课题背景：小肠移植是短肠综合征的最有效治疗手段，但临床开展难度大、成功率低，主要限制因素在于小肠是人体最大的免疫器官，移植排斥反应发生率高、严重；另外在移植过程中不可避免地要受到缺血再灌注损害，而小肠又对缺血再灌注损伤特别敏感。目前随着新型高效免疫抑制剂的研发和临床应用，小肠移植过程中免疫排斥反应的发生率以及强度已经显著降低。因此如何防止和减轻小肠移植过程中缺血再灌注损伤，是小肠移植基础和临床研究的热点。

应用要点：文章结果表明，丙酮酸作用下大鼠移植小肠缺血再灌注损伤过程中核转录因子κB的活性降低，该结果可能是丙酮酸保护移植小肠缺血再灌注损伤的重要作用途径之一。

同行评价；观察丙酮酸对大鼠移植小肠缺血再灌注损伤中核转录因子的作用，分析丙酮酸对大鼠移植小肠缺血再灌注损伤的保护作用及其途径，课题有一定新意，对进一步深入研究具有重要意义。

1解放军第二三○医院外五科，辽宁省丹东市 118000；2解放军第四军医大学西京医院胃肠外科，陕西省西安市
710032

郝志强★，男，1970年生，辽宁省清原县人，汉族，2005年解放军第四军医大学毕业，硕士，主治医师，主要从事胃肠外科基础及临床研究。 haozq1970@hotmail.com

摘要

目的：研究证实丙酮酸对移植小肠缺血再灌注损伤具有保护作用，并且与其影响细胞因子水平有关。核转录因子在各种细胞外刺激介导的细胞信号转导调控中起核心作用，实验拟观察丙酮酸作用下移植小肠缺血再灌注损伤中核转录因子κB的变化并分析其意义。
方法：①实验于2003-10/2004-04在解放军第四军医大学西京医院胃肠外科实验室完成。选用成年雄性SD大鼠78只，动物处置方法符合动物伦理学标准。②按随机数字表法分为3组：假手术组（n=6）行剖腹、左侧肾切除与移植组对照；移植小肠缺血再灌注组和丙酮酸处理组（n=36）均建立移植小肠缺血再灌注动物模型，丙酮酸处理组于供体小肠阻断血流、灌洗前10 min向肠腔内注入含有分析纯丙酮酸的营养液。③分别于缺血45，90 min和再灌注30，180 min留取移植小肠组织标本（n=6），光镜下观察组织学改变；另外分离、提取核蛋白并定量，通过电泳迁移改变分析实验检测肠组织中的核转录因子κB的活性。
结果：78只大鼠全部进入结果分析。①缺血再灌注不同时相移植小肠缺血再灌注组小肠黏膜组织损伤程度均重于假手术组（P﹤0.01）；而丙酮酸处理组损伤程度轻于移植小肠缺血再灌注组（P﹤0.01），与假手术组差异无显著性意义（P﹥0.05）。②再灌注30 min时移植小肠缺血再灌注组核转录因子κB活性高于其他两组（P﹤0.01）；丙酮酸处理组核转录因子κB活性高于假手术组（P﹤0.05）。再灌注180 min时移植小肠缺血再灌注组核转录因子κB活性略降低，但仍高于其他两组 （P﹤0.01），丙酮酸处理组核转录因子κB活性与假手术组差异无显著性意义（P﹥0.05）。
结论：丙酮酸作用下大鼠移植小肠缺血再灌注损伤过程中核转录因子κB的活性降低，该结果可能是丙酮酸保护移植小肠缺血再灌注损伤的重要作用途径之一。
关键词：小肠/移植；再灌注损伤；丙酮酸；NF-κB；转录因子

郝志强，王为忠，李孟彬，张洪伟.丙酮酸作用下大鼠移植小肠缺血再灌注损伤中核转录因子的变化[J].中国组织工程研究与临床康复，2008，12(18):3406-3409 [www.zglckf.com/zglckf/ejournal/upfiles/08-18/18k-3406(ps).pdf]

中图分类号: R617
文献标识码: A
文章编号: 1673-8225
(2008)18-03406-04

收稿日期:2007-08-03 修回日期:2008-02-13 (087-50-8-4195/G?Q)

Changes in nuclear factor during ischemia/reperfusion injury in rat small intestine transplantation affected by pyruvate

Abstract

AIM: Pyruvate possesses protective effect on ischemia/reperfusion injury of small intestine transplantation, which is correlated with cytokine levels. Nuclear factor (NF) has a crucial effect in signal transduction mediated by various extracellular stimulations. This study aimed to investigate the changes and significances of NF-κB on ischemia/reperfusion injury in rat small bowel transplantation afforded by pyruvate.
METHODS: Experiments were performed at the Laboratory of Department of Gastrointestinal Surgery, Xijing Hospital, Fourth Military Medical University of Chinese PLA from October 2003 to April 2004. Totally 78 adult male SD rats were selected. Animal disposal in the experiment was accorded with the animal ethical standard. All rats were divided into three groups at random. Rats in the sham operation group (n=6) received belly open and nephrectomy on left kidney. Rat models of ischemia/reperfusion were made in the ischemia/reperfusion group and pyruvate treated group (n=36). Blood flow was blocked in donor small intestine and nutrient fluid containing analytical pure pyruvate was injected into the enteric cavity 10 minutes before lavation. Samples of intestinal tissues (n=6) were obtained 45 and 90 minutes after ischemia and 30 and 180 minutes after reperfusion. Changes in histology were observed under light microscope. Nucleoprotein was isolated, extracted and quantitated. Activity of NF-κB in intestinal tissues was analyzed by electrophoretic mobility shift assay (EMSA).
RESULTS: Totally 78 rats were included in the final analysis. Intestinal tissues injury was severe in the ischemia/reperfusion group compared to the sham operation group at different time points (P﹤0.01). Injury degree was mild in the pyruvate treated group compared to the ischemia/reperfusion group (P﹤0.01). There was no significant difference compared to the sham operation group (P﹥0.05). The activity of NF-κB was higher in the ischemia/reperfusion group compared to the other two groups 30 minutes after reperfusion (P﹤0.01). The activity of NF-κB was higher in the pyruvate treated group than in the sham operation group (P﹤0.05). The activity of NF-κB was low in the ischemia/reperfusion group 180 minutes after reperfusion, but still higher than in the other two groups (P﹤0.01). There was no significant difference in activity of NF-κB in the pyruvate treated group (P﹥0.05).
CONCLUSION: The activity of NF-κB decreases during ischemia/reperfusion injury in grafted small intestine in rat small bowel transplantation, which may be one of important protective mechanisms of pyruvate.

Hao ZQ, Wang WZ, Li MB, Zhang HW.Changes in nuclear factor during ischemia/reperfusion injury in rat small intestine transplantation affected by pyruvate.Zhongguo Zuzhi Gongcheng Yanjiu yu Linchuang Kangfu 2008;12(18):3406-3409(China)
[www.zglckf.com/zglckf/ejournal/upfiles/08-18/18k-3406(ps).pdf]

0 引言

临床开展小肠移植难度大、成功率低，主要的限制因素在于小肠对缺血再灌注损伤特别敏感，而在移植过程中移植肠不可避免地要受到缺血再灌注的损害，因此防止和减轻小肠移植过程中缺血再灌注引起的组织损伤，是小肠移植基础和临床研究的热点之一。研究证实丙酮酸对小肠及移植小肠缺血再灌注损伤具有保护作用[1-2]，并且与其影响细胞因子白细胞介素6及肿瘤坏死因子α水平有关。由于核转录因子在各种细胞外刺激介导的细胞信号转导调控中起核心作用，因此拟观察丙酮酸作用下移植小肠缺血再灌注损伤中核转录因子κB的变化并分析其意义。

1 材料和方法

设计：随机对照动物实验。
单位：解放军第二三○医院、解放军第四军医大学西京医院。
材料：实验于2003-10/2004-04在解放军第四军医大学西京医院胃肠外科实验室（生物安全防护水平：absl-2）完成。选用近交系成年雄性SD大鼠78只，体质量200~250 g，由解放军第四军医大学实验动物中心提供（许可证号：SCKK(军)2002-05）。置于无病原的环境中饲养，实验过程中对动物处置符合动物伦理学标准。
设计、实施、评估者：实验设计、实施、评估者均接受过正规实验训练。
方法：
动物分组：将78只大鼠按随机数字表法分为3组：①假手术组6只，行剖腹、左侧肾切除与移植组对照。②移植小肠缺血再灌注组36只，于供体小肠阻断血流、灌洗前10 min向肠腔内注入含有0.26 g多聚葡萄糖的营养液10 mL(能全力)。③丙酮酸处理组36只，于供体小肠阻断血流、灌洗前10 min向肠腔内注入含有0.32 g分析纯丙酮酸的营养液10 mL。
动物模型建立：大鼠于术前12 h禁食。以20 g/L盐酸氯胺酮（75 mg/kg）腹腔内麻醉。参照Wallander等[3]的方法建立移植小肠缺血再灌注动物模型，冷缺血时间约1.5 h。分别于缺血45，90 min和再灌注30，180 min留取移植肠组织标本，每个时间段麻醉后处死6只动物。
指标检测：取长约1.5 cm全层小肠组织，修剪后以体积分数为0.1的甲醛固定，石蜡包埋、切片，苏木精-伊红染色，光镜下观察组织学改变。按Chiu’6级评分标准评价小肠组织损伤：0分：正常黏膜绒毛，无炎症反应，无充血/出血；1分：上皮下Gruenhagen间隙增大，通常在绒毛的尖端，常伴随有毛细血管淤血，炎症细胞在固有层局部增多，固有层毛细血管充血；2分：上皮下间隙扩张伴随上皮层同固有层的中度分离，炎症细胞在固有层弥散增多，固有层局部出血；3分：绒毛两侧上皮层大量的同固有层分离，部分绒毛顶端破损，炎症细胞在内皮下聚集，固有层弥漫出血；4分：绒毛破损伴随固有层毛细血管暴露，可能观察到固有层的细胞成份增多，炎症细胞在内皮下弥散，内皮下出血；5分：固有层破坏和不完整，出血和溃疡，炎症细胞大量聚集，大量出血。将组织损伤评分累计以评价损伤程度。
刮取小肠黏膜组织，分离、提取核蛋白并定量，通过电泳迁移改变分析实验检测肠组织中的核转录因子κB的活性。所获得放射自显影电泳照片，用Q-500 图像分析仪进行定量分析滞后带的A值及面积，用二者的乘积表示核提取物中核转录因子κB的蛋白结合活性。
主要观察指标：各组大鼠不同时点小肠黏膜组织损伤Chiu’评分及核转录因子κB蛋白结合活性。
统计学方法：由第一作者应用SPSS 10.0软件包进行数据分析，实验指标用x(_)±s表示，经单因素方差分析处理数据，P < 0.05为差异有显著性意义。

2 结果

2.1 实验动物数量分析 实验纳入78只大鼠分为3组，假手术组6只，移植小肠缺血再灌注组及丙酮酸处理组各36只，全部进入结果分析，无脱失。
2.2 不同时点的小肠缺血再灌注组织学变化 见表1。

如表1所示，组织学观察可见，假手术组小肠黏膜基本完整，可见有轻度毛细血管淤血和极少量炎症细胞浸润。移植小肠缺血再灌注组小肠冷保存45 min出现轻度组织损伤，伴随缺血时间的延长，组织损伤逐渐加重。再灌注后组织损伤加重尤为明显。肠绒毛由顶端向下破坏，直至绒毛脱落和固有层出血。炎症细胞浸润增多且逐渐向肠壁外层扩散，由充血进而出血且范围扩大，以至造成为中重度损伤。再灌注180 min时可见黏膜固有层破坏、出血，甚至波及黏膜下层和肌层。缺血再灌注不同时相移植小肠缺血再灌注组小肠黏膜组织损伤评分均高于假手术组（P < 0.01）；而丙酮酸处理组评分低于移植小肠缺血再灌注组（P < 0.01），与假手术组差异无显著性意义（P > 0.05）。
2.3 不同时点小肠黏膜核转录因子κB活性 见表2。
 

如表2所示，小肠缺血过程中核转录因子κB的蛋白结合活性无明显变化，各组差异无显著性意义（P > 0.05）。再灌注30 min时移植小肠缺血再灌注组核转录因子κB活性高于其他两组（P < 0.01）；丙酮酸处理组核转录因子κB活性高于假手术组（P < 0.05）。再灌注 180 min时移植小肠缺血再灌注组核转录因子κB活性略降低，但仍高于其他两组（P < 0.01），丙酮酸处理组核转录因子κB活性与假手术组差异无显著性意义（P > 0.05）。

3 讨论

核转录因子κB于1986年由Sen和Baltimore发现，得名于它能够与B细胞免疫球蛋白κ轻链基因的增强子 κB序列（GGGACTTTCC）特异结合。核转录因子κB广泛参与机体的应激反应及炎症反应，在各种细胞外刺激介导的细胞信号转导调控中起核心作用。在静息情况下，核转录因子κB以同源或异源二聚体形式存在于胞浆中，并与抑制性蛋白I-κB结合呈无活性状态。外源性刺激如脂多糖、缺血再灌注损伤、肿瘤坏死因子等通过一系列信号转导引起I-κB经磷酸化、泛素化和蛋白体酶途径而降解，导致核转录因子κB-I-κB复合物解体，核转录因子κB从复合物中释放而活化，借助于被暴露出来的核定位信号进入细胞核，在核内与靶基因的特异序列结合并启动转录[4]。
研究表明组织缺血再灌注过程中内皮细胞产生氧自由基和分泌炎症介质的确切机制可能与通过调节转录因子在转录水平发挥作用有关。其中重要的转录因子之一即核转录因子κB，它可以调节多种与缺血再灌注炎症反应有关的基因如肿瘤坏死因子、多种白细胞介素、酶类以及细胞黏附分子的表达。但是缺血再灌注引起的氧化应激在诱导内皮细胞核转录因子κB活化的机制上同感染性刺激如白细胞介素8、肿瘤坏死因子等细胞因子有根本的不同[5]，它通过I-κB Tyr42位点的磷酸化，而不是两个Ser位点的磷酸化，引起I-κB同核转录因子κB分离。
小肠是对缺血再灌注损伤最敏感的器官之一。临床上小肠缺血再灌注损伤发生于休克、肠系膜上动脉阻塞、绞窄性肠梗阻和器官移植。其危害除造成肠道局部损伤外，还可以导致内毒素血症、成人呼吸窘迫综合征及多器官功能衰竭。虽然缺血后恢复小肠的血流对恢复细胞的功能和稳定性是必要的，但研究表明[1-2，6]，缺血再灌注损伤引起的病理生理改变大多发生在再灌注期间。缺血再灌注损伤是器官移植的最初反应，自获取器官之始，移植物不可避免的要经历缺血过程；Tabasco等[7]证实，急性排斥反应发生除因为移植小肠黏膜的血流减少外，还并存有缺血再灌注损伤和免疫引起的损伤。
研究表明丙酮酸对肝脏、肾脏、小肠等多个器官缺血再灌注损伤具有保护作用，该作用与丙酮酸可提高缺血期间组织内的ATP水平、抑制氧自由基的产生、减少中性粒细胞的浸润等有关[8]。Cicalese等[9]研究证明经丙酮酸处理后的小肠组织在缺血再灌注后氧自由基形成和中性粒细胞浸润均明显减少。Borle等[10]报道丙酮酸可以通过阻止超氧化物的形成防止氧自由基的产生，还可以通过与过氧化氢反应生成二氧化碳和水清除氧自由基。然而，Chan等[11]认为氧自由基和中性粒细胞本身并不是导致临床缺血再灌注损伤病理生理改变的独立因素。
本实验采用同种小肠移植动物模型，以避免或减轻排斥反应的影响；采用与丙酮酸等价能量多聚葡糖为对照，以消除能量代谢差异对实验结果的影响。组织学观察结果[2]与文献[12]观察结果一致，小肠缺血再灌注后损伤开始于微绒毛的顶端，随着缺血再灌注时间的延长，损伤由顶端向下发展，最终导致绒毛脱落和固有层出血。炎症细胞浸润逐渐增多。
丙酮酸发挥保护作用的机制是一个复杂的过程，可能通过影响缺血再灌注及其引发级联反应过程中的多个位点发挥其特殊的保护作用。可能是在缺氧期间通过提高组织的能量代谢的水平，而在再灌注期间通过减弱炎症级联反应激活实现的。
越来越多的证据表明，在炎症反应的复杂因子网络中，核转录因子κB的激活可能是一个中心环节。核转录因子κB可能以不同的激活途径在小肠缺血再灌注损伤中起重要作用。有学者研究发现肠缺血后核转录因子κB的激活是在缺血期末，而不是再灌注期内[13]。缺血和氧化应激可以通过激活蛋白激酶家族作用于核转录因子κB，进而调节前炎症基因的表达[14]。Zou等[15]研究表明抑制核转录因子κB对小肠缺血再灌注损伤具有保护作用。他们在小肠缺血再灌注实验前1 h应用安慰剂和I-κB的抑制剂BAY 11-7085，结果显示通过 BAY11-7085抑制核转录因子κB的激活可使动物缺血再灌注黏膜损伤减轻；白细胞介素6和细胞间黏附分子1的蛋白表达减少。
与部分研究结果不同，本实验显示在移植小肠缺血过程中核转录因子κB的蛋白结合活性无明显变化，各组之间差别不显著[13]。可能是由于本实验采用的是移植模型，缺血期内器官采用低温保存有关。Marzocco等[16]研究证实低温缺血可以抑制核转录因子κB。再灌注30 min时移植小肠缺血再灌注组核转录因子κB活性与其他两组比较明显升高（P < 0.01），丙酮酸处理组核转录因子κB活性也有升高，与假手术组比较（P < 0.05）。提示丙酮酸不能完全抑制核转录因子κB的激活。再灌注180 min时移植小肠缺血再灌注组核转录因子κB活性略降低但与其他两组比较仍有显著的统计学意义（P < 0.01），丙酮酸处理组核转录因子κB活性减低，与假手术组比较，P > 0.05。核转录因子κB的蛋白结合活性变化与细胞因子变化不完全一致，提示细胞因子的变化不完全是核转录因子κB所致，可能与中性粒细胞的浸润激活有关。
结论：丙酮酸作用下大鼠移植小肠缺血再灌注损伤中核转录因子κB的活性降低，该影响主要发生在再灌注期间，提示其可能是丙酮酸对移植小肠缺血再灌注损伤起保护作用的重要机制之一。

4 参考文献

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郝志强，王为忠，李孟彬. 丙酮酸对大鼠小肠缺血再灌注损伤的保护作用[J]. 中国临床康复，2004,8(2):276-277
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郝志强，王为忠，李孟彬. 丙酮酸对大鼠移植小肠缺血再灌注损伤的保护作用[J]. 世界华人消化杂志，2005,13(2):265-267
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