银杏叶提取物对大鼠胰岛细胞获取和冻存的影响**☆

宋焕瑾，薛武军，丁晨光，李杨，田晓辉，丁小明，冯新顺，田普训，项和立，靳占奎

课题背景：目前胰岛移植仍存在两大难题需要解决，其一，难以得到大量高纯度高活性的胰岛细胞；其二，移植物体内移植后引发的免疫排斥反应。国内外围绕胰岛移植的诸多研究均必须先进行胰岛分离纯化，虽然分离啮齿类动物胰岛细胞的方法建立较早，国内外学者也均在有关胰岛分离、纯化等方面做了大量的工作，但影响胰岛细胞分离的因素非常多，胰岛细胞的纯度及收获量仍难以同时达到理想目标。因此，获得大量、高纯度、有活性的胰岛细胞是进一步进行实验的基础。

应用要点：近年有关银杏叶提取物的研究及临床应用已有较大进展，除治疗心脑血管疾病外，银杏叶提取物还具有对糖尿病肾病的治疗作用。文章观察银杏叶提取物对大鼠胰岛细胞获取和冻存的影响，结果显示银杏叶提取物能够减少胰岛冻存复苏的损失，阻止胰岛细胞的凋亡，从而有利于胰岛数量和功能的保护。旨在为胰岛细胞的保存提供新的药物，同时也可以扩大该药的应用范围。

偏倚或不足：①选择偏倚：在大鼠的选择分组上可能出现选择偏倚，要保证两组大鼠在体质量、鼠龄等方面没有差别，严格控制入选标准，采取随机化的分组原则，避免选择偏倚的产生。②信息偏倚：由于测量仪器及方法的精确性造成的，应在实验中严格操作规程，使用同一批试剂及同一台仪器，减少误差的产生，实验人员需经过严格培训。

西安交通大学医学院第一附属医院肾移植科，陕西省西安市 710061

宋焕瑾☆，男，1971年生，陕西省咸阳市人，汉族，西安交通大学医学院在读博士，主治医师，主要从事器官移植临床及科研工作。
shjwnh@126.com

通讯作者：薛武军，教授，博士生导师，主任医师，西安交通大学医学院第一附属医院，陕西省西安市 710061 XW5886@pub.xaonline.com

国家自然科学基金资助项目[“GPx1-IRRS-KLK1转基因小鼠移植肾缺血损伤的保护机制研究”（30471640）*；“重建胰岛微环境的试验研究”（30571799）*]

摘要

背景：能否获取到足够的具有生物活性的胰岛细胞是影响胰岛细胞移植成功与否的主要原因之一，细胞冻存是收集足够胰岛的可行手段，但冻存复苏过程可引起细胞的凋亡。
目的：观察银杏叶提取物对大鼠胰岛获取及冻存后功能的影响。
设计、时间及地点：随机对照动物实验，于2007-10/12在西安交通大学医学院环境与疾病相关基因教育部重点实验室完成。
材料：选用成年SD大鼠40只用于分离提取胰岛细胞。
方法：按随机数字表法将40只大鼠分为2组（n=20），银杏叶提取物组取胰腺前经尾静脉注射银杏叶提取物25 mg/kg，获取胰岛后冻存，复苏后分别在含银杏叶提取物的培养基中培养3，7，14，21 d（n=5）。对照组尾静脉注射等量盐水，冻存、培养时间同银杏叶提取物组。
主要观察指标：电镜下观察胰岛细胞形态；应用原位末端标记法检测细胞凋亡情况；以免疫组化法检测Bcl-2表达。
结果：①银杏叶提取物组胰岛细胞复苏损失率明显低于对照组（P < 0.05）。②与对照组相比，银杏叶提取物组胰岛细胞复苏培养3 d时内分泌颗粒及酶原颗粒增多明显。③银杏叶提取物组复苏培养21 d后胰岛细胞仍可保持45%左右的存活率，对照组胰岛细胞存活率﹤35%，两组比较差异具有显著性意义（P < 0.05）。④复苏培养7，14 d，银杏叶提取物组胰岛细胞凋亡率低于对照组（P < 0.05），Bcl-2表达高于对照组（P < 0.05）。
结论：银杏叶提取物能够减少胰岛冻存复苏的损失，阻止胰岛细胞的凋亡，从而保护了胰岛细胞的活性。
关键词：胰岛/细胞学；银杏素；植物提取物；低温保藏；细胞移植

宋焕瑾，薛武军，丁晨光，李杨，田晓辉，丁小明，冯新顺，田普训，项和立，靳占奎.银杏叶提取物对大鼠胰岛细胞获取和冻存的影响[J].中国组织工程研究与临床康复，2008，12(18):3437-3440
[www.zglckf.com/zglckf/ejournal/upfiles/08-18/18k-3437(ps).pdf]

Extract of ginkgo biloba leaves influences the harvesting and cryopreservation of rat islet cells

BACKGROUND: A successful islet cell transplantation attributes to the harvesting of enough bio-active islet cells, and cryopreservation is a feasible way to collect islet cells, but cell apoptosis may occur in the procedure of cryopreservation and resuscitation.
OBJECTIVE: To explore the influence of the extract of ginkgo biloba leaves (EGB) on rat islet cells harvesting and function after cryopreservation.
DESIGN, TIME AND SETTING: A randomized control animal study was performed in the Key Laboratory of Environment and Genes Related to Diseases (Xi'an Jiaotong University Medical College), Ministry of Education from October to December in 2007.
MATERIALS: Forty male SD rats were used in this study to isolate islet cells.
METHODS: Forty rats were divided into 2 groups at random (n=20). In EGB group, rats were injected with 25 mg/kg EGB via tail vein, and the islet harvesting was performed. Next, the islet cells were cultured in EGB-containing medium for 3, 7, 14 and 21 days (n=5) after cryopreservation and resuscitation. In control group, an intravenous injection of equal volume of saline was given, followed by the same time of cryopreservation and resuscitation in EGB group.
MAIN OUTCOME MEASURES: Cell morphology under electron microscopy; Detection of apoptosis by terminal dUTP nick end labeling (TUNEL); Immunohistochemical detection of Bcl-2 expression.
RESULTS: ①The loss rate of cells after resuscitation in the EGB group was obviously lower than that in the control group (P < 0.05).②Compared with the control group, the endocrine particles and zymogen granules increased more significantly in the EGB group after islet cells were cultured for 3 days.③After 21 days of resuscitation culture, 45% of islet cells in EGB group survived, while the survival rate of cells in the control group was less than 35%, there were significant differences between the two groups (P < 0.05).④After 7 and 14 days of resuscitation culture, the rate of apoptosis in the EGB group was less than that in the control group (P < 0.05), whereas Bcl-2 expression were increased (P < 0.05).
CONCLUSION: EGB can reduce the cell loss after cryopreservation and resuscitation, prevent the cells from apoptosis, so as to protect the activity of islet cells.

Song HJ, Xue WJ, Ding CG, Li Y, Tian XH, Ding XM, Feng XS, Tian PX, Xiang HL, Jin ZK.Extract of ginkgo biloba leaves influences the harvesting and cryopreservation of rat islet cells.Zhongguo Zuzhi Gongcheng Yanjiu yu Linchuang Kangfu 2008;12(18):3437-3440 [www.zglckf.com/zglckf/ejournal/upfiles/08-18/18k-3437(ps).pdf]

胰岛移植自20世纪70年代中期始引起了国内外学者的关注，但其效果仍然不够理想，移植成功1年以上的比例只有6%~8%[1-2]。主要原因是胰岛分离纯化后必须有足够数量的活性胰岛细胞、移植后的免疫排斥反应以及免疫抑制剂对胰岛细胞的毒性作用。细胞冻存是收集足够胰岛、建立胰岛库的可行手段，但冻存复苏过程可引起细胞的凋亡，使细胞数量和活性及功能大大降低。近年有关银杏叶提取物的研究及临床应用已有较大进展；除治疗心脑血管疾病外，银杏叶提取物还具有保护神经系统、抗神经细胞凋亡以及对糖尿病肾病的治疗作用[3]。本课题旨在验证银杏叶提取物对胰岛获取及冻存前后存活及功能的保护作用，并分析其作用机制。

设计：随机对照动物实验。
单位：西安交通大学医学院环境与疾病相关基因教育部重点实验室。
材料：实验于2007-10/12在西安交通大学医学院环境与疾病相关基因教育部重点实验室完成（BSL-3）。选用成年SD大鼠40只，雌雄不限，体质量200~250 g，鼠龄8~10周，由西安交通大学医学院实验动物中心提供（许可证号：医动自207-001）。原位末端标记试剂盒购自武汉博士的生物工程公司，灵敏度96%，批内变异系数5.2%；批间变异系数8.6%。对动物处置方法符合动物伦理学要求。
设计、实施、评估者：实验设计、实施均为本文作者，评估为通讯作者，均经过正规培训。
方法：
实验分组：按随机数字表法将40只大鼠分为2组（n=20），即对照组及银杏叶提取物组。银杏叶提取物组取胰腺以前30 min预处理，经尾静脉注射银杏叶提取物25 mg/kg，胰岛获取后冻存28 d，复苏后胰岛分别培养于含银杏叶提取物（3 mmol/L终浓度）的培养基中3，7，14，21 d（n=5）。对照组尾静脉注射等量盐水，冻存、培养时间同银杏叶提取物组。
胰岛细胞的分离和纯化：分离和纯化[4-5]；冻存和复苏[6]。将大鼠腹腔麻醉，剖腹，暴露胆总管，丝线结扎胆总管入十二指肠处，破心放血处死，胆总管内插管，行灌注0.5 g/L胶原酶V 10 mL，迅速分离已膨胀胰腺，38 ℃水浴振荡10 min，取出，冰浴中撕碎，清除脂肪、管道组织，继续38 ℃水浴振荡10 min后，4 ℃ D-hanks液终止消化，吸取上层细胞悬液。未消化组织加入胶原酶V继续消化。收集所有消化液，500 μm筛网过滤，D-hanks液离心洗涤3遍，沉淀物制成悬液。10 mL离心管中，依次加入250，200，110 g/L Ficoll分离液、胰岛悬液各2 mL，3 000 r/m离心20 min，分层, 吸出各界面细胞，D-Hanks液离心洗涤3 遍，悬浮于RPMI1640培养液(含100 U/mL青霉素、100 mg/L链霉素、20 mmol/L HEPES、体积分数为0.15的小牛血清)中，37 ℃、体积分数为0.05的CO2培养箱培养，隔日换液。
胰岛计数、活性和功能检测：胰岛计数、活性检测见文献[4]；双硫腙配制方法：将100 mg
双硫腙溶于10 mL 二甲亚砜溶液中，过滤分装，贮存在-20 ℃。常规染色时每1 mL胰岛细胞悬液加10 μL贮存液，37 ℃孵育10 min，胰岛呈红色或猩红色。显微镜下对阳性细胞团进行计数，通过镜检胰岛悬液中胰岛数量与外分泌组织量之比来估计纯度。锥虫蓝以0.01 mol/L磷酸盐缓冲液(pH 7.4)配制成4%母液，4 ℃保存，使用时用0.01 mol/L磷酸盐缓冲液稀释成0.4%工作液，9滴细胞悬液加1滴4 g/L锥虫蓝溶液混匀于试管中，5 min内计数蓝染的死细胞和拒染的活细胞，随机取3个视野计数，取平均值计算胰岛活度。
胰岛离心戊二醛固定，作超薄切片，电镜下观察；原位末端标记法检测细胞凋亡情况、免疫组化法检测Bcl-2表达。
主要观察指标：两组冻存复苏培养的胰岛细胞形态、胰岛存活率、胰岛素刺激指数及胰岛凋亡率。
统计学方法：由本文作者应用SPSS 10.0统计软件进行数据处理，结果以x(_)±s表示，采用卡方检验。

2.1 实验动物数量分析 40只大鼠全部进入结果分析，无脱失。
2.2 胰岛冻存复苏率银杏叶提取物组胰岛冻存复苏率明显低于对照组[(14.0±0.7%)，（25.0±0.4）%，P < 0.05)。
2.3 两组冻存复苏培养胰岛存活率比较见表1。

2.4 胰岛素刺激指数培养7，14 d，对照组胰岛素刺激指数分别为3.14±0.14和2.98±0.17，均低于银杏叶提取物组（5.15±0.41，5.15±0.41）（P < 0.05）。
2.5 电镜观察结果银杏叶提取物组胰岛复苏3 d内分泌颗粒相对较多，线粒体增多，线粒体嵴无明显变化，核结构相对完整，酶原颗粒增多；对照组胰岛细胞有早期凋亡特征，酶原颗粒减少，见图1。
2.6 胰岛凋亡率比较见表2。
如表2所示，复苏培养7，14 d银杏叶提取物组胰岛凋亡率低于对照组（P < 0.05），Bcl-2表达高于对照组（P < 0.05）。

胰岛细胞移植作为一种潜在的可治愈糖尿病的治疗方法，近年来更取得了突破性进展[7]。能否获取到足够的具有生物活性的胰岛细胞是影响胰岛细胞移植成功与否的主要原因之一[8]，但是在胰岛细胞的分离纯化过程中，胰岛细胞也必然要经过一个缺血再灌注损伤过程，缺血再灌注损伤是引起组织器官无功能的重要原因之一，移植物的破坏是一个复杂的多因素过程，其中包括特异性免疫过程（即急性和慢性排斥反应）和特异性过程。它与移植物早期和晚期的存活都有关。氧自由基的生成和钙超载是引起缺血再灌注损伤的两个主要因素：①氧自由基[9]：缺血时血管内皮细胞的黄嘌呤脱氢酶转变为黄嘌呤氧化酶，同时低温时，ATP降解为ADP，AMP及次黄嘌呤。无氧时，黄嘌呤氧化酶活性很低，在再灌注过程中一旦得到氧的供应，黄嘌呤氧化酶的活性增加，次黄嘌呤很快被氧化，而且在灌注前组织中也聚集了大量的次黄嘌呤，从而产生大量的超氧阴离子。另外，缺氧、ATP减少及钙进入线粒体增多等，使线粒体功能受损，致使线粒体内单价还原产生的氧自由基增多。氧自由基的直接毒性作用是：氧化浆膜，改变膜的通透性；氧化含筑基的酶，使酶失去活性；氧化核酸，使DNA断链。其间接损伤作用是氧化生物膜的不饱和脂肪酸，使之发生脂质过氧化反应，形成脂质过氧化物。②钙超载[10-11]：缺氧时，细胞内ATP不断减少，Na+-K+-ATP酶活性降低，细胞不能维持适当的阳离子，导致细胞内Na+浓度增高，从而激活细胞膜上的Na+/Ca2+换蛋白。再灌注时细胞内Na+逸出细胞，而细胞外Ca2+进入细胞内，使细胞内Ca2+增多，引起钙超载。Ca2+浓度增高可损害线粒体功能，导致氧化磷酸化过程障碍，致使ATP生成减少。同时，钙超载还可以使磷脂酶、蛋白酶激活，导致细胞的不可逆损伤。细胞内钙超载还可以促进氧自由基的产生，加重细胞的损伤。
近年有关银杏叶提取物的研究及临床应用已有较大进展[12]，除治疗心脑血管疾病外，银杏叶提取物还具有对糖尿病肾病的治疗作用[13]。银杏叶提取物（舒血宁）含有黄酮甙类、银杏内酯、白果内酯等成分，黄酮甙类具有清除自由基和抗脂质过氧化作用，银杏叶对抗自由基和抗脂质过氧化作用主要是由于中心吡喃环的C2-C3双键和β环邻位羟基的存在[14]。黄酮类中的槲皮素能有效抑制氧自由基，其作用与抑制黄嘌呤氧化酶的活性有关，而非银杏黄酮类的抗氧化作用可能与清除氧自由基有关。银杏叶提取物中的有效成分银杏内酯B对神经元和雪旺细胞有营养和保护作用，可能与清除氧自由基有关。银杏内酯B是天然血小板活化因子的拮抗剂，能强烈对抗血小板活化因子，从而抑制血小板聚集，降低血液粘度，减少血栓的形成，减少血管紧张素的渗透。银杏总黄酮对血管紧张素转换酶活性有明显抑制作用，能刺激儿茶酚胺释放并抑制其降解，同时刺激前列环素和内皮舒张因子的生成，增加血管平滑肌中的含量，从而结抗内皮素和血栓素缩血管作用，扩张血管，增加血流量。有学者用银杏叶提取物预处理大鼠胰腺后进行胰腺移植发现胰腺组织bax基因低表达，bcl-2基因高表达，bax/bcl-2比值高于缺血再灌注组，提示银杏叶提取物还可以通过上调bcl-2和下调bax基因表达来减少移植胰细胞凋亡，从而起到保护移植胰的作用。可能机制是提高超氧化物歧化酶的活性、增加内源性一氧化氮的合成、减少肿瘤坏死因子α分泌、减轻中性粒细胞黏附与聚集、上调bcl-2和下调bax基因表达。有人采用MTT检测细胞存活率，染色荧光显微镜观察细胞形态变化，PI单染色法和双染色法流式细胞术分析细胞凋亡情况，发现过氧化氢可诱导胰岛RN-mβ细胞凋亡，EGb761对H2O2诱导的RN-mβ细胞损伤和凋亡具有明显的保护作用。有学者将胰岛细胞在含有丹参的培养基中培养后发现，应用丹参能增加胰岛的产量，减轻冻存对胰岛的损害，保持胰岛的活性，从而阻止胰岛的凋亡。
本实验结果表明，银杏叶提取物组复苏损失率明显低于对照组（P < 0.05），具有显著性差异；复苏培养 21 d后仍然可保持45%左右的存活率，而普通冻存的胰岛存活率则小于35%，具有显著性差异（P < 0.05），说明银杏叶提取物在分离纯化过程中具有减少胰岛细胞损失的作用；而对照组刺激指数低于银杏叶提取物组（P < 0.05），这说明银杏叶提取物具有保护胰岛细胞的活性的作用。银杏叶提取物组凋亡百分率低（P < 0.05），而Bcl-2高表达（P < 0.05），且表达Bcl-2的细胞与原位末端标记法检测分布区域相反。另外从电镜下观察到的结果提示，银杏叶提取物组胰岛复苏3 d内分泌颗粒相对增多，线粒体也增多，而且核的结构相对完整，对照组胰岛细胞凋亡小体明显增多，这也说明银杏叶提取物能够减轻胰岛细胞的凋亡，从而达到保护胰岛细胞的作用。
因此，作者认为应用银杏叶提取物可以增加胰岛产量，减少胰岛冻存复苏的损失，减轻冻存对胰岛细胞的损害，保护胰岛细胞的活性，阻止胰岛细胞的凋亡，从而有利于胰岛数量和功能的保护。

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