血红素加氧酶1对模拟移植后犬肺功能的影响☆

石缨1，毕建立2，宋志鸿3，刘亚宁1

课题背景：作者在承担全军科研课题（01Q032）的研究工作中，从高过载反复暴露大鼠心脏组织中分离得到1组差异表达基因，其中在正加速度负荷反复暴露的大鼠心脏组织中血红素加氧酶1表达明显增加。

应用要点：实验观察了血红素加氧酶1对模拟移植后犬肺功能的影响。血红素加氧酶1过表达可增强肺组织抵抗氧化应激损伤，延长供体肺生存时间，改善移植后肺功能。这一结果为提高临床器官移植存活率提供了实验依据，为临床应用奠定了基础。

同行评价：血红素加氧酶1是一种应激性蛋白，通常应激性表达蛋白对机体都有保护性作用。肺移植保护也是临床迫切需要解决的重要问题。课题设计较合理，有一定创新性，对于研究移植肺保护具有重要意义。

1惠州市口腔医院颌面外科，广东省惠州市 516001；2四川大学华西口腔医学院颌面外科，四川省成都市 610041

唐尤超☆，男，1971年生，江西省九江市人，汉族，2005年四川大学毕业，博士，副主任医师，主要从事颌面部整型及创伤修复重建的研究。
yctang0808.360@163.com

广东省自然科学基金资助项目(06301417)*；广东省卫生厅资助项目(A2006726)*

背景：近年来基因修饰干细胞与支架材料复合形成组织工程化骨为修复骨缺损提供了骨组织重建的全新思路。
目的：实验拟观察转染人骨形态发生蛋白2基因转染骨髓间充质干细胞复合珊瑚羟基磷灰石支架材料修复骨质疏松症下颌骨缺损的效果。
设计、时间及地点：随机对照动物实验，于2005-06/2006-10在教育部口腔生物医学工程重点实验室完成。
材料：6月龄未孕雌性SD大鼠24只，SPF级，体质量250~300 g，构建绝经后骨质疏松症动物模型。含人骨形态发生蛋白2基因的pcDNA3.1-hBMP-2重组质粒由解放军第三军医大学提供；支架材料珊瑚羟基磷灰石由卫生部口腔生物医学工程重点实验室提供。
方法：24只SD模型大鼠随机数字表法分为实验组和对照组，每组12只。3个月后分别取其骨髓间充质干细胞培养。实验组骨髓间充质干细胞通过脂质体Lipogen介导转染pcDNA3.1-hBMP-2质粒，对照组细胞未作处理。3 d 后将每只大鼠骨髓间充质干细胞与珊瑚羟基磷灰石支架材料复合，再分别对应地植入取材动物的自体下颌骨极限性骨缺损区。
主要观察指标：术后第4，8周组织切片行免疫组织化学染色，观察新骨形成情况。术后8周进行成骨量的半定量检测。
结果：24只SD模型大鼠均进入结果分析。①术后4周实验组在珊瑚羟基磷灰石材料边缘有新生骨质形成，8周时见相互连接的层板状成熟骨基质形成，对照组4周时只在材料边缘有少量骨基质形成，8周时新生骨质数量上明显少于实验组，且材料边缘及中央处有脂肪样结构形成。②对照组术后8周新生骨所占面积百分比为（0.046±0.004）%，实验组为（0.233± 0.015）%，各组成骨量差异具有显著性意义（P < 0.01）。
结论：人骨形态发生蛋白2基因修饰的骨髓间充质干细胞复合珊瑚羟基磷灰石支架形成的组织工程化骨修复骨质疏松症下颌骨的成骨量较无基因修饰明显增加。
关键词：骨形态发生蛋白2；骨质疏松症；细胞分化；基因治疗

解放军空军总医院，1中心实验室，2心胸外科，3麻醉科，北京市 100036

石缨☆，女，1970年生，山东省招远市人，汉族，1999年河北医科大学毕业，博士，副主任医师，主要从事器官移植的基础研究。 kjshiying@yahoo.com.cn

中图分类号: R617
文献标识码: A
文章编号: 1673-8225
(2008)18-03432-05

Effect of heme oxygenase-1 effects on pulmonary function after simulant transplantation in dogs

BACKGROUND: Heme oxygenase-1 (HO-1), an important biological molecular of regulating and resisting oxidative stress, participates in organ transplantation and ischemia/reperfusion injury.
OBJECTIVE: To observe the over-expression of heme oxygenase-1 (HO-1) on dog lung function after simulating cycle process in reperfusion models in dog ex vivo lung transplantation.
DESIGN, TIME AND SETTING: Randomized control animal experiments were performed at the Experimental Animal Center of Air Force General Hospital of Chinese PLA from December 2005 to March 2006.
MATERIALS: Twelve healthy hybrid dogs were used to establish reperfusion models in dog ex vivo lung transplantation.
METHODS: Dogs were randomly divided into three groups. Dogs in the model group received simple lung ischemia/reperfusion. Dogs in the inducer group were treated with heamin of HO-1 in advance. Dogs in the suppressant group underwent Zinc protoporphyrin (ZnPP) of HO-1 during reperfusion.
MAIN OUTCOME MEASURES: HO-1 mRNA levels, and after transplantation blood gas index, pulmonary artery press, superoxide dismutase (SOD) activities and malondialdehyde (MDA) contents were detected in dog lung tissues in the three groups.
RESULTS: Totally 12 dogs were included in the final results. HO-1 mRNA levels of lung tissues increased in the inducer group compared to the suppressant group and model group (P < 0 .01). Pulmonary arterial pressure increased and then reduced in each group after transplantation, and reached a peak at about 30 minutes after simulant transplantation. 120 minutes after simulant transplantation, partial pressure of oxygen in artery (PaO2) was higher in the inducer group than in the model group and suppressant group (P < 0.05), but partial pressure of carbon dioxide in artery (PaCO2) was lower than in the model group and suppressant group (P < 0.05). No significant difference in above-mentioned indexes was detected in the model group and suppressant group (P > 0.05). 120 minutes after simulant transplantation, MDA contents were increased in each group, and were lower in the inducer group than in the model group and suppressant group (P < 0.05). SOD activities were reduced in each group, and were higher in the inducer group than in the model group suppressant group (P < 0.05).
CONCLUSION: The over-expressions of HO-1 can significantly improve the dog lung function after simulant transplantation.

Shi Y, Bi JL, Song ZH, Liu YM. Effect of heme oxygenase-1 effects on pulmonary function after simulant transplantation in dogs.Zhongguo Zuzhi Gongcheng Yanjiu yu Linchuang Kangfu 2008;12(18):3432-3436(China)
[www.zglckf.com/zglckf/ejournal/upfiles/08-18/18k-3432(ps).pdf]

0 引言

血红素加氧酶1属于应激反应蛋白，是机体调节和抵抗氧化应激反应的重要生物分子，多种因素如重金属，血红素、低氧、高温及紫外线照射均可诱导血红素加氧酶1的大量表达。血红素加氧酶1作为血红素分解代谢的限速酶，可将血红素降解为胆绿素、一氧化碳和游离Fe2+[1-2]。血红素加氧酶1与临床上一些疾病密切相关，如器官移植、缺血再灌注损伤等过程。本实验通过制备犬离体肺移植再灌注模型，模拟肺移植后的循环过程，预先诱导犬肺血红素加氧酶1表达，观察过表达的血红素加氧酶1对模拟移植后犬肺功能的影响。

设计：随机对照动物实验。
时间及地点：实验于2005-12/2006-03在解放军空军总医院实验动物中心（普通级）完成。
材料：选用健康杂种犬12只，雌雄不限，体质量12~20 kg，由解放军空军总医院实验动物中心提供（许可证号：SYXK(军)2002-010）。对动物处置方法符合动物伦理学要求。主要仪器设备：Sarns7400滚压泵。试剂和药品：膜肺为Medtronic公司产品；速眠新Ⅱ注射液，由军事医学科学院军事兽医研究所制造；盐酸氯胺酮注射液为江苏恒瑞医药股份有限公司产品；肝素钠为北京双鹤药业股份有限公司产品；乳酸钠注射液为天津金耀氨基酸有限公司产品；其余化学试剂均为分析纯，购自北京化学试剂商店；引物由赛百盛公司合成，2×PCR Mix为广州东盛公司产品。
方法：
Celsior液的配置：Celsior液是一种细胞保护液，常在心脏移植中用于心脏的保护，近年也用于肺移植的肺保护，Celsior液的成分组成如下：C3H5NaO3 80 mmol/L，CaCl2 0.26 mmol/L，谷胱甘肽3 mmol/L，组氨酸 30 mmol/L，KCl 15 mmol/L，MgCl2 13 mmol/L，谷氨酸钠20 mmol/L，甘露醇60 mmol/L。配置后4 ℃保存备用。
动物模型建立：实验犬术前12 h禁食水，实验开始前肌注阿托品0.5 mg，30 min后，肌肉注射速眠新Ⅱ 0.1 mg/kg及氯胺酮15 mg/kg，麻醉平稳后，以呼吸机控制呼吸，潮气量15~20 mL/kg，频率28次/min，吸入氧浓度100%，麻醉期间心电监护仪监测。分离股静脉，注射肝素钠3 mg/kg抗凝。经股动脉穿刺放血800~1 000 mL后，心跳停止，肺呈热缺血状态。剪开胸骨，经纵隔进入两侧胸腔，游离两侧肺下韧带、上下腔静脉、气管、升主动脉，分别结扎切断升主动脉及上下腔静脉，气管拔管前膨肺，在2/3膨胀状态下切断整体心肺块。热缺血1 h后切开心包，分离肺动脉主干，左右肺动脉，升主动脉。距肺动脉起始部远端约1.5 cm处插入静脉穿刺套管针，拔出针芯，用于监测肺动脉压力和排气。肺动脉灌注管直接经上腔静脉插入右心房内；腔静脉引流管自主动脉插入至左心室，灌注管及引流管分别连接再灌注装置的滚压泵。热缺血1 h后肺动脉测压针排气，以4 ℃ Celsior液自上腔静脉内灌注左心房冲洗肺内残余血液，灌注量 60 mL/kg，测压针监测肺动脉灌注压力为2.66 kPa，经左心室插管引流灌注液。肺表面迅速呈粉红色→粉白色→白色，耗时5~10 min。此期间未用呼吸机支持呼吸，内置4 ℃ Celsior液2 h，此时肺组织为冷缺血状态，冷缺血2 h后，连接肺再灌注系统。氧合器自身循环升温至 37 ℃后，经上腔静脉插管进行温血热灌注，同时监测血气、肺动脉压等指标，连续灌注左肺2 h，于灌注后 30和120 min测量血气，120 min后取肺组织测定丙二醛含量及超氧化物歧化酶活性。
实验分组：将12只犬按随机数字表法分3组，每组4只。①模型组：即单纯的肺缺血再灌注组，手术前48 h，腹腔注射生理盐水20 mL，2次/d。②诱导剂组：手术前48 h腹腔注射氯化血红素，5 mg/（kg?d），2次/d。③抑制剂组：手术前48 h腹腔注射氯化血红素，5 mg/（kg?d），2次/d，肺离体灌注前，向灌注液加入ZnPPⅨ10 mg/L。
血气分析：呼吸机辅助呼吸，缺血再灌注后的30，120 min取动脉血检测血气。
丙二醛含量及超氧化物歧化酶活性测定：术后立即取小块肺组织，以9倍于肺组织体积的4 ℃生理盐水，迅速研磨肺组织，制成100 g/L的组织匀浆液， 3 000 r/min，10 min，取上清，测定丙二醛含量；再以生理盐水将组织匀浆液上清稀释至10 g/L，测定超氧化物歧化酶活性。
肺组织中血红素加氧酶1 mRNA水平检测：采用Trizol Reagent提取肺组织总RNA，经Super-ScriptTM preamplification System for First Strand cDNA Synthesis(Invitrogen)将RNA反转录成cDNA，步骤参见试剂盒说明书。以甘油醛-3-磷酸脱氢酶作为内参照。从GenBank钓取犬血红素加氧酶1及甘油醛-3-磷酸脱氢酶的cDNA序列，自行设计引物，血红素加氧酶1上游引物5’ GCCGAGTTCATGAAGAAC 3’，下游引物5’GAGCTGGGCAGGTCCAGG 3’，扩增产物长度 388 bp；甘油醛-3-磷酸脱氢酶上游引物5’ GCCAAAAGGGTCATCATCTC 3’，下游引物5’ GGGGCCATCCACAGTCTTCT3’，扩增产物长度 228 bp。反应体系：反转录产物1μL，2×PCR Mix 10μL，引物（5 μmol/L）1μL，H2O 8 μL。反应条件：94 ℃，30 s；60 ℃，30 s；72 ℃，30 s；退火温度由60 ℃降至51 ℃，每个循环退火温度降低1 ℃，共10个循环；再接以94 ℃，30 s；57 ℃，30 s；72 ℃，30 s；30个循环，结束反应。血红素加氧酶1与甘油醛-3-磷酸脱氢酶反应条件相同。聚合酶链反应产物10 g/L琼脂糖凝胶电泳后，经凝胶图像分析系统扫描测定DNA条带灰度值。
主要观察指标：各组犬肺组织中血红素加氧酶1 mRNA表达水平以及模拟移植后血气指标、肺动脉压、肺组织丙二醛含量和超氧化物歧化酶活性变化。
设计、实施、评估者：设计为第一作者，实施和评估为全体作者，均受过专业训练，实验过程未采用盲法评估。
统计学分析：统计学处理为第二作者，采用SPSS 10.0进行数据统计，所测数值用x(_)±s表述，采用t检验、单因素方差分析进行统计学处理，显著性水平定为α=0.05。

2.1 实验动物数量分析纳入犬12只，分为3组，全部进入结果分析，无脱失。
2.2 血红素加氧酶1的表达见图1。
如图1所示，诱导剂组、模型组和抑制剂组半定量反转录-聚合酶链反应结果灰度值分别为1.57±0.04，0.47±0.03，0.49±0.02，诱导剂组血红素加氧酶1 mRNA 表达水平高于模型组和抑制剂组（P < 0.01）。

如表1所示，模拟移植后，模型组、诱导剂组和抑制剂组肺动脉压均呈先增高后降低的趋势，模拟移植后 30 min左右肺动脉压达高峰，但无明显差异（P > 0.05）。
2.4 血气分析见表2。

如表2所示，犬肺模拟移植后30 min，各组间动脉血氧分压和动脉血二氧化碳分压差异均无显著性意义（P > 0.05）。但模拟移植后120 min，诱导剂组动脉血氧分压高于模型组和抑制剂组（P < 0.05），动脉血二氧化碳分压低于模型组和抑制剂组（P < 0.05）；模型组与抑制剂组动脉血氧分压和动脉血二氧化碳分压差异均无显著性意义（P > 0.05）。
2.5 超氧化物歧化酶活性及丙二醛含量见表3。

如表3所示，模拟移植后120 min，各组丙二醛含量均升高，诱导剂组低于模型组和抑制剂组（P < 0.05）；各组超氧化物歧化酶活性均下降，诱导剂组高于模型组和抑制剂组（P < 0.05）。
2.6 可能影响结果的因素分析动物例数偏少，可能会造成统计学上出现趋势偏差。

器官移植中供体器官由于缺血缺氧，通常于移植后发生不同程度的组织损伤，而液体复苏或侧支循环得代偿等可使循环得以改善，但血供恢复后使原有损伤加重。缺血再灌注损伤是器官移植后造成急性器官衰竭及延迟性器官功能障碍的重要原因，超氧化物歧化酶、维生素E、维生素C等都有一定拮抗作用，但都不能完全消除缺血再灌注对组织器官的影响。
血红素加氧酶1最早是由Tenhunen等[3]于1968年再动物肝脏微粒体中发现的，是血红素分解代谢的主要酶类。现有3种同工异构酶血红素加氧酶1、血红素加氧酶2、血红素加氧酶3，分别由不同基因所编码。血红素加氧酶1多分布于脾脏和肝脏，是诱导型酶，相对分子质量为32 000，又被称为热激蛋白32[4]。血红素加氧酶1是血红素降解的起始酶和限速酶，主要功能是代谢血红素形成胆绿素、一氧化碳和游离Fe2+[1-2]。目前认为血红素加氧酶1除能降解血红素外，尚有许多生物学作用，如胆绿素、胆红素均是体内强抗氧化剂[5]；一氧化碳是机体内源性一氧化碳的主要来源，具有扩张血管和抗血小板聚集的特性，可维持微循环稳定，它还是一种气体信使分子，在神经元信息传递和血管紧张度调节中起重要作用[6]；而Fe2+是体内具有多种生物学活性的金属离子，可减少活性氧的产生[7]。有研究表明，诱导血红素加氧酶1过表达可通过抗凋亡途径保护大鼠心脏组织抵御低温[8]。在缺血再灌注引起心肌梗死的动物模型中，高表达血红素加氧酶1的转基因鼠的梗死面积为14.7%，远低于野生型的56.5%，且心功能恢复较好[9]。
器官移植过程中缺血再灌注损伤引起细胞内外血红素来源增加，通过促进脂质过氧化及氧自由基形成而损伤细胞结构，最初认为血红素加氧酶1表达上调只是机体在应激后处理血红素化合物的细胞自净机制之一，如临床活体供肝移植结果显示，移植肝非实质细胞再灌注后血红素加氧酶1表达上调，表明缺血再灌注损伤可增加血红素加氧酶1表达[10]，但近来研究指出，血红素加氧酶1在器官移植方面具有保护功能。同种异体大鼠肾移植前给予钴原卟啉和环孢素A联合处理受鼠，术后发现受鼠肾皮质瘢痕，血管透明变性及内膜增厚均减轻，随钴原卟啉剂量加大，肾血管腔闭塞及肾小球硬化减轻，表明钴原卟啉诱导血红素加氧酶1表达能减轻肾移植的慢性排斥反应[10-12]。诱导供体血红素加氧酶1表达可以降低移植物免疫原性，利于诱导耐受，减轻移植后排斥反应发生[13]。用一种具有抗炎抗氧化损伤作用的多肽诱导受鼠血红素加氧酶1表达，能明显缓解心脏移植后受鼠血管内膜损伤[14]，减轻慢性排斥反应。用钴原卟啉诱导血红素加氧酶1过表达，能改善免疫抑制剂钠巴霉素对移植后的肾脏功能损害[15]，而且在肝脏切除术后，肝脏再生情况也好于未给予钴原卟啉的小鼠[16]。器官移植中受者血红素加氧酶1高表达有助于提高免疫耐受性及远期存活率[17]。在移植前6个月维持受者体内一氧化碳水平，可明显减轻大鼠移植肾功能丧失，移植前4 h诱导供鼠一氧化碳水平，也发现早期炎性基因表达下调，表明血红素加氧酶1分解产物一氧化碳也具有保护性作用[18]。供鼠脑死亡后，用钴原卟啉或锌原卟啉诱导或抑制血红素加氧酶1表达，受鼠在接受移植物后，生存率明显上升或下降[19]。虽然血红素加氧酶1的保护性作用主要多是通过预先诱导血红素加氧酶1高表达实现的，但是也有研究显示术前血红素加氧酶1低表达的肝脏在缺血再灌注后血红素加氧酶1上调更显著，术后肝功能情况也好于术前血红素加氧酶1高表达的肝脏[20]。
本实验通过制备犬离体肺模拟移植模型，模拟肺移植后的循环过程。发现给予血红素加氧酶1诱导剂氯化血红素，预先诱导血红素加氧酶1过表达，能够明显改善模拟移植后的犬肺功能，表现在诱导剂组动脉血氧分压明显高于模型组和抑制剂组，而动脉血二氧化碳分压则明显低于其他两组。结果表明血红素加氧酶1过表达具有保护模拟移植后犬肺功能的作用。肺动脉压是反映肺血管阻力的重要指标，移植肺恢复血供后，模型组、诱导剂组和抑制剂组肺动脉压均呈先增高后降低的趋势，模拟移植后30 min左右压力到达高峰，但无统计学差异。氧自由基是缺血再灌注损伤的主要病理生理机制之一，本实验通过观察超氧化物歧化酶活性和丙二醛含量的变化，来反映血红素加氧酶1对模拟移植过程中氧自由基的影响。结果提示，模拟移植后各组超氧化物歧化酶活性均减少，丙二醛含量均增加，但是诱导剂组较模型组和抑制剂组超氧化物歧化酶活性明显升高而丙二醛含量明显降低，表明血红素加氧酶1过表达可增强肺组织抵抗氧化应激损伤的能力。当然血红素加氧酶1在器官移植中的保护作用机制可能不仅仅表现在抗氧化损伤，近来发现血红素加氧酶1有抗细胞凋亡及抗炎性反应的作用，这是否是其改善移植器官功能的机制，还需进一步研究。

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