L-1，种植在经0.1%明胶包被的四孔培养板中，置37 ℃、体积分数为0.05的CO2培养箱培养待用，用前更换成胚胎干细胞培养基。
与周围组织共培养扩增胚龄8.5~10.5 d胎鼠PGCs：无菌取出胚胎，解剖显微镜下去除四肢，胚龄8.5 d胎鼠取尾端尿囊及其周围组织；胚龄9.5~10.5 d胎鼠打开腹腔取心肝肺胰以下后肠及周围组织；0.25%胰 酶-0.02%EDTA 37 ℃消化3~5 min，等量细胞培养液终止消化，反复吹打，离心洗涤细胞，种植在胚胎干细胞培养体系中。观察原代胚胎生殖细胞克隆形成及传代后（F1）继续形成克隆情况。
与周围组织共培养扩增胚龄11.5 d，12.5 d胎鼠PGCs：解剖显微镜下无菌打开腹腔，用1 mL注射器沿系膜挑去心肝肺胰肠，取生殖嵴及周围组织。0.25%胰酶-0.02%EDTA 37 ℃消化3~5 min，等量细胞培养液终止消化，反复吹打，离心洗涤细胞，计数调整细胞浓度种植在胚胎干细胞培养体系中。观察原代胚胎生殖细胞克隆形成及传代（F1）后继续形成克隆情况。
自胚龄11.5 d，12.5 d胎鼠生殖嵴分离培养PGCs：用1 mL注射器挑取生殖嵴及中间相连肠系膜置于EP管中，0.125%胰酶-0.02%EDTA 37 ℃消化3 min，等量细胞培养液终止消化，轻微吹打，洗涤离心。重复取3只胎鼠实验：①细胞滴片，4%多聚甲醛固定，蒸馏水洗涤，按免疫组化SP法检测SSEA-1（一抗工作浓度为1∶100），设不加一抗的阴性对照组。取来自3次不同批次的滴片，镜下随机选取200个细胞计数阳性率。②调整细胞浓度为1×108L-1种植于24孔板预先铺好的成纤维细胞饲养层上，第3天计数胚胎生殖细胞克隆。③调整细胞浓度为1×104/孔种植于96孔板，复种6孔。于1，2，3，4，5 d MTT490 nm波长下读数。
胚胎生殖细胞传代：待较多体积足够大的胚胎生殖细胞集落出现即传代。0.125%胰酶-0.02%EDTA消化细胞种植于新鲜制备的饲养层上，3~5 d后连续传代。
胚胎生殖细胞鉴定：①碱性磷酸酶染色：培养细胞爬片生长，经4%多聚甲醛固定，蒸馏水洗涤，按试剂盒说明加入BCIP/NBT混和液，37 ℃避光反应30~ 40 min，蒸馏水洗涤终止显色，镜下观察。②SSEA-1检测：挑出典型EG克隆， 4%多聚甲醛固定，按免疫组化SP法检测SSEA-1。③Nanog免疫荧光检测（一抗工作浓度为1∶100，二抗工作浓度为1∶100）。设不加一抗的阴性对照组。④体外分化实验：挑取典型的未分化胚胎生殖细胞集落，消化离散后，接种于经0.1%明胶处理的四孔板或衰老的饲养层上，用撤除细胞因子的培养基培养，镜下观察。
主要观察指标：①采用与周围组织共培养法扩增胚龄8.5~12.5 d PGCs，不同妊娠时间点取材对原代和F1代胚胎生殖细胞克隆形成率的影响。②分离11.5，12.5 胚龄生殖嵴获得PGCs,SSEA-1检测PGCs纯度，并比较不同分离时间点对PGCs增殖克隆的影响。③比较胚龄11.5 d，12.5 d从游离生殖嵴分离PGCs种植在饲养层上以及先与周围组织共培养形成克隆后再传代到饲养层这两种培养方法对PGCs增殖克隆的影响。④扩增胚胎生殖细胞鉴定。
统计学方法：由重庆医科大学统计学教研室协助，采用SPSS 14.0统计软件进行χ2检验和t检验。P < 0.05为差异有显著性意义。

2 结果

2.1 共培养法扩增PGCs妊娠时间对扩增效率的影响 刚分离的PGCs，与体细胞均匀分布，但单个PGCs较体细胞大，核浆比例大。胚龄8.5~9.5 d分离的PGCs较少，胚龄 11.5~12.5 d分离的PGCs较多。12~24 h时后成纤维细胞贴满培养板底，PGCs逐渐在其上边聚集边增殖形成小集落，见图1。不同妊娠时间对胚胎生殖细胞克隆形成的影响见表1，胚龄11.5 d， 12.5 d胎鼠原代和F1代集落形成率较胚龄8.5~10.5 d提高。

2.2 游离生殖嵴分离PGCs妊娠时间对扩增效率的影响 胚龄11.5 d胎鼠腹后壁可见一对长椭圆形隆起的原始生殖嵴，左右对称；胚龄12.5 d胎鼠生殖嵴与中肾嵴已经完全分离，生殖嵴位于中肾嵴内侧，较中肾嵴细而短，见图2，3。免疫组织化学法检测经分离获得的胚龄11.5 d，12.5 d PGCs表达阶段特异性抗原SSEA-1阳性率分别为95%、92%，见图4，无显著性差异（P > 0.05），提示这两个时间点均能分离到高纯度的PGCs。两个时间点培养PGCs原代胚胎生殖细胞形成率均为100%，F1代集落形成率分别为100%、92%。原代第3天克隆计数显示胚龄11.5 d组为150.88±13.63，12.5胚龄组为127.33±9.37，差异有显著性意义（P < 0.01）；MTT数据显示胚龄11.5 d组稍高于胚龄12.5 d组，见图5，提示两个时间点分离到的PGCs增殖状态可能有所不同。
2.3 两种不同方法对胚龄11.5 d、12.5 d PGCs扩增的影响 鉴于与共培养法在胚龄11.5 d和12.5 d这两个时间点均能有效地扩增PGCs，作者进一步通过统计学分析比较了游离生殖嵴分离培养法两种方法对F1代集落形成的影响，结果差异不显著（P > 0.05）。
但在培养过程中发现两种方法对PGCs的生长方式略有差别，其中原因有待进一步研究：游离生殖嵴分离培养法PGCs贴壁更快，克隆生长更同步，大小形态均一为典型的鸟巢状；共培养法胚胎生殖细胞克隆大小不均，大集落多见，形态多样，可呈鸟巢状、条状、山包状，但所有集落与周围细胞边界清楚，见图6~8。共培养法3 d后必须传代，否则未受抑制的贴壁细胞会卷折收缩后浮起。

2.4 胚胎生殖细胞的鉴定 取第5代细胞染色，可见胚胎生殖细胞集落碱性磷酸酶染色强阳性，见图9；胚胎阶段性抗原SSEA-1免疫组织化学SP法检测胚胎生殖细胞内可见棕黄色颗粒，见图10；未分化标志Nanog免疫荧光检测胚胎生殖细胞呈现强绿色荧光，表明实验扩增的胚胎生殖细胞保持高度的未分化状态，见图11；体外分化实验结果显示，胚胎生殖细胞可分化形成囊状类胚体，见图12；12.5 d鼠胚石蜡切片SSEA-1抗原表达见图13。

3 讨论

小鼠原始生殖细胞起源于上胚层，最早在妊娠 7.0 d的原肠胚中检测到，妊娠8.0 d 数目约为100个，位于胚胎原条末端近尿囊蒂处，此时PGCs具旺盛的迁移能力，由尿囊基部沿背肠系膜迁移，最早在妊娠 10.5 d到达生殖嵴，迁移期细胞倍增迅速，到妊娠13.5 d PGCs停止有丝分裂时其数目已达25 000个。Matsui等[3]和Resnick等[4]体外长期培养小鼠PGCs，建立了在形态上和发育上类似于胚胎干细胞的小鼠胚胎干细胞系。此后Stewart等[5]和Labosky等[6]也相继研究表明，PGCs可作为胚胎干细胞的一个替代来源。
尽管有成功建系的报道，但PGCs体外培养增殖困难一直是生殖系发育机制不明、胚胎生殖细胞研究长期滞后于胚胎干细胞的主要原因,更是国内这类研究相对匮乏的重要原因。为此大量的研究致力于PGCs体外培养条件的探讨[7-8]。主要研究进展表明： PGCs体外培养需要饲养层，因为饲养细胞提供了某些必需的生长因子以及其它生长信号， 比如相应的黏附分子等。饲养层的种类优劣比较也一直是科研的热点[9]；LIF、SCF、 bFGF、Forskolin对于PGCs的体外培养至关重要。但除了以上因子，是否还有其它因子的作用？何种因子对PGCs的增殖调控具有决定性作用目前尚无定论[10-20]。PGCs的体外培养体系急待完善。
本实验较为系统地比较了不同时间、不同方法分离PGCs的效率，讨论如下：对于迁移早期（胚龄8.5~10.5 d）的PGCs因在解剖显微镜下无明确形态标志只能与周围组织共分离。虽然理论上讲迁移早期的PGCs 增殖能力更强，但本实验采用共培养法得率很低，考虑因为迁移早期PGCs数量太少，实验室无条件对其进行无菌磁珠或流式细胞仪分选，共培养时其它细胞过量竞争了营养造成PGCs难以扩增；对于迁移晚期(胚龄11.5~12.5 d)的PGCs本实验采用两种不同分离培养方法均能有效地扩增PGCs，但其各有利弊。游离生殖嵴分离得到的PGCs纯度高，预先制备的饲养层对PGCs的黏附力更强，使其在培养体系中能稳定均一地生长，但所需费用昂贵；共培养法在原代培养时无需预先制备饲养层以及添加多种细胞因子，尤其适合于实验过程中饲养层来不及准备的情况。虽然实验数据表明两种方法对F1代集落形成百分率无显著性差异，但共培养法在传代时需挑出集落或通过贴壁的方法先去除成纤维细胞，操作烦琐。本实验在无饲养层、仅添加LIF因子的条件下，采用生殖嵴与其周围组织共培养成功分离克隆到大量胚胎生殖细胞集落，推测可能与下列因素有关：①本课题组通过胚龄12.5 d胎鼠生殖嵴石蜡切片SSEA-1免疫组织化学结果显示，胚龄 12.5 d的生殖嵴周围组织包括生殖嵴和腹后壁以及生殖嵴与中肾嵴连接的间充质中仍存在大量的正在迁移的PGCs，见图13，那么同时分离生殖嵴周围的组织显然提高了PGCs的得率。②生殖嵴周围组织中含有的成纤维细胞能较饲养层中经丝裂霉素C处理过的成纤维细胞分泌更多量的细胞因子，能保证原代PGCs得到更好地增殖。③生殖嵴周围组织模拟了PGCs体内保持增殖且未分化的环境，可能分泌更多种类的细胞因子，因子之间协同作用可发挥更强的生物学效应。在实验中发现即使不添加LIF也能得到典型胚胎生殖细胞集落，但数量少，较添加LIF有显著性差异，这一现象也间接提示生殖嵴周围组织的确分泌了“足量”的保持PGCs增殖且未分化的活性物质。目前有较多实验采用了成纤维细胞以外的其它体细胞作为饲养层细胞，在培养中没有添加任何细胞因子[7,21-22]，联系本实验结果，无疑提出了疑问：PGCs体外培养是否必须添加外源性细胞因子？是否存在较惯用的成纤维细胞更好的饲养层？这些问题需要进一步的探讨；实验表明胚龄11.5 d分离培养PGCs较胚龄12.5 d效率更高，这可能与部分细胞在胚龄12.5d将开始向生殖细胞分化有关，提示胚龄11.5 d可能是分离培养PGCs的最佳时机。
综上所述，本实验为小鼠的胚胎生殖细胞培养体系的完善提供了实验依据，同时建立起来的PGCs体外扩增平台能为深入研究小鼠PGCs发育分化，尤其是有关PGCs发育分化的特异性决定因子的时序调控以及胚胎生殖细胞的增殖分化基因调控等问题提供有利的保障。

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