乳兔脂肪间充质干细胞体外高密微团培养及向软骨细胞的分化*★

王海燕1，耿排力1，吕同德2，哈小琴2，张晓岩1

课题背景：课题属青海省重点科技项目（2005-N-116），基金由青海省科技厅和青海大学附属医院共同资助。目前处于基础实验研究阶段。

相关链接：①在诱导剂的种类上使用了转化生长因子、胰岛素样生长因子、地塞米松、维生素-C联合诱导。②在细胞培养方法上采用了高密度微团培养，通过鉴定成功诱导成软骨细胞，并发现原代的脂肪间充质干细胞微量表达Ⅱ型胶原，这与国内的相关报道不同。

同行评价：目前较多的软骨修复的方法有软骨移植、骨膜移植、软骨下钻孔、制造微骨折等。这些方法虽然有一定的疗效，但新生软骨大部分是纤维软骨，长期效果差。近年来研究者利用脂肪间充质干细胞在体内外成功构建了组织工程软骨，使之成为了软骨组织工程中理想的种子细胞。但组织工程软骨尚存在机械性能弱，植入体内生物支架整合较差，长期退变等问题。随着这些问题的解决，脂肪间充质干细胞构建的组织工程软骨有望应用于临床。

1青海大学医学院基础医学部，青海省西宁市 810001；2 解放军兰州军区总医院医学实验中心，甘肃省兰州市 730000

王海燕★，女，1979年生，青海省西宁市人，汉族，青海大学医学院在读硕士，助教，主要从事组织工程技术的研究。
wanghaiyan0917
@sina.com

通讯作者：耿排力，教授，青海大学医学院基础医学部，青海省西宁市 810001
gampl2003@
yahoo.com.cn

摘要
目的:脂肪间充质干细胞是一类具有多向分化潜能的干细胞，在特定培养条件下可分化为骨、软骨、脂肪、神经、心肌、内皮细胞等。实验拟采用高密度、多种生长因子体外诱导兔脂肪间充质干细胞向软骨细胞分化。
方法: 实验于2007-01/12在解放军兰州军区总医院实验中心完成。①实验材料：7 d龄乳兔6只，雌雄不限，体质量150~ 200 g，由兰州生物制品研究所动物中心提供，实验过程中对动物处置符合动物伦理学标准。②实验方法：分离乳兔脂肪间充质干细胞，体外扩增至第3代，高密度诱导组按Zuk等高密度微团培养法调整细胞密度为1×1010 L-1高密度培养，加入 10 μg/L转化生长因子β1、50 μg/L胰岛素样生长因子、100 μmol/L地塞米松、50 mg/L维生素C诱导成软骨；低密度诱导组按5×108 L-1低密度培养，并加入与高密度诱导组相同的诱导剂诱导培养；高密度常规培养组按1×1010 L-1高密度加入常规培养基培养；对照组按5×108 L-1的密度接加入常规培养基培养。③实验评估：诱导7、14、21 d后观察细胞形态学变化，应用MTT法检测细胞生长曲线，RT-PCR、免疫细胞化学法检测Ⅱ型胶原表达，阿尔新蓝染色检测糖氨多糖的合成。
结果: ①兔脂肪间充质干细胞经诱导后生长速度减慢，由长梭形细胞变为短梭多角细胞，呈铺路石状。常规培养的脂肪间充质干细胞潜伏期为一二天，3 d为对数增殖期，第5天以后进入生长平台期。诱导的脂肪间充质干细胞潜伏期为1~3 d，4 d为对数增殖期，第6天进入平台期。②RT-PCR、免疫细胞化学法检测显示，高密度诱导组诱导14、21 dⅡ型胶原阳性表达, 阿尔新蓝染色见胞浆和细胞基质有棕黄色颗粒。低密度诱导组组诱导14、21 dⅡ型胶原弱阳性表达，阿尔新蓝染色仅少量细胞基质着色。高密度常规培养组和对照组Ⅱ型胶原与阿尔新蓝染色均为阴性。
结论: 高密度培养的脂肪间充质干细胞经多种生长因子诱导可以向软骨细胞分化。
关键词:脂肪间充质干细胞；软骨；分化；组织工程

王海燕，耿排力，吕同德，哈小琴，张晓岩.乳兔脂肪间充质干细胞体外高密微团培养及向软骨细胞的分化[J].中国组织工程研究与临床康复，2008，12(16):3092-3096

中图分类号: R394.2
文献标识码: A
文章编号: 1673-8225
(2008)16-03092-05

Differentiation of rabbit adipose-derived mesenchymal stem cells into chondrocytes induced by high-density culture in vitro

AIM:Adipose-derived mesenchymal stem cells possess the potential of multi-directional differentiation and can differentiate into osteocyte, chondrocyte, adipocyte, neural cells, myocardial cells and endothelial cells. The study investigated rabbit's adipose-derived mesenchymal stem cells differentiating into chondrocytes by high-density and multi-growth factor culture in vitro.
METHODS: Experiments were performed at Experimental Center, Army General Hospital of Lanzhou Military Area Command of Chinese PLA from January to December 2007. ①Six rabbits aged 7 days, of either sex, 150-200 g, were provided by Animal Center of Lanzhou Biological Product Institute. Animal intervention met the animal ethical standards. ②Adipose-derived mesenchymal stem cells were isolated from rabbit's adipose tissue and amplified to the 3rd generation. Adipose-derived mesenchymal stem cells were cultured in a condition of high density (1×1010 L-1) according to the method of Zuk et al induced with transforming growth factor beta 1 (TGF-β1) (10 μg/L), insulin-like growth factor (IGF) (50 μg/L), dexamethasone (100 μmol/L) and Vitamin-C (50 mg/L) in the high-density induction group. Adipose-derived mesenchymal stem cells were cultured in a condition of low density (5×108 L-1) induced with the same inductor as above mentioned in the low-density induction group. Cells in the high-density conventional culture group were cultured in conventional medium at 1×1010 L-1, whereas those in the control group were incubated in conventional medium at 5×108 L-1. ③The morphological changes in the cells were observed at 7, 14, 21 days after induction. Cell growth curve was measured by MTT. The expression of collagen type Ⅱ was detected with RT-PCR and immunocytochemical method. Aggrecan synthesis was detected by alcian blue staining.
RESULTS: ①Adipose-derived mesenchymal stem cells induced by high density culture and multi-growth factors were slowly changed their shape from long spindle cells into short spindle and paving stone-shaped cells. The latent phase of the primary culture cells was 1-2 days, followed by 1 day of logarithmical proliferation; the plateau began at day 5. The latent phase of induced cells was 1-3 days, followed by 1 day of logarithmical proliferation; the plateau began at day 6. ②RT-PCR and immunocytochemical method showed positive expression of collagen type Ⅱ at days 14 and 21 and alcian blue staining showed buffy granula in kytoplasm in the high-density induction group. Weakly positive expression of collagen type Ⅱ was detected at days 14 and 21, and alcian blue staining showed a few buffy granula in kytoplasm in the low-density induction group. collagen type Ⅱand alcian blue staining were negative in the high-density conventional culture group and control group.
CONCLUSION: Adipose-derived mesenchymal stem cells can be differentiated towards chondrocytic phenotype induced by high-density, multi-growth factor culture.

Wang HY, Geng PL, Lü TD, Ha XQ, Zhang XY.Differentiation of rabbit adipose-derived mesenchymal stem cells into chondrocytes induced by high-density culture in vitro.Zhongguo Zuzhi Gongcheng Yanjiu yu Linchuang Kangfu 2008;12(16):3092-3096(China) [www.zglckf.com/zglckf/ejournal/upfiles/08-16/16k-3092(ps).pdf]

目前研究发现脂肪间充质干细胞（Adipose-derived mesenchymal stem cells, ADMSCs）是一类具有多向分化潜能的干细胞，在特定培养条件下可分化为骨、软骨、脂肪、神经、心肌、内皮等细胞。人体脂肪组织十分丰富，用其分离间质干细胞可避免分离胚胎干细胞所带来的道德伦理和获得骨髓间质干细胞的数量少以及给患者带来巨大痛苦等问题。因此，ADMSCs有望成为组织工程中的理想种子细胞。

设计：以细胞为观察对象的对照实验研究。
单位：青海大学医学院基础医学部。
材料：实验于2007-01/12在解放军兰州军区总医院实验中心完成。实验动物为7 d龄乳兔6只，雌雄不限，体质量150~200 g，由兰州生物制品研究所动物中心提供（许可证号为医动字第14-004号），实验过程中对动物处置符合动物伦理学标准。高糖-DMEM（美国，Gibco）、胎牛血清FBS（杭州四季青）、二甲基亚砜DMSO、Ⅰ胶原酶（美国，Sigma）、MTT(Gibco)、TGF-β1（美国，BD）、IGF-1（美国，R&&D）、鼠抗Ⅱ型胶原单抗（德国，Merk）、免疫组化试剂盒（北京中杉金桥）、小鼠抗兔抗体CD29-PE、CD34-PE（美国，BD）、Trizol、cDNA合成试剂盒、PCR扩增试剂盒（美国，BBI）；倒置像差显微镜（日本，OLYPUS）、图像分析软件（日本，Image pro-plus 5.0）。
设计、实施、评估者：设计和实施为全部作者，有较好的病理学理论和技术基础，评估者为未参加实验的实验技术人员进行，盲法评估。
方法：
ADMSCs体外培养：无菌条件下，取乳兔腹股沟、腋下脂肪，剔除结缔组织和血管，剪成1 mm×1 mm大小。预冷的无钙、镁磷酸盐缓冲液（PBS）冲洗2遍；加入4 mL 0.1%的Ⅰ型胶元酶，37 ℃振荡消化60 min。1 700 r/min离心15 min，观察液体分层，有细胞沉淀，弃上层脂肪及上清，PBS洗涤两次。加入含10% 的胎牛血清高糖-DMEM重悬细胞，用200目尼龙细胞筛将未消化的基质过滤去除。调整细胞密度为 2×109 L-1接种于25 cm2培养瓶内，在 37 ℃、体积分数为0.05的CO2的饱和湿度CO2孵箱培养。48 h首次全量换夜，以后隔天换液。细胞至80%~90%融合时，用0.25%的胰酶消化3~ 5 min，随时在倒置显微镜下观察细胞回缩变圆，加适量FBS终止消化，用吸管沿瓶底轻轻吹打， 1 200 r/min离心弃上清，以1∶3比例传代。
ADMSCs诱导成软骨的实验分组：取生长状态好的第3代ADMSCs。高密度诱导组按Zuk等[1]提出的高密度微团培养法调整细胞密度为1010 L-1,20 μL/滴滴入置玻片的24孔培养板，细胞滴间距约1 cm，在CO2孵箱孵育5 h后，缓慢加入诱导培养基（1%FBS、H-DMEM、10 μg/L TGF-β1、50 μg/L IGF、100 μmol/L地塞米松、 50 mg/L维生素C、100 U/mL青霉素、100 U/mL链霉素）。每隔2 d全量更换诱导培养液，诱导7、14、21 d；低密度诱导组按5×108 L-1低密度接种于24孔板，加诱导培养基（同高密度诱导组）；高密度常规培养组按1×1010 L-1高密度接种于24孔板，加入常规培养基（含10%FBS、100 U/mL青霉素、100 U/mL链霉素的H-DMEM）培养；

对照组按5×108 L-1的密度接种于24孔板，加常规培养基。
ADMSCs及诱导后的形态学观察：在倒置显微镜下观察常规培养原代的ADMSCs3，5，7 d，第1，2，3，4，5及15代形态学变化并与诱导后的ADMSCs比较。
表面CD分子的检测：取接近融合的第3代兔脂肪间充质干细胞，用2.5 g/L的胰酶消化后，收集细胞，用pH 7.2的PBS液洗涤2次，离心，将沉淀细胞用100 μl流式缓冲液重悬，分别加入鼠抗兔PE标记的CD29、34抗体，4 ℃避光孵育45~60 min，流式缓冲液洗涤；1%多聚甲醛固定。然后用流式细胞仪(FASC Calibar，BD公司)检测细胞表面CD29，CD34。
MTT法检测细胞生长曲线：常规培养和诱导培养的脂肪间充质细胞以104/孔接种到7块96孔板，复4孔，每天测1板。测时吸出培养基，每孔加20 μL MTT，在孵箱孵育4 h,加150 μL DMSO振荡10 min，酶标仪490 nm检测吸光度值。
Ⅱ型胶原免疫细胞化学染色：分别取各组7、14、21 d培养的细胞爬片各6片，多聚甲醛固定30 min。 PBS 冲洗2遍, 每次1 min。3%H2O2 室温10 min PBS冲洗2次。10% 正常山羊血清封闭30 min。加入鼠抗Ⅱ型胶原单克隆抗体(1∶100) , 4 ℃过夜。PBS冲洗3次，每次3 min。加入生物素标记二抗工作液孵育30 min, PBS 冲洗3次。DAB 显色、苏木精复染后封固, 光镜观察，不加一抗的ADMSCs为空白对照。
阿尔新蓝染色：分别取各组7、14、21 d培养的细胞爬片各6片多聚甲醛固定后，在37 ℃ pH为1的阿尔新蓝染液中微波加热染色45 s，核固红微波加热复染45 s， 0.1 mol盐酸缓冲液冲洗，乙醇脱水、二甲苯透明，封固。
总RNA 提取和RT-PCR：用Primer5.0设计Ⅱ型胶原引物,GeneBank验证，上游引物5'-CCTCAAGGATTTCAAGGCA-3'，下游引物5'-CAGTCCGTCCTCTTTCACC-3'，扩增产物大小为 348 bp。按试剂盒说明书对原代、实验组和对照组ADMSCs进行总RNA提取。PCR条件为94 ℃预变性 5 min,随后 94 ℃变性30 s，53 ℃退火30 s，72 ℃延伸 1 min，32个循环，最后72 ℃延伸7 min。PCR产物用2%琼脂糖凝胶电泳进行鉴定。
主要观察指标：①细胞培养及诱导各阶段的形态变化。②细胞生长曲线的测量。③细胞诱导后基因水平的改变。
统计学方法：数据由第一作者使用SPSS 10.0 统计软件处理, 采用t检验和单因素方差分析。各组数据以均数_x±s表示, P < 0. 05 为有统计学意义。

2.1 ADMSCs的形态学观察原代培养的ADMSCs， 48 h可见多数未贴壁细胞的圆形细胞和少量的梭形细胞或多角细胞,类似成纤维细胞，3 d后纤维样细胞逐渐增多可见核分裂相，约7 d细胞80%~90%融合,细胞呈团簇状生长,形成细胞克隆，大小不一，细胞多为梭形纤维样细胞，见图1。细胞1∶3传代后2~4 h开始贴壁, 两三天增殖加快，5 d即可长满。第3代细胞形态均一。传12代后细胞增殖速度逐渐减慢,细胞集落不明显。15代以后细胞呈现老化现象。诱导14 d后的ADMSCs，细胞呈团簇状生长，形成软骨结节与Zuk[1]报道相同，细胞缩短，三角或多角形，呈铺路石状，见图2。

取3代ADMSCs细胞，流式细胞仪检测PE标记的鼠抗兔CD29、CD34单克隆抗体，CD29表达为（62.13±11.54）%，CD34表达为（2.93±1.29）%。初步鉴定分离培养的细胞为间充质干细胞。
2.3 MTT法检测细胞生长曲线第3代常规和诱导的生长曲线见图4。常规培养的ADMSCs潜伏期一二天，3 d为对数增殖期，第5天以后进入生长平台期。诱导的ADMSCs生长较缓慢，1~3 d为潜伏期，4 d为对数增殖期，第6天进入平台期。对两组细胞的吸光度值进行两样本的t检验分析，有统计学意义（t=3.96，P < 0.05），可以认为常规培养ADMSCs比诱导的ADMSCs生长的快。

2.4 Ⅱ型胶原免疫细胞化学染色及阿尔新蓝染色高密度诱导组诱导7 d的ADMSCsⅡ型胶原免疫细胞化学染色为阴性、阿尔新蓝染色阴性，诱导14、21 dⅡ型胶原阳性表达,可见胞浆和细胞基质有棕黄色颗粒，见图5，6。阿尔新蓝染色胞浆和基质异染表明细胞合成了糖胺多糖（GAG）；低密度诱导组诱导14、21 dⅡ型胶原弱阳性表达，阿尔新蓝染色仅少量细胞基质着色。高密度常规培养组和对照组Ⅱ型胶原与阿尔新蓝染色均为阴性。

2.5 总RNA 提取和RT-PCR检测 RT-PCR表明原代ADMSCs弱表达Ⅱ型胶原，高密度多生长因子诱导ADMSCs7 dⅡ型胶原阴性表达，14、 21 d在348 bp处可见Ⅱ型胶原表达明显增加，见图7。低密度诱导组21 dⅡ型胶原弱阳性表达。常规培养的ADMSCsⅡ型胶原表达阴性。

软骨组织工程技术在修复软骨缺损具有广阔的应用前景。关键是种子细胞的获取、体外扩增及保持软骨生物学特性。自1956年第一例自体软骨细胞移植成功以来，软骨细胞作为组织工程种子细胞的研究已很普遍，但软骨细胞体外传代培养失分化的特点一直困绕着研究者。Brittberg、 Robinson等[2-3]用体外扩增的自体软骨细胞移植修复关节软骨，发现原代软骨细胞多次传代后，细胞表型迅速丢失，并向纤维细胞转化。用低密度软骨细胞进行培养。第3代细胞Ⅱ型胶原、糖氨多糖仅微量表达，Ⅰ型胶原强阳性表达，8%~10%细胞出现碱性磷酸酶活性，有向成骨细胞分化的倾向。
本实验以ADMSCs作为成软骨的细胞来源，是缘由其具有以下优势：①取材简单，可通过抽脂术、手术切取皮下脂肪获得，较非负重区获取软骨和抽取骨髓获得间充质干细胞给患者所带来的精神上的痛苦轻。②是体外生长最快的干细胞[4]，体外培养可大量扩增并建立细胞库。③与骨髓间充质干细胞同来源于中胚层的间充质干细胞，具有多向分化的能力。在特定培养条件下可向骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞、内皮细胞、神经细胞、心肌细胞等分化[5-8]。本实验采用高密度、多种生长因子培养成功将ADMSCs诱导成具有软骨表型的细胞。④具有免疫抑制作用[9]，Djouacl等[10]研究表明间充质干细胞与混合淋巴细胞反应体系中，不论是反应源还是刺激源淋巴细胞的增殖明显受到抑制。为异体移植的可能性提供了理论基础。
间充质干细胞在向软骨分化的过程中受到以下几种因素的影响，①细胞的接种密度。体外间充质干细胞向软骨细胞分化时需要高密度培养，在有生长因子的介质中可复制软骨细胞聚集生长的环境。实验表明糖氨多糖的量与细胞接种密度呈剂量效应关系。Yoo等[11]发现在高密度培养的ADMSCs中含有软骨特征性的Ⅱ型胶原对碘氧基苯甲醚，并先后表达与软骨形成一致的相关基因CNII、CNX。另外在高密度培养状态下类似三维立体培养，更有利于细胞间的信号传导，细胞基质分泌增加。与多种生长因子协同作用可以调节ADMSCs基因、蛋白的表达，但其相互作用的机制非常复杂，还有待进一步探讨。②生长因子的作用。转化生长因子β是最具成效的诱导剂，促进蛋白多糖和型胶原的合成，有助于细胞聚集，是调节细胞增殖和分化的关键因子。胰岛素样生长因子在体外细胞培养体系中，与其他生长因子联合作用起协同放大ADMSCs合成Ⅱ胶原的能力。地塞米松可以激活间充质干细胞上的糖皮质激素受体，促进间充质干细胞向软骨细胞分化，并抑制其向脂肪细胞的分化[12-13]。本实验采用高密度微团培养、多生长因子联合诱导的方法，通过形态学、RT-PCR、细胞化学染色、免疫细胞化学的方法证实，ADMSCs在体外可诱导为软骨细胞。诱导的ADMSCs由成纤维细胞的长梭形变为多角短梭形，细胞密集处呈铺路石状甚至由于基质包裹成圆形，诱导14 d时有软骨结节形成与Zuk报道同。流式细胞法检测第3代细胞表面CD29、CD34分子表达率与Mitchell等[14]的研究一致，说明ADMSCs在传代过程中自然纯化，表现间充质干细胞的特征。原代未诱导的ADMSCs在基因水平上弱表达Ⅱ型胶原，诱导14 d表达增强。ADMSCs随着诱导时间的延长，Ⅱ型胶原免疫细胞化学染色阳性，阿尔新蓝染色异染，说明产生了软骨特征性Ⅱ型胶原和糖氨多糖，具有软骨细胞表型。
近年来国内、外许多研究组织对ADMSCs体外成软骨作了大量的研究工作[15-20]。本实验也初步证实ADMSCs能向软骨细胞分化。ADMSCs具有软骨组织工程种子细胞的特征，故有望进一步应用于基因治疗和临床软骨组织损伤修复。

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