课题背景：免疫抑制剂的应用，虽然有效地抑制了急性排斥反应，但长期应用免疫抑制剂必然会给移植患者带来许多副作用和潜在的危险性。因此，诱导受者对供者器官特异性免疫耐受是解决排斥反应最理想的措施。国内外学者对诱导免疫耐受的尝试甚多，但结果均不甚理想，机制尚不明确，更没有成熟可应用于临床的方案。因此，如何成功地在成年大动物和临床诱导免疫耐受成为免疫学家和移植学家的主攻方向和目标。

应用要点：实验采用基因纯合度高的中国版纳小型猪，采用非转流条件下的原位肝移植手术方法，建立小型猪原位肝移植模型。先前已成功建立小动物移植模型并验证了供体凋亡细胞预处理受者能够诱导免疫耐受，并提出了一个新的观点：肝脏是特异性吞噬凋亡细胞的场所，凋亡细胞有局部免疫抑制的作用，吞噬了凋亡细胞的肝脏抗原递呈细胞在局部免疫抑制的环境下递呈抗原给T细胞，而诱导对被吞噬抗原的免疫耐受。现进行大动物实验来验证作者的发现，同时进一步探索凋亡细胞诱导免疫耐受的机制。

同行评价：目前诱导供者特异性免疫耐受已经成为免疫学家的重大研究课题。文章作者能够抓住这一国际前沿课题开展实验研究，进行了大量的动物实验，成功地诱导了大鼠的供者特异性免疫耐受，并在此基础上进行创新——开展大动物猪的实验，提供了新的思路，对今后的实验具有指导作用。

1解放军第四七四医院普外科，新疆维吾尔自治区乌鲁木齐市 830011； 2南方医科大学附属珠江医院普外科，广东省广州市 510282

谢金敏☆，男，1972年生，四川省绵阳市人，汉族，2007年南方医科大学毕业，博士，主治医师，主要从事器官移植与免疫耐受的临床与基础研究。
platransplantation@163.com

通讯作者：高 毅，博士，教授，南方医科大学附属珠江医院普通外科，广东省广州市 510282 gaoyi6146@163.com

广东省科技计划项目（37055）“凋亡细胞诱导肝移植免疫耐受的方法及相关机制研究”*

摘要

背景：作者先前已成功建立小动物移植模型，并验证了受者经供体凋亡细胞预处理后能够诱导免疫耐受。
目的：验证60Co γ射线体外处理后的供者淋巴细胞预输注诱导猪肝移植特异性免疫耐受的可能性，为不作常规免疫抑制处理成年大动物的移植免疫耐受诱导提供可行的途径。
设计、时间及地点：于2004-06/2007-02在南方医科大学南方医院动物研究所完成随机对照动物实验。
材料：版纳小型猪16只为供体组，西藏小型猪16只为受体组，五六月龄，体质量15~17 kg，雌雄不拘，共行原位肝移植手术16只次。
方法：将受体猪按随机数字表法分为2组（n=8），空白对照组受体猪无特殊处理；供体淋巴细胞预处理组受体猪在术前7 d经耳静脉注射60Co γ射线处理过的供体淋巴细胞。
主要观察指标：应用AnnexinV/PI双标法检测60Co γ射线处理后的淋巴细胞凋亡率，并与正常淋巴细胞进行对照。观察两组受体猪移植术后的存活时间，术后检测肝功能指标及肝脏病理变化。
结果：成功建立非转流小型猪原位肝移植模型16例。①60Co γ射线体外处理后的淋巴细胞凋亡率明显高于正常淋巴细胞（P < 0.01）。②两组受体猪移植术后中位存活时间相同。③移植术后3 d，两组病理活检均呈急性中、重度排斥反应；术后6 d，两组均呈急性重度排斥反应。④两组移植术后肝功能检测血清丙氨酸转氨酶、天冬氨酸转氨酶活性及总胆红素、总蛋白及白蛋白含量测定结果均为肝细胞破坏表现，两组无明显差异（P > 0.05）。
结论：60Co γ射线体外照射可以诱导淋巴细胞凋亡，60Co γ射线体外处理过的淋巴细胞预输注未能够诱导小型猪同种异体肝移植特异性免疫耐受。
关键词：肝移植；免疫耐受；脱噬作用；猪，雏型；疾病模型，动物；器官移植

谢金敏，高毅，潘明新，孔凡东，姚坤厚，王琼.供体凋亡淋巴细胞预输注诱导猪肝移植的免疫耐受[J].中国组织工程研究与临床康复，2008，12(18):3418-3422 [www.zglckf.com/zglckf/ejournal/upfiles/08-18/18k-3418(ps).pdf]

中图分类号: R617
文献标识码: A
文章编号: 1673-8225
(2008)18-03418-05

收稿日期:2007-12-05 修回日期:2008-02-20 (07-50-12-6759/G?A)

Immune tolerance to porcine liver transplantation induced by pre-infusion of 60Coγ-treated donor lymphocyte

Abstract

BACKGROUND: In previous studies we have successfully established small animal models of transplantation, and validated immune tolerance of recipient can be induced by preconditioning of donor apoptotic cells.
OBJECTIVE: To investigate the influence of preoperative transfusion of lymphocyte from in vitro 60Coγ-treated donor porcine on allograft survival of orthotopic liver transplantation, and to develop new protocols for transplantation tolerance induction in adult animals under no routine immunosuppression.
DESIGN, TIME AND SETTING: The randomized controlled animal trial was performed at Research Institute of Animal, Nanfang Hospital of Southern Medical University from June 2004 to February 2007.
MATERIALS: Sixteen Banna Mini-pigs were used as donors and sixteen Tibet Mini-pigs as recipients, 5-6 moths old and 15-17 kg, irrespective of gender. Orthotopic liver transplantation was performed for 16 animals.
METHODS: Donor pigs were randomly divided into two groups (n=8). Blank control group was not given any specific treatment. In lymphocyte preconditioning group, animals were injected with 60Co γ-treated donor lymphocyte preoperatively 7 days.
MAIN OUTCOME MEASURES: Apoptosis rate of lymphocyte treated by 60Coγwas measured by AnnexinV/PI double staining method, and compared with normal lymphocyte. Survival time of pigs in two groups after tranplantation was observed, and liver function parameters and liver pathological alterations were detected.
RESULTS: Sixteen pig models of orthotopic liver transplantation were successfully established. 60Coγ-treated lymphocyte apoptosis rate was significantly higher than that of normal lymphocyte (P < 0.01). Liver grafts of two groups had a identical median survival time. Liver graft biopsy of two groups showed pathological mild or serious acute rejection 3 days after operation, and serious acute rejection on the 6th day. The liver function parameters such as serum alanine transaminase, aspartate aminotransferase activity, total bilirubin, total albumin, and albumin showed liver pathological changes in two groups after the transplantation. But there were no significant differences between two groups (P > 0.05).
CONCLUSION: 60Co γirradiation can induce lymphocyte apoptosis in vitro. Immune tolerance cannot be induced by preoperative transfusion of donor 60Co γ-treated lymphocyte in mini-pigs undergoing liver allograft.

Xie JM, Gao Y, Pan MX, Kong FD, Yao KH, Wang Q. Immune tolerance to porcine liver transplantation induced by pre-infusion of 60Coγ-treated donor lymphocyte.Zhongguo Zuzhi Gongcheng Yanjiu yu Linchuang Kangfu 2008;12(18):3418-3422(China)
[www.zglckf.com/zglckf/ejournal/upfiles/08-18/18k-3418(ps).pdf]

0 引言

肝移植已成为目前治疗终末期肝病惟一有效的方法，但肝移植术后的排斥反应仍是威胁患者和移植物长期存活的主要原因。免疫抑制剂的应用，虽然有效地抑制了急性排斥反应，但长期应用免疫抑制剂必然会给移植患者带来许多副作用和潜在的危险性，如增加感染、肿瘤的发生率，也不能有效地控制可导致移植物失功的慢性排斥反应的发生。诱导受者对供者器官特异性免疫耐受是解决排斥反应最理想的措施，相对免疫抑制疗法，诱导免疫耐受的优势是从根本上避免了排斥反应，又不影响机体的正常抗感染和免疫监视功能，同时避免了药物毒性。因此，诱导移植免疫耐受性，控制移植物排斥反应是十分重要的课题。
本文验证60Coγ射线体外处理后的供者淋巴细胞预输注诱导猪肝移植特异性免疫耐受可能性，为不作常规免疫抑制处理成年大动物的移植免疫耐受诱导提供可行的途径。

1 材料和方法

设计：随机对照，重复测量设计。
单位：解放军第四七四医院普外科，南方医科大学珠江医院普外科。
材料：实验于2004-06/2007-02在南方医科大学南方医院动物研究所（普通级）完成。实验动物为健康中国小型猪32只，包括版纳小型猪和西藏小型猪，五六月龄，体质量15~17 kg，雌雄不拘。版纳小型猪16只为供体组，由四川医学科学院实验动物研究所提供（许可证号：SCXK（m）2005-15）；西藏小型猪16只为受体组，由南方医科大学实验动物研究所提供（许可证号：2006B24）。共行原位肝移植手术16例次，对动物处置方法符合动物伦理学要求。
设计、实施、评估者：实验设计、实施、评估均为全部作者，所有人员均经过正规培训，实验未采用盲法评估。
方法：
用Ficoll-Hypaque 梯度离心法分离淋巴细胞：用本法分离淋巴细胞，纯度在95%以上，收获率可达80%~90%，用细胞计数板在显微镜下计数，调整细胞浓度为5×1010 L-1，制成10 mL淋巴细胞悬液。椎虫蓝染色后确定细胞活力在95%以上。
60Coγ射线诱导淋巴细胞凋亡：将分离出的淋巴细胞悬液放置60Coγ射线下照射 2.5 Gy，加入10 mL RPMI1640液，37 ℃，体积分数为0.05的CO2孵箱培养12~16 h。
AnnexinV/PI双标法检测60Coγ射线处理后淋巴细胞的凋亡率：分别收集60Coγ射线照射后细胞、正常细胞（作为流式细胞仪阴性对照），AnnexinV/PI双标法流式细胞仪检测淋巴细胞的凋亡率。
原位肝移植手术：采用前文介绍的手术方法进行非转流小型猪原位肝移植术[1]。
实验分组：将受体猪按随机数字表法分为2组（n=8），空白对照组受体猪无特殊处理，行肝移植手术；供体淋巴细胞预处理组受体猪在肝移植手术前7 d经耳静脉注射60Coγ射线处理过的 5×108供体淋巴细胞。
观察受体猪一般情况：仔细观察其精神状况、饮食、活动、毛发、黄疸、体质量以及存活时间。
肝功能测定：受体猪移植术后1，3，6 d分别采血运用CX7全自动生化分析仪，测定血清丙氨酸转氨酶、天冬氨酸转氨酶活性及总蛋白、白蛋白、总胆红素含量。
组织病理学检查：术后1，3，6 d取肝脏组织做病理检查，参照肝移植急性排斥反应的病理诊断学标准[2]。
主要观察指标：① 60Coγ射线体外处理后的淋巴细胞凋亡率。②两组受体猪的存活时间、排斥反应程度及肝功能指标。
统计学方法：数据由第一作者应用SPSS 11.0统计软件进行处理，计量资料均采用x(_)±s表示。不同时点的差异采用重复测量数据的方差分析，两两比较采用LSD法，P < 0.05表示差异有显著性意义。

2 结果

2.1 实验动物数量分析 纳入实验动物32只，成功建立非转流小型猪原位肝移植模型16只次，均进入结果分析，无脱失。
2.2 猪原位肝移植手术的一般情况 小型猪原位肝移植手术16例次，手术时间、无肝期时间、术中失血量及输血量同前文所述[1]。两组受体均于肝移植术后1 h内清醒，排尿并可直立行走，术后3 d即可少量进食，但精神萎靡，反应迟钝，毛发蓬乱无光泽，活动减少，体质量持续下降，术后6~9 d，精神萎靡，趴伏在地，几乎不直立，几乎不进食。尸检时肝脏颜色稍淡，轻度肿胀，质地变硬，腹腔偶有少量腹水。
2.3 存活时间 见表1。

如表1所示，与空白对照组相比，供体淋巴细胞预处理组移植术后存活时间无明显延长（P > 0.05）。
2.4 肝功能测定 见表2。 如表2所示，移植术后1，3，6 d两组受体血清丙氨酸转氨酶、天冬氨酸转氨酶活性及总胆红素含量均较术前升高（P < 0.01），血清总蛋白、白蛋白含量较术前降低（P < 0.01），但两组差异无显著意义（P > 0.05）。
2.5 组织病理学检查 见表3。

如表3所示，移植术后1 d，两组均大致呈正常肝脏病理，肝组织轻度瘀血，血管周围少量炎性细胞浸润，少数汇管区小静脉或肝静脉内皮细胞下淋巴细胞浸润；RIA指数为0~2。移植术后3 d，两组活检均见肝细胞板排列轻度紊乱，少量小叶侵犯，部分肝细胞出现气球样变，并可见灶状坏死；中央静脉管壁轻度炎性细胞浸润；汇管区中等量炎性细胞浸润，胆管上皮有坏死，血管充血扩张；RIA指数为6~8。移植术后6 d，两组活检均见移植肝细胞索状排列紊乱或消失，肝细胞出现气球样变，并可见小叶内炎症坏死；中央静脉血管壁及血管周围炎性细胞浸润；汇管区大量炎性细胞浸润，主要为淋巴细胞，胆管上皮坏死、脱落及增生，管壁炎性细胞浸润，血管内膜损伤，有明显出血；RIA指数为8~9。
2.6 细胞凋亡检测 经过60Coγ处理的淋巴细胞凋亡检出率明显高于正常淋巴细胞[（48.70±6.17）%，（0.14±0.09）%（F=15.271，P < 0.01）]；正常淋巴细胞坏死率为经过60Coγ处理的淋巴细胞坏死率明显高于正常淋巴细胞[（22.41±8.36）%，（0.57±0.49）% （F =241.703，P < 0.01）]，见图1。

3 讨论

目前在啮齿类动物，已有许多可行的策略成功诱导出血管化移植物的长期存活。但应用这些策略过渡到临床，由于在大动物模型中得不到相同的结果，却受到了限制。国内外学者对诱导免疫耐受的尝试甚多，但结果均不甚理想，机制尚不明确，更没有成熟可应用于临床的方案。因此，如何成功地在成年大动物和临床诱导免疫耐受成为免疫学家和移植学家的主攻方向和目标。
细胞凋亡是机体内普遍存在的一种生理和病理现象。近来越来越多的研究表明凋亡细胞能够主动调节机体的免疫功能，并能通过调节机体细胞免疫和体液免疫的途径诱导免疫耐受[3-6]。凋亡细胞可以直接抑制T细胞活化[7]；凋亡细胞快速被抗原呈递细胞吞噬，短时间递呈大量供者MHC抗原；而凋亡细胞被吞噬后，不能提供T细胞活化所需要的共刺激因子，使抗原呈递细胞共刺激信号表达被抑制，抑制了抗原呈递细胞的激活，使相应的T细胞克隆灭能，从而诱发供体特异性的免疫耐 受[8]；另一方面，凋亡细胞能促使Th1细胞向Th2细胞转化，而后者则能使相应T细胞失能，产生免疫耐受[9-10]。
作者已成功的建立啮齿类动物心脏、肝脏移植模型并验证了供体凋亡细胞预处理受者能够诱导移植物长期存活[11-12]；发现静脉输注的供者凋亡细胞主要聚集在受体肝脏，并在体内诱导特异性淋巴因子表达[13]；现进行大动物实验来验证作者的发现，同时进一步探索凋亡细胞诱导免疫耐受的机制。进行本实验所用的猪一种是四川版纳小型猪，另一种是南方医科大学动物研究所自行培育的西藏小型猪。版纳小型猪与西藏小型猪均是基因型比较固定的封闭群猪，由于它们MHC抗原的不一致，故移植手术后均出现急性排斥反应，一般发生在术后1~7 d；而单用同一种品系的小型猪则移植手术后排斥反应较轻，成活时间较长，大多可超过1个月[1]。
器官移植中排斥反应的诊断和鉴别诊断是非常重要的，除了排斥反应，其他原因包括感染，缺血和药物毒性也可使移植物丧失功能。移植术后以移植物存活作为排斥反应终点，移植物存活与受体存活在原位肝移植后是一致的，故以受体存活时间表示移植物的存活情况，同时在术后对受体行血常规、术后超声造影检查以除外感染、出血等其他原因导致的死亡。肝移植排斥时，除出现精神萎靡、食欲减退、黄疸及肝脏肿大临床症状外，由于肝细胞的损伤破坏而溢出细胞外，使得血中的丙氨酸转氨酶、天冬氨酸转氨酶活性及总胆红素含量增高，同时，由于肝细胞受损影响肝脏蛋白的合成功能，导致总蛋白、白蛋白含量下降。肝功能检测有助于判定排斥反应的程度。急性排斥反应时，移植肝也出现特征性的病理变化，如汇管区炎性细胞的浸润、胆管炎性损伤及小叶间静脉或中央静脉的血管内皮炎[2]。目前以这种特征性的病理变化作为判定有无排斥以及排斥轻重的金标准。
本实验证实，四川版纳小型猪-西藏小型猪原位肝移植是一种同种异体肝移植模型，呈急性排斥反应，实验结果显示预处理组中位存活时间与对照组相同，中位生存时间为7 d。两组肝移植术后3~9 d均出现黄疸、精神萎靡、毛发无光泽、进食减少、体质量持续下降等排斥反应征象。移植术后3 d，两组病理活检均呈急性中、重度排斥反应，RIA指数为6~8。术后6 d，两组病理均呈急性重度排斥反应，RIA指数为8~9。两组术后肝功能检测结果均为肝细胞破坏表现，且两组无明显差异（P > 0.05）。本实验中单纯的供体凋亡淋巴细胞预处理未能延长成年大动物移植肝的存活时间及减轻排斥反应，未能诱导免疫耐受。
本实验应用60Coγ射线体外照射处理供体淋巴细胞诱导淋巴细胞凋亡，在移植前行供体凋亡淋巴细胞预输注，并没有诱导受体猪产生免疫耐受，这与前期实验得出的结果不符。作者认为未能诱导免疫耐受的可能原因有以下几点：一是在本实验中，由于60Coγ射线体外照射处理后的供体淋巴细胞凋亡率是（48.70±6.17）%，还有（22.41±8.36）%的坏死细胞；所以预输注的凋亡淋巴细胞中包含有（22.41±8.36）%坏死细胞，这些坏死细胞输注入受体后，必然释放大量细胞因子并能够激活体内C3a\C5a等趋化因子，导致受体免疫系统激活，对坏死细胞进行快速处理，抗原递呈，炎症细胞浸润；同时，抗原呈递细胞消化坏死细胞的结果不仅是在细胞表面表达肽链，而且活化抗原呈递细胞表达协同刺激分子，这是T细胞活化以及诱导免疫应答的双信号要求[14-15]。这些坏死的细胞将释放“危险信号”以刺激免疫系统，因此当这些细胞碎片最终被吞噬细胞所吞噬时，其细胞上抗原必将被有效递呈，同时在共刺激信号作用下活化为相应的T细胞克隆，产生免疫应答反应[16]。从而打破对免疫调节的动态平衡状态，加剧了排斥反应。目前在这方面的研究已有了直接证据，Jiang等[17]发现输注供者凋亡或坏死脾细胞对受体脾移植会产生相反结果，凋亡细胞抑制γ-干扰素增高、促进转化生长因子β增高，明显减轻排斥反应，而坏死细胞作用相反。根据Matzinger[18]危险信号学说，坏死细胞本身即是危险信号的一种，可以诱导免疫排斥反应；而此时如果预输注的凋亡细胞还没有达到诱导耐受的效果，表现为排斥反应加剧。因此，Bittencourt等[19]提出在用凋亡细胞诱导免疫耐受的实验中应将凋亡细胞中的坏死细胞控制在10%以下，而在前期的实验中并没对预输注凋亡细胞中所含坏死细胞的比例予以足够的重视。二是预输注供者凋亡淋巴细胞数目不够，输注凋亡细胞数目是根据作者前期实验经验[11-12]并结合文献[20]而定的，供者凋亡细胞数在宿主体内含量大于其1.5%的外周血淋巴细胞数是同种异体器官移植长期存活的重要保障。本实验用的小型猪体质量10~15 kg，预输注的凋亡淋巴细胞数目是5×108，而前期大鼠实验用的SD大鼠体质量200~300 g，预输注的凋亡淋巴细胞数目是5×107，单纯二者的细胞数与体质量相比，后者是前者的5倍，尤其是考虑到猪的外周血内含的淋巴细胞较多，占60%~70%，且常年处于激活状态，所以输注的凋亡淋巴细胞数量与受体外周血淋巴细胞数量相比还是偏低的，因此还需要对有效的预输注淋巴细胞的数量做一定的探索。三是成年大动物的免疫系统比较复杂，而体内免疫系统调节是一个极其精确的过程，任何看似微小的差异都可能导致迥然不同的结果。尽管该预输注实验在小鼠及大鼠实验取得了免疫耐受，但考虑到啮齿类动物免疫系统与猪的免疫系统差异较大，小鼠与大鼠的MHC分别为H-2，RT1复合物，而猪的MHC为SLA，二者MHC结构和功能相差较大，所以对凋亡淋巴细胞所作出的免疫反应也不同，虽然作者在啮齿类动物用凋亡细胞预输注诱导出免疫耐受，但将在啮齿类动物的实验方法简单的放大用于大动物猪上，是完全有可能出现不同结果的。另外，供体凋亡细胞输注诱导免疫耐受的方法还需要进行细致的探索，对凋亡细胞输注后的去向，凋亡细胞诱导免疫耐受的机制，凋亡细胞在各种情况下被吞噬之后的反应如是否活化吞噬细胞，凋亡细胞调节免疫反应中何种抗原呈递细胞起决定性作用、抗原呈递细胞在接受来自凋亡细胞的信号后对T细胞的早期活化抗原和T细胞淋巴因子的调节作用规律等问题尚有待进一步研究。

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