胰高血糖素样肽2对移植小肠结构和功能恢复的作用***★

朱亮1，宫德正1，邹原1，李幼生2，吴云红3，袁博1，关莉莉1，吴琼1，高子淇1，刘立娇1

课题背景：目前小肠移植排斥反应随着排斥免疫和抗排斥药物研究的深入已得到了较大的突破，小肠移植的功能恢复将成为其重点研究方向。胰高血糖素样肽2是新近发现的肠上皮生长因子，与以往发现的生长因子不同，具有肠道特异性促生长作用。

应用要点：实验在小肠移植后应用胰高血糖素样肽2，证实胰高血糖素样肽2有利于移植肠黏膜的再生和修复，进而促进肠功能的恢复，为治疗小肠移植术后移植肠功能低下提供了新的思路和方法。

同行评价；文章针对小肠移植后的功能恢复，应用胰高血糖素样肽2进行实验，结果表明胰高血糖素样肽2对移植小肠肠黏膜功能恢复具有促进作用。选题先进，设计合理，具有一定的临床应用价值。

1大连医科大学生理教研室，辽宁省大连市 116044；2解放军南京军区南京总医院全军普外科研究所，江苏省南京市 210002；3大连医科大学社会科学和管理科学学院，辽宁省大连市 116044

朱亮★，男，1974年生，辽宁省鞍山市人，汉族，2004年南京大学毕业，硕士，讲师，主要从事小肠移植、肝肾移植方面的研究。 zhuliang0210@sina.com

通讯作者：邹原，博士，教授，大连医科大学生理教研室，辽宁省大连市 116044 zhuliang0210@sina.com

辽宁省教育厅课题(2004F088)“胰高血糖素样肽-2(GLP-2)对移植小肠的保护作用及机理研究” *；江苏省医学领军人才课题(200710)“移植小肠慢性失功能的分子生物学基础及干预” *；国家973课题(2003CB515502)“小分子物质对移植物慢性失功的免疫调控机制及干预”*

背景：胰高血糖素样肽2是新近发现的肠上皮生长因子，具有肠道特异性的促生长作用。
目的：实验拟进一步验证胰高血糖素样肽2对小肠原位移植大鼠小肠结构和功能恢复的促进作用。
设计、时间及地点：随机对照动物实验，于2005-08/2006-09在大连医科大学生理教研室完成。
材料：将75只Wistar大鼠按随机数字表法分成3组，小肠移植组30只（供、受体各15只），胰高血糖素样肽2组30只（供、受体各15只），假手术组15只。
方法：小肠移植组及胰高血糖素样肽2组大鼠采用改良的kort法行2步法原位小肠移植；假手术组仅行开关腹手术。胰高血糖素样肽2组小肠移植后给予胰高血糖素样肽2以250 μg/（kg?d）分2次皮下注射，间隔12 h，连续给3 d。
主要观察指标：术后2 周用免疫组化法检测增殖细胞核抗原，并行肠黏膜组织病理学检查；分别于术后2，4，8 周检测移植小肠功能酶（Na+，K+-ATP酶、双糖酶）活性。
结果：①术后2 周胰高血糖素样肽2组肠黏膜绒毛高度、隐窝深度均高于小肠移植组，增殖细胞核抗原表达水平高于小肠移植组。②小肠移植组肠黏膜功能酶活性在术后2周下降明显，术后4周双糖酶活性恢复正常，术后8周Na+，K+-ATP酶活性也接近正常。胰高血糖素样肽2组术后2周时双糖酶活性恢复正常，术后4周时Na+，K+-ATP酶活性恢复正常。
结论：外源性胰高血糖素样肽2能促进原位移植小肠结构和功能的恢复。
关键词：小肠/移植；胰高血糖素；肠吸收；组织移植

朱亮，宫德正，邹原，李幼生，吴云红，袁博，关莉莉，吴琼，高子淇，刘立娇.胰高血糖素样肽2对移植小肠结构和功能恢复的作用[J].中国组织工程研究与临床康复，2008，12(18):3401-3405
[www.zglckf.com/zglckf/ejournal/upfiles/08-18/18/k-3401(ps).pdf]

中图分类号: R617
文献标识码: A
文章编号: 1673-8225
(2008)18-03401-05

Effects of glucagon-like peptide-2 on the recovery of structure and function of small intestinal following orthotopic transplantation

BACKGROUND:Glucagon-like peptide-2 (GLP-2) is a newly found enteric epithelium growth factor and has intestinal tract specific growth promotion effect.
OBJECTIVE: To explore the promotive influence of GLP-2 on the recovery of structure and function of orthotopic intestinal transplantation in rats.
DESIGN, TIME AND SETTING: A randomized control animal experiment was performed at the Department of Pathology, Dalian Medical University from August 2005 to September 2006.
MATERIALS: Totally 75 Wistar rats were randomly divided into 3 groups: an orthotopic intestine transplantation group (15 donors and 15 receptors), a GLP-2 group (15 donors and 15 receptors) and a sham operation group (n=15).
METHODS: Two-step orthotopic intestinal transplantation (OIT) using modified Kort’s method was used in the orthotopic intestine transplantation and GLP-2 groups. Rats in the sham operation group only received open and close abdomen operation. GLP-2 (250 μg/kg) was subcutaneously injected into rats in the GLP-2 group after orthotopic intestine transplantation, twice a day, with an interval of 12 hours, successively for 3 days.
MAIN OUTCOME MEASURES: Two weeks after transplantation, immunohistochemistry was used to measure proliferating cell nuclear antigen. Pathology of intestinal mucosa was performed. Two, four and eight weeks after surgery, intestinal mucosal functional enzyme activity (disaccharides, Na+/K+-ATPase) was detected.
RESULTS: Two weeks after surgery, intestinal mucosal height and recessus depth were higher in the GLP-2 group than in the orthotopic intestine transplantation group. Proliferating cell nuclear antigen expression was higher compared to the orthotopic intestine transplantation group. Intestinal mucosal functional enzyme activity significantly decreased in the orthotopic intestine transplantation group at week after surgery. Activity of disaccharides returned to baseline at 4 weeks and mucosal Na+/K+-ATPase activity returned to baseline at 8 weeks. In the GLP-2 group, disaccharides activity returned to baseline at 2 weeks and mucosal Na+/K+-ATPase activity returned to baseline at 4 weeks.
CONCLUSION: GLP-2 supplementation can promote recovery of structure and function of intestine following orthotopic transplantation.

Zhu L, Gong DZ, Zou Y, Li YS, Wu YH, Yuan B, Guan LL, Wu Q, Gao ZQ, Liu LJ. Effects of glucagon-like peptide-2 on the recovery of structure and function of small intestinal following orthotopic transplantation. Zhongguo Zuzhi Gongcheng Yanjiu yu Linchuang Kangfu 2008;12(18):3401-3405(China)
[www.zglckf.com/zglckf/ejournal/upfiles/08-18/18k-3401(ps).pdf]

小肠移植是治疗不可逆性肠功能衰竭的理想方法[1-2]，但小肠移植的进步仍远落后于肝、肾等其他大器官移植[3-4]，其中移植小肠的结构、功能不能迅速恢复或达不到自体小肠的水平是阻碍小肠移植成功重要原因之一[5-6]。胰高血糖素样肽2是新近发现的肠上皮生长因子，与以往发现的生长因子不同，胰高血糖素样肽2的作用具有肠道特异性，且促生长作用更强[7]。作者前期实验已证明胰高血糖素样肽2可减轻小肠缺血再灌注损伤[8-9]，在已建立的移植模型基础上[10-11]，本实验在小肠移植后应用胰高血糖素样肽2，检测移植后移植小肠的肠黏膜形态学、增殖细胞核抗原及移植小肠功能酶活性变化，分析其对移植小肠结构和功能恢复的促进作用。

设计：随机对照动物实验。
时间及地点：实验于2005-08/2006-09在大连医科大学生理教研室完成。
材料：选用健康成年雄性近交系清洁级Wistar大鼠75只，体质量220~260 g，由中国科学院上海实验动物中心提供（许可证号：SCXK（沪）2007-0005）。实验动物术前经过至少5 d时间适应环境并单独喂养水和食物。对动物处置方法符合动物伦理学要求。
方法：
动物分组及给药方式：将禁食后体质量相近的75只Wistar大鼠按随机数字表法分成3组，小肠移植组30只（供、受体各15只），胰高血糖素样肽2组30只（供、受体各15只），假手术组15只。胰高血糖素样肽2组小肠移植后经胰高血糖素样肽2处理，将胰高血糖素样肽2溶解于无菌的0.01 mol/L磷酸盐缓冲液中（20 mg/L），pH 7.0，按250 μg/（kg?d）分2次皮下注射，间隔12 h，连续给3 d。假手术组和小肠移植组分别给相应体积的0.01 mol/L的磷酸盐缓冲液。
2步法大鼠原位小肠移植模型的方法：采用作者已成功建立的改良的kort法[10-12]2步法大鼠原位小肠移植，即整块获取带肠系膜上动脉的腹主动脉和门静脉的全小肠，血管重建采用供体腹主动脉和受体腹主动脉端侧吻合、供体门静脉和受体左肾静脉端端套管吻合。受体第1步手术时，供肠远端端侧吻合于受体的末端回肠，已结扎的供肠近端固定于右侧腹壁(不做腹壁造口)；7 d后行第2步手术，自Tritze韧带下1 cm到回回肠吻合口上1 cm切除受体小肠，受体空肠残端端侧吻合于供肠近端。假手术组切除左肾，距Tritze韧带3 cm横断空肠后行近远端端侧吻合，距结肠3 cm横断回肠，行近远端端侧吻合。
体质量和血浆白蛋白的检测：术后每日称量体质量，术后2，4，8周进行血清白蛋白检测，用溴甲酚绿比色法测定白蛋白含量（南京建成生物工程研究所提供）。
移植小肠功能酶活性检测：术后2，4，8周取空肠2 cm，用生理盐水冲净肠内容物，沿肠系膜对侧缘纵行剖开肠管，用滤纸拭干肠黏膜表面水分后，刮取肠黏膜，电子分析天平称重、匀浆离心后取上清夜，采用Na+，K+-ATP 酶试剂盒（变异系数为3.4%，灵敏度为合 2.5 mmol/L）测定酶活性，以Dalqvisst[13]法测定肠黏膜乳糖酶、蔗糖酶和麦芽糖酶活性（南京建成生物工程研究所提供）。
细胞增殖核抗原的检测：取常规石蜡包埋的空肠组织切片，用多聚赖氨酸包被，脱蜡、水化后，以磷酸盐缓冲液 (0. 01 mol/ L，pH 7. 4) 冲洗3次，5 min/次。每张切片加入50 μL过氧化物酶阻断剂（体积分数为0.003

的甲醇），室温孵育10 min。磷酸盐缓冲液漂洗3次， 5 min/次。加入50 μL体积分数为0.1的山羊血清，室温孵育10 min 后弃去，加入50 μL 1∶50稀释的增殖细胞核抗原单抗(美国Santa Cruz公司)，同时用羊血清代替一抗作阴性对照，4 ℃孵育过夜。磷酸盐缓冲液漂洗3次，加入50 μL生物素标记的二抗，孵育10 min，磷酸盐缓冲液漂洗 3次。加入50 μL链酶亲和素2辣根过氧化物酶，室温孵育10 min，磷酸盐缓冲液漂洗3次。二氨基联苯胺显色，苏木精复染。漂洗后用中性树胶封固，Olympus显微镜下观察、照像。
肠黏膜组织学观察：用体积分数为0.1的甲醛固定空肠组织，常规脱水，石蜡包埋，沿肠腔纵向切片，苏木精-伊红染色，普通Olympus显微镜下观察、照像。
主要观察指标：小肠移植术后受体大鼠体质量、血浆白蛋白、肠黏膜功能酶、肠黏膜组织学及肠黏膜细胞增殖核抗原变化。
设计、实施、评估者：实验设计、实施、评估均为本文作者，均经过正规培训。
统计学分析：由本文作者采用SPSS 12.0软件进行统计学分析，结果用x(_)±s表示，各组间数据比较采用t检验，P < 0.05为差异有显著性意义。

2.1 实验动物数量分析假手术组及胰高血糖素样肽2组受体大鼠共死亡3只，及时补充，受体死亡原因为动脉吻合口出血、肠瘘。
2.2 小肠移植术后受体大鼠体质量变化见表1。

如表1所示，移植术后胰高血糖素样肽2组和小肠移植组大鼠均出现了显著的体质量下降，术后第3天降至最低点，两组分别下降了9%和16%。随后两组大鼠体质量逐渐恢复，其中胰高血糖素样肽2组于术后第10天时恢复到术前体质量，小肠移植组在术后第17天才接近术前水平，并维持至实验结束。两组大鼠术前体质量差异无显著性意义（P > 0.05），术后第3，10，17，24，31天胰高血糖素样肽2组体质量均高于小肠移植组（P < 0.01）。
2.3 小肠移植术后受体大鼠血浆白蛋白变化见表2。

如表2所示，术后2周胰高血糖素样肽2组与假手术组血浆白蛋白含量差异无显著性意义（P﹥0.05），小肠移植组低于胰高血糖素样肽2组和假手术组（P < 0.01）；术后4周3组无明显差异，但小肠移植组仍低于胰高血糖素样肽2组和假手术组；术后8周3组已非常接近。
2.4 小肠移植术后受体大鼠肠黏膜功能酶变化
2.4.1 Na+，K+-ATP酶活性见表3。

如表3所示，术后2周胰高血糖素样肽2组和小肠移植组Na+，K+-ATP酶活性均低于假手术组（P < 0.01）；术后4周胰高血糖素样肽2组和假手术组差异无显著性意义（P > 0.05），均高于小肠移植组（P < 0.01）；术后8周3组差异无显著性意义（P > 0.05）。
2.4.2 移植肠黏膜双糖酶活性见表4。
如表4所示，术后2周小肠移植组肠黏膜双糖酶活性低于胰高血糖素样肽2组及假手术组（P < 0.01）；术后4，8周时3组差异无显著性意义（P > 0.05）。

2.5 小肠移植术后受体大鼠肠黏膜组织学变化移植前大鼠肠绒毛排列整齐，上层细胞完整，呈柱状，刷状缘清楚。移植成功开放血流后大鼠小肠绒毛顶端上皮细胞坏死脱落，部分上皮损害累及绒毛上半部。术后2周胰高血糖素样肽2组和小肠移植组均恢复正常形态，但胰高血糖素样肽2组绒毛的高度，隐窝深度都显著高于小肠移植组，见图1。

2.6 小肠移植术后受体大鼠肠黏膜细胞增殖核抗原变化术后2周胰高血糖素样肽2组增殖细胞核抗原表达显著强于小肠移植组（×40），局部（白框区域）放大至×100，可见隐窝处胰高血糖素样肽2组增殖细胞核抗原表达显著强于小肠移植组；局部（白框区域）放大至×400，可见隐窝局部胰高血糖素样肽2组增殖细胞核抗原表达的细胞数显著多于小肠移植组，且单个细胞的增殖细胞核抗原表达也显著强于小肠移植组，见图2。

近20年来小肠移植取得了较大进步，但是排斥、感染、保存、再灌注损伤、移植肠取神经、淋巴回流障碍引起的移植肠原发性无功能等妨碍了小肠移植的效果[2-4,6]。随着排斥免疫和抗排斥药物研究的深入，目前移植排斥方面已取得了较大进步。功能恢复是小肠移植的重点研究方向，采取有效手段促进术后移植肠结构和功能的恢复，对于减少术后并发症，提高小肠移植成功率有着十分重要的意义[1,3,5] 。
近年研究发现的促进肠结构和功能恢复的物质主要有谷氨酰胺、1，6-二磷酸果糖、n-3脂肪酸、生长激素、肝细胞生长因子、表皮生长因子等。其中谷氨酰胺、1，6-二磷酸果糖、n-3脂肪酸等是肠黏膜所需的代谢底物，缺乏激素样作用；而生长激素、肝细胞生长因子、表皮生长因子虽是生长类激素，但缺乏器官特异性，可能引起肠道外其他组织细胞的不良反应[14]。胰高血糖素样肽2是新近发现的肠上皮特异性生长因子，是胰高血糖素原基因在肠道内分泌L细胞特异表达翻译后处理加工的产物，与以往的多肽类生长因子不同的是，胰高血糖素样肽2的作用具有肠道特异性[15]。国外有研究认为，胰高血糖素样肽2能促进正常小肠黏膜生长，增强肠道屏障功能，并在动物模型中发现它能促进几种慢性肠病、肠外营养、肠道炎症引起的肠黏膜损伤的修复和愈合[16-20]。国内也有研究报道，胰高血糖素样肽2可以促进短肠大鼠[21]、烧伤大鼠[22]、放射损伤小鼠[23]肠上皮的恢复。另外，研究资料表明胰高血糖素样肽2主要促进肠上皮细胞增殖，对其他重要器官组织如心、肝、肾细胞增殖无影响，长时间应用胰高血糖素样肽2 处理亦未见这些组织发生病理改变。胰高血糖素样肽2的诸多优点使胰高血糖素样肽2的研究已进入临床实验阶段[15,24]。在胰高血糖素样肽2和其他生长因子的比较研究中，Drucker等[25]曾采用皮下注射的方法，比较了胰高血糖素样肽2、表皮生长因子、胰岛素样生长因子1、胰岛素样生长因子2及生长激素对正常肠黏膜的促生长效果，结果以胰高血糖素样肽2的作用最明显。新近的研究表明胰岛素生长因子1等生长因子的促肠生长特性是通过胰高血糖素样肽2实现的[26]。作者的前期实验也证实胰高血糖素样肽2可减轻肠缺血再灌注损伤，其机制可能通过解偶联蛋白2实现[8-9]。
本实验中作者在小肠移植后应用胰高血糖素样肽2，结果证实胰高血糖素样肽2可促进移植小肠结构和功能的恢复。胰高血糖素样肽2可促进移植小肠黏膜生长，肠黏膜绒毛的高度和隐窝的深度明显增加，并可见很多未分化的细胞团。增殖细胞核抗原的免疫组化进一步证实，在胰高血糖素样肽2的作用下移植肠增殖活跃，隐窝和未分化的细胞团内有大量增殖细胞核抗原强阳性的细胞。肠道成熟的标志酶（Na+，K+-ATP酶、双糖酶）活性提前恢复，证明胰高血糖素样肽2不仅促进肠上皮细胞增殖，而且促进其分化。胰高血糖素样肽2组受体白蛋白水平不下降和体质量的迅速恢复也间接证明，移植肠在胰高血糖素样肽2的作用下保持了良好的吸收功能。
总之，肠功能恢复是小肠移植成功的标志，又是该研究领域的难点。本实验证实小肠移植后应用胰高血糖素样肽2，有利于移植肠黏膜的再生和修复，进而促进肠功能的恢复，为小肠移植术后移植肠功能低下的难题解决提供思路和方法。

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