氯高铁血红素诱导内源性血红素加氧酶1对大鼠肾移植急性排斥反应的防护☆

李沙丹，靳风烁，李黔生，朱方强，聂志林，霍文谦，毕罡，马强

课题背景：排斥反应是影响器官移植后人及供体长期存活的重要因素。研究表明，内皮细胞和组织细胞中血红素加氧酶1等保护基因的表达可以明显延长移植物存活时间。这些保护基因表达上调不仅阻滞前炎症因子的产生，而且能够抑制内皮细胞凋亡。

应用要点：实验以肾作为移植器官，以BN和Lewis大鼠作为供、受体，成功建立了双侧供肾大鼠同种异体肾移植急性排斥反应模型，通过氯高铁血红素诱导组织细胞中保护基因血红素加氧酶1的表达，分析血红素加氧酶1在肾脏移植中的抗免疫排斥和抗凋亡作用。

偏倚或不足：血红素加氧酶1在肾移植急性排斥反应的病理生理过程中以及移植免疫应答过程中起重要作用，但还不能完全替代常规的环孢素A等强力免疫抑制剂。

解放军第三军医大学大坪医院野战外科研究所泌尿外科一区，重庆市 400042

李沙丹☆，男，1974年生，四川省内江市人，汉族，解放军第三军医大学在读博士，主治医师，主要从事泌尿外科、肾脏移植方面的研究。
lishadan2005@163.com

摘要

背景：研究表明，血红素加氧酶1系统及其代谢产物可通过多条途径发挥对器官移植物的保护作用，显著延长移植物生存时间。
目的：实验拟进一步评估氯高铁血红素诱导产生的内源性血红素加氧酶1对大鼠肾移植急性排斥反应的防护作用。
设计、时间及地点：随机对照动物实验，于2007-05/08在解放军第三军医大学动物实验中心完成。
材料：以27只BN大鼠为供体（54个供肾），54只雄性Lewis大鼠为受体，建立双侧供肾大鼠原位肾移植模型。
方法：以硬膜外导管为支架行供肾静脉与受体肾静脉端端吻合，供肾动脉带腹主脉瓣与受体腹主动脉行端侧吻合，供肾输尿管膀胱瓣与受者膀胱吻合。Lewis受鼠按随机数字表法分为3组（n=18）：肾移植模型组术后不予免疫抑制治疗；氯高铁血红素诱导组供鼠于术前1 d腹腔注射氯高铁血红素50 mg/kg，受体于术后腹腔注射氯高铁血红素 50 mg/（kg?d）至处死；环孢素A组术后予环孢素A灌胃5 mg/（kg?d）。
主要观察指标：各组分别于肾移植术后第1，5，7 天处死6只受鼠，观察肾组织病理改变、血红素加氧酶1蛋白表达及其对急性排斥反应的影响，同时采集血标本测血肌酐含量。
结果：①氯高铁血红素可促进大鼠肾脏血红素加氧酶1蛋白表达水平(P < 0.05)。②移植术后肾移植模型组、氯高铁血红素诱导组的血红素加氧酶1表达水平高于环孢素A组(P < 0.05~0.01)，且随着排斥反应的加重，表达逐渐增强；环孢素A组在移植术后血红素加氧酶1表达也有所增强，但明显低于氯高铁血红素诱导组(P < 0.01)，排斥反应相对较轻。③氯高铁血红素诱导组大鼠肾组织病理学表现较肾移植模型组明显减轻，但比环孢素A组重。④氯高铁血红素诱导组血肌酐水平低于肾移植模型组(P < 0.05)，高于环孢素A组(P < 0.05)。
结论：血红素加氧酶1在大鼠同种异体肾移植抗排斥反应、保护移植器官中起到了一定的作用，但其作用远远不及环孢素A等强力免疫抑制剂。
关键词：肾移植；氯化血红素；血红素氧化酶；疾病模型，动物；器官移植

李沙丹，靳风烁，李黔生，朱方强，聂志林，霍文谦，毕罡，马强.氯高铁血红素诱导内源性血红素加氧酶1对大鼠肾移植急性排斥反应的防护[J].中国组织工程研究与临床康复，2008，12(18):3427-3431
[www.zglckf.com/zglckf/ejournal/upfiles/08-18/18k-3427(ps).pdf]

Protective effect of hemin induced endogenous heme oxygenase-1 on acute rejection following renal transplantation in rats

BACKGROUND: Heme oxygenase-1 and its metabolic product have a protective effect on organ graft and can significantly prolong live time of the graft.
OBJECTIVE: To investigate the protective effect of heme oxygenase-1 induced by hemin on acute rejection in rat models after renal transplantation.
DESIGN, TIME AND SETTING: A randomized control animal experiment was performed at the Animal Experimental Center of Third Military Area Command of Chinese PLA from May to August 2007.
MATERIALS: Totally 27 adult Brown-Norway rats (54 kidneys) as donors and 54 male Lewis rats as receptors were used to establish rat models of in situ renal transplantation.
METHODS: Epidural catheter was used as a stent to perform end-to-end anastomosis of renal vein between donors and receptors, end-to-side anastomosis of donor abdominal aorta valve and receptor abdominal aorta, and donor kidney tubal bladder valve and receptor bladder anastomosis. Lewis rats were equally and randomly divided into three groups. Rats in the renal transplantation group did not receive immunosuppressive therapy after transplantation. Hemin (50 mg/kg) was intraperitoneally injected into receptor rats in the hemin group one day before surgery. Hemin (50 mg/kg) was daily intraperitoneally injected into receptor rats after surgery. Ciclosporin A 5 mg/kg was given to rats in the ciclosporin A group by lavage after surgery.
MAIN OUTCOME MEASURES: Six rats were sacrificed at days 1, 5 and 7 after renal transplantation in each group. Pathological changes in renal tissues, heme oxygenase-1 protein expression and the heme oxygenase-1 effects on acute rejection were observed. Blood samples were collected to measure serum creatinine content.
RESULTS: Hemin could promote heme oxygenase-1 protein expression in rat kidney (P < 0.05). Heme oxygenase-1 levels were higher in the renal transplantation and hemin groups than in the ciclosporin A group (P < 0.05-0.01). With the severe of rejection, heme oxygenase-1 levels increased. Heme oxygenase-1 levels increased in the ciclosporin A group after transplantation, but significantly decreased in the hemin group (P < 0.01). Rejection was mild. Renal histopathological changes were fewer in the hemin group compared with the renal transplantation group, but more compared with the ciclosporin A group. Serum creatinine levels were lower in the hemin group than in the renal transplantation group (P < 0.05), but higher than in the ciclosporin A group (P < 0.05).
CONCLUSION: Heme oxygenase-1 has a protective effect on acute rejection in rat allograft renal transplantation, but its effect is significantly inferior to ciclosporin A.

Li SD, Jin FS, Li QS, Zhu FQ, Nie ZL, Huo WQ, Bi G, Ma Q. Protective effect of hemin induced endogenous heme oxygenase-1 on acute rejection following renal transplantation in rats.Zhongguo Zuzhi Gongcheng Yanjiu yu Linchuang Kangfu 2008;12(18):3427-3431 [www.zglckf.com/zglckf/ejournal/upfiles/08-18/18k-3427(ps).pdf]

排斥反应是影响器官移植后人及移植器官长期存活的重要因素。研究表明，内皮细胞和组织细胞中血红素加氧酶1（HO-1），bcl-2，bcl-xl和A20等保护基因的表达可以明显延长移植物存活时间[1-3]。HO-1是一种保护蛋白，在缺血再灌注损伤和器官移植中的作用明显。HO-1除能降解血红素、减轻氧化损伤外，还具有改善微循环、抗炎、调节细胞周期的作用，是保护机体免受组织损伤的重要成分。这些保护基因表达上调不仅阻滞前炎症因子的产生，而且能够抑制内皮细胞凋亡。国内外已经有大量关于HO-1在心、脑等器官缺血/再灌注损伤方面的研究，但关于氯高铁血红素（Hemin）及HO-1在肾移植以及急性排斥反应方面的报道还较少。
本实验以BN和Lewis大鼠为供、受体，建立双侧供肾大鼠同种异体肾移植急性排斥反应模型，通过氯高铁血红素诱导组织细胞中保护基因HO-1的表达，观察HO-1在肾移植中的抗免疫排斥和抗凋亡作用。

设计：随机对照动物实验。
时间及地点：实验于2007-05/08在解放军第三军医大学动物实验中心（实验室许可证号：SCXK-(军)2002-008）完成。
材料：实验以27只BN大鼠（Brown-Norway）为供体（54个供肾），体质量250~300 g，雌雄不限；54只雄性Lewis大鼠为受体，体质量250~300 g，均购自北京维通利华实验动物种子中心（国家级实验动物种子中心，合格证号：SCXK-(京)2002-0003）。供受鼠按解放军第三军医大学实验动物饲养标准，温暖通风条件下普通饲料喂养。对动物处置方法符合动物伦理学要求。
主要仪器：手术显微镜、显微外科手术器械、医用8/0无损伤缝合线、硬膜外导管、常规手术器械等。
药品及试剂：器官保存液、速眠新、青霉素、环孢素A、氯高铁血红素(Biotech)、兔抗HO-1抗体(Santa cruz)、原位末端标记调亡试剂盒(南京凯基生物)。
方法：
动物分组：Lewis受鼠按随机数字表法分为3组，每组18只。肾移植模型组术后不予免疫抑制治疗；氯高铁血红素诱导组供鼠于术前1 d腹腔注射氯高铁血红素 50 mg/kg，受体于术后腹腔注射氯高铁血红素 50 mg/（kg?d）至处死；肾移植模型组、氯高铁血红素诱导组术后不予抗排斥治疗；环孢素A组术后予环孢素A灌胃5 mg/（kg?d）。
动物模型建立：参照文献[4]方法并适当改良，已成功建立双侧供肾大鼠同种异体肾移植模型[5]。以硬膜外导管为支架行供肾静脉与受者肾静脉端端吻合，供肾动脉带腹主脉瓣与受者腹主动脉行端侧吻合，供肾输尿管膀胱瓣与受者膀胱吻合。各组分别于术后第1，5，7 天处死6只受鼠，收集肾脏标本，同时采集血标本0.5~1 mL测血肌酐。
病理组织学检测：急性排斥反应诊断参照人同种肾移植的Banff 97分级系统[6]，急性排斥反应严重程度半定量评分参照Watanabe等[7]的方法。
免疫组织化学检测肾脏组织HO-1表达：按试剂盒步骤染色后每张切片取5个阳性视野，以Image-pro plus 5.0软件计算每个视野平均吸光度值。
HO-1活性检测：HO-1的活性以转化血红素为胆红素的能力来评价，步骤如下：根据HO-1降解血红素生成胆红素和一氧化碳的原理，通过测定样品反应物中胆红素生成量，间接反映HO-1的活性。取受鼠移植肾组织 0.1 g，匀浆离心、收集上清液，加入4.5 mmol/L NADPH、肝组织匀浆上清液（作为胆绿素还原酶的来源，取自同一大鼠的肝脏，以去除肝HO-1的干扰）、2 mmol/L氯高铁血红素，混匀后置暗处，37 ℃反应30 min。用分光光度计463 nm和530 nm双波长处测定胆红素的生成量[胆红素的摩尔吸光系数为40/(nm?cm)]。肾匀浆上清液蛋白含量测定采用Bradfood法（考马斯亮兰G2250染色法）。HO-1活性用公式(A464-A530×蛋白含量×20)×106 计算，单位为μmol/(g?min)。
移植肾组织调亡检测（原位末端标记法）：①标本采集：术后各组第7天移植肾组织冻存标本。②标本处理及检测：按试剂说明操作后光学显微镜下观察、拍照400倍光镜下观察，胞核染成棕黄色者为凋亡细胞，每张切片选10个不重叠视野，每个视野连续计数100个肾小管上皮细胞，以凋亡细胞所占百分比为凋亡指数。
主要观察指标：各组大鼠肾移植术后移植肾病理改变、HO-1蛋白含量及血肌酐水平。
设计、实施、评估者：实验设计、实施、评估均为本文作者，均经过正规培训。
统计学分析：由作者本人应用SPSS 12.0软件包进行单因素方差分析，实验组内两两比较采用LSD法。

2.1 实验动物数量分析术中、术后大鼠死亡4只，肾移植模型组2只因麻醉意外、出血性休克死亡，氯高铁血红素诱导组1只因腹腔感染死亡，环孢素A组1只因吻合血栓死亡，手术成功率92.5%。标本采集过程中受鼠死亡2只，死亡原因主要为麻醉意外。另行手术补充。
2.2 免疫组织化学检测结果见表1。

如表1所示，HO-1在正常鼠肾组织中也有少量表达，其阳性染色部位主要位于胞浆，多见于远端肾小管细胞和集合管细胞，排斥反应时肾小球及血管内皮也有表达。免疫组化检测结果显示各组大鼠肾移植术后第1，5和7天HO-1表达水平逐渐升高 (P < 0.05)；组间两两比较，氯高铁血红素诱导组各时相点HO-1表达水平显著高于肾移植模型组、环孢素A组(P < 0.01)，术后1，7 d肾移植模型组HO-1表达水平高于环孢素A组（P < 0.05），见图1。
2.3 HO-1活性检测结果见表2。
如表2所示，氯高铁血红素诱导组术后第1，5，7天移植肾HO-1活性高于肾移植模型组及环孢素A组(P < 0.01)。术后氯高铁血红素诱导组HO-1活性逐渐升高（P < 0.05）。

2.4 移植肾组织调亡检测结果高倍镜下正常鼠肾仅偶见阳性细胞，凋亡细胞阳性率为（0.08±0.02）%，肾移植模型组凋亡细胞阳性率高于氯高铁血红素诱导组及环孢素A组[（28.49±5.41）%，（19.52±2.73）%，（2.14±0.47）%（P < 0.01）]，氯高铁血红素诱导组高于环孢素A组（P < 0.05）。
2.5 病理组织学改变见表3。

如表3所示，经单因素方差分析，术后第1，5，7天3组间两两组间评分差异具有显著性意义(P < 0.05)。肾移植模型组及氯高铁血红素诱导组中，术后第5，7天评分高于第1天(P < 0.05)，第7天高于第5天(P < 0.05)；环孢素A组各时相评分差异无显著性意义(P > 0.05)。
术后第1天，各组肾小球、肾小管结构、形态基本正常；肾移植模型组4只大鼠、氯高铁血红素诱导组2只大鼠出现散在的间质淋巴细胞浸润。环孢素A组间质未见异常，在随后的病理检查中，部分标本单核细胞浸润数量轻度增多，范围未见明显扩大。肾移植模型组、氯高铁血红素诱导组术后第3天，单核细胞浸入肾小管，形成小管炎。术后第5天累及微血管和肾小球。术后第7天大部分移植肾单核细胞浸润累及微血管，形成动脉内膜炎，但未见透壁性纤维素样动脉内膜炎，见图2。

如表4所示，恢复血流后，所有移植肾均在3~5 min开始泌尿。术后3 d结扎自体右肾后受者仍有尿液排出，说明移植肾有功能。移植后1 d肾移植模型组与氯高铁血红素诱导组大鼠血肌酐水平差异无显著性意义(P > 0.05)；移植后5，7 d，肾移植模型组血肌酐水平高于氯高铁血红素诱导组及环孢素A组(P < 0.05)，氯高铁血红素诱导组高于环孢素A组(P < 0.05)。

HO是血红素代谢的起始限速酶，分解血红素为一氧化碳、铁及胆绿素，后者迅速降解为胆红素。这些代谢产物具有重要的生理功能，胆绿素和胆红素是有效的自由基清除剂，防止细胞脂质过氧化，具有较强的抗氧化功能。在HO家族中，HO-1作为一种诱导蛋白，可以被多种因素诱导而表达，是细胞在缺血、热休克、炎症等应激过程中的一种自我保护机制[8]。应用HO-1基因敲除的肾损伤动物模型，Nath等[9]证实HO-1的表达是阻止肾小管间质炎症反应及炎症因子基因表达所必需。最近的一些研究表明，在缺血再灌注前应用诱导剂诱导HO-1的表达可减轻肝脏、心脏、肺脏及肾脏等多个器官的缺血再灌注损伤，保护这些脏器的结构，改善脏器的功能[10-15]。
HO-1系统及其代谢产物通过多条途径发挥对移植物的保护作用，显著延长移植物生存时间。同时其代谢产物CO可以抑制血小板黏附、抑制内皮细胞凋亡等多种途径降低排斥反应，延长移植物存活时间[16]。Tullius等[17]在大鼠同种异体肾移植缺血再灌注损伤模型中证实急性排异反应可诱导HO-1的表达，从而减轻移植肾的损伤，延长移植肾的存活。
氯高铁血红素又名氯化血红素或血晶素，可诱导血红蛋白和其他红细胞系统特异蛋白激酶的基因转录、翻译，并提供铁和血红素以供组装血红蛋白[18]，已用于治疗间歇性血卟啉病。血晶素即是HO的底物，又是HO的促进剂，可诱导HO-1基因表达，促进内源性一氧化碳产生，催化血红素产生胆绿素、一氧化碳和Fe3+。其中一氧化碳是重要的信使分子，而胆绿素是有
效的抗氧化抗自由基物质。Hsu等[19]发现HO-1可以介导抗炎作用。Courtney 等[20]认为HO-1具有肾细胞保护作用。
本实验结果发现，正常大鼠肾脏中HO-1有少量表达，HO-1主要在肾小管细胞和集合管细胞表达。在排斥反应组和氯高铁血红素诱导组的表达均上调，部分肾小球及血管内皮细胞也有表达。肾移植模型组、氯高铁血红素诱导组的表达水平在术后第1，5和7天显著高于环孢素A组，且随着排斥反应的加重，表达增强。环孢素A组在移植术后的表达也有所增强，但明显低于氯高铁血红素诱导组，而排斥反应却相对较轻。氯高铁血红素诱导组的HO-1表达明显高于肾移植模型组和环孢素A组，经氯高铁血红素诱导后HO酶活性明显增强，凋亡指数也低于肾移植模型组和环孢素A组，组织病理学表现较肾移植模型组明显减轻，但比环孢素A组重。证明氯高铁血红素可促进大鼠肾脏HO-1蛋白表达，促进内源性一氧化碳产生，催化血红素产生胆绿素、一氧化碳和Fe3+。这对于移植过程中（如缺血、再灌注等）所产生的大量自由基恰好起了拮抗作用，从而对移植肾起到很好的保护作用，减轻了移植肾的损伤并降低排斥反应发生率。
综上所述，HO-1在肾移植急性排斥反应的病理生理过程中以及移植免疫应答过程中起重要作用，因此，对肾移植急性排斥反应的早期诊断和治疗，减轻术后移植肾的缺血再灌注损伤及抗排斥反应具有很高的研究和应用价值，但是实验数据显示还不能完全替代常规的环孢素A等强力免疫抑制剂。

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