膀胱无细胞基质移植物重建兔阴茎白膜**☆

孙发1，杨宇如2，魏强2，卢一平2，李虹2，韩平2，宋超2，石家齐1，谷江1

课题背景：课题为贵州省省长基金（黔省专合字[2007]70号）和贵州省科技厅基金（黔科合J字[2007]2106号）重点资助项目。目前阴茎白膜修复材料会导致瘢痕收缩、硬件形成、弯曲复发等不足。膀胱黏膜无细胞基质是膀胱黏膜下层脱细胞后获得的无细胞而富含胶元的生物材料，已用于修复动物膀胱、尿道的研究。课题拟自制兔膀胱无细胞基质，构建新西兰兔阴茎白膜缺损膀胱无细胞基质移植物覆盖模型，以寻找理想的白膜修复材料。

应用要点：实验应用膀胱细胞外基质重建新西兰兔阴茎白膜，结果表明膀胱无细胞基质移植物修复阴茎白膜后，有较好的组织相容性，未出现明显的炎症反应和纤维化，有较好的研究前景。

偏倚或不足：实验样本量偏小，实验对象为小型动物，今后在增大样本量，逐渐完善其代谢、毒理作用以及临床前动物实验的前提下，可考虑进一步申请伦理学等临床相关审核批准，进行人体白膜重建，以期真正达到临床应用标准。

1贵阳医学院附属医院泌尿外科，贵州省贵阳市 550004；2四川大学华西医院泌尿外科，四川省成都市 610041

孙发☆，男，1969年生，贵州省六盘水市人，汉族，博士，副主任医师，硕士生导师，主要从事男性、泌尿系统组织工程的研究。
sfguizhou@163.com

贵州省省长基金（黔省专合字[2007]70号） “脱细胞外基质纠正阴茎弯曲、治疗阴茎痛性勃起的实验研究”*，贵州省科学技术基金（黔科合J字[2007]2106号），“膀胱无细胞移植物重建同种异体兔阴茎柏膜的研究”*

背景：阴茎弯曲的矫正需用材料替代缺损的白膜或增大病变处白膜，目前的白膜替代材料没有达到理想的效果，国外学者开始考虑用脱细胞的细胞外基质重建阴茎白膜。
目的：应用膀胱无细胞基质移植物重建新西兰兔阴茎白膜，动态观察其重建效果。
设计、时间及地点：随机对照动物实验，于2005-12/2007-06在四川大学华西实验动物中心、四川大学组织工程实验室及贵阳医学院组织工程实验室完成。
材料：选用健康封闭新西兰兔50只，均为雄性，体质量2.6~3.0 kg，10只新西兰兔用于膀胱无细胞移植物的制备。
方法：将剩余40只兔按随机数字表法分为对照组和膀胱无细胞基质移植物组（n=20），在阴茎背侧切除白膜造成10 mm×5 mm缺损，分别采用白膜原位缝合及膀胱黏膜无细胞基质修复。
主要观察指标：分别于术后2，6，12和24周，每个时间点取5只动物进行阴茎海绵体内快速注射生理盐水诱导阴茎勃起，观察阴茎弯曲情况；然后处死动物术区取材，进行苏木精-伊红、Masson和Stirus染色，检测炎性标志因子诱导型一氧化氮合成酶和促纤维化因子转化生长因子β1的表达；应用图像采集系统测量胶原纤维的面积。
结果：①术后6周时弯曲发生率最高，以后逐渐减少，到24周只有对照组发生弯曲1例。②术后2周时，Ⅰ型和Ⅲ型胶原纤维共同存在，比例相当；以后Ⅰ型胶原纤维逐渐增加(P < 0.05)，Ⅲ型胶原纤维逐渐减少(P < 0.05)；到24周以Ⅰ型胶原纤维为主，Ⅲ型胶原纤维已不明显。③诱导型一氧化氮合成酶和转化生长因子在术后2周时表达最强，6周时表达明显下降。
结论：膀胱黏膜无细胞基质移植物修复新西兰兔阴茎白膜显示了良好的组织相容性，未出现明显的炎症反应和纤维化，是较为理想的阴茎白膜修复材料。
关键词：移植物；阴茎；膀胱；生物相容性材料；疾病模型，动物

孙发，杨宇如，魏强，卢一平，李虹，韩平，宋超，石家齐，谷江．膀胱无细胞基质移植物重建兔阴茎白膜[J].中国组织工程研究与临床康复，2008;12(18):3441-3445 [www.zglckf.com/zglckf/ejournal/upfiles/08-18/18k-3441(ps).pdf]

中图分类号:R617
文献标识码:A
文章编号: 1673-8225
(2008)18-03441-05

BACKGROUND：Penile curvature can be corrected with the materials to substitute the tunica albuginea defect or enlarge the affected tunica albuginea. At present, no ideal substitute material has been found, so the scholars overseas consider reconstructing tunica albuginea with the acellular extracellular matrix.
OBJECTIVE: To conduct a dynamic observation of the reconstruction of tunica albuginea in New Zealand rabbits with bladder acellular matrix grafts.
DESIGN, TIME AND SETTING: From December 2005 to June 2007, a randomized controlled animal experiment was carried out in the West China Experimental Animal Center and the Tissue Engineering Laboratory of Sichuan University, as well as the Tissue Engineering Laboratory of Guiyang Medical College.
MATERIALS: Fifty New Zealand male rabbits were adopted, weighing 2.6-3.0 kg, and 10 of them were used for the preparation of bladder acellular grafts.
METHODS: The other 40 rabbits were at random divided into control group and bladder acellular matrix graft group, with 20 animals in each group. A defect area of 10 mm × 5 mm was induced in those rabbits, and repaired with orthotopic suture of tunica albuginea or bladder acellular matrix grafts, respectively.
MAIN OUTCOME MEASUERS: At postoperative weeks 2, 6, 12 and 24, an penile erection was induced by a rapid intracavernosal injection with saline into 5 rabbits at each time point, to observe penile curvature; Then rabbits were sacrificed, followed by hematoxylin-eosin, Masson and sirius red stain. Protein expression of the inflammatory markers inducible nitric oxide synthase (iNOS) and transforming growth factor-β1 (TGF-β1) was evaluated; Image collection system was used to measure the area of collagen fiber.
RESULTS: The incidence of penile deviation was the highest at 6 weeks and then reduced gradually, and only 1 case of slight penile deviation was observed in control group at 24 weeks. Collagen Ⅰ and Ⅲ occupied equally the grafting site 2 weeks postoperatively; After that, the collage Ⅰ increased evidently (P < 0.05) and collagen Ⅲ decreased gradually (P < 0.05). Collagen Ⅰ occupied mostly the grafting site at 24 weeks, while collagen Ⅲ was not observed. Expression of iNOS and TGF-β1 was the highest at 2 weeks and precipitously decreased at 6 weeks.
CONCLUSION: The bladder acellular matrix grafts demonstrate good histocompatibility in the repair of tunica albuginea in New Zealand rabbits, does not stimulate significant inflammatory response or cause fibrosis, so it is an ideal material for the tunica albuginea repair.

Sun F, Yang YR, Wei Q, Lu YP, Li H, Han P, Song C, Shi JQ, Gu J. Bladder acellular matrix grafts for reconstructing tunica albuginea in rabbits.Zhongguo Zuzhi Gongcheng Yanjiu yu Linchuang Kangfu 2008;12(18):3441-3445(China)
[www.zglckf.com/zglckf/ejournal/upfiles/08-18/18k-3441(ps).pdf]

尿道下裂、先天性阴茎发育不良等阴茎病变会导致阴茎痛性勃起，导致性交困难。阴茎弯曲的矫正需用材料替代缺损的白膜或增大病变处白膜，目前研究的白膜替代材料没有达到理想的效果，国外学者开始考虑用脱细胞的细胞外基质（如猪小肠黏膜下层）重建阴茎白膜。膀胱无细胞基质移植物在动物膀胱扩大实验中已经取得了满意的效果，本实验应用膀胱无细胞基质移植物重建新西兰兔阴茎白膜，动态观察其重建效果。

设计：随机对照动物实验。
单位：贵阳医学院附属医院泌尿外科。
材料：本实验于2005-12/2007-06在四川大学华西实验动物中心（省级）、四川大学组织工程实验室（国家级重点实验室）及贵阳医学院组织工程实验室（省级）完成。选用健康封闭新西兰兔50只，兔龄六七个月，均为雄性，体质量2.6~3.0 kg，由四川大学华西实验动物中心提供（许可证号：SCHX，川：2005-2007）。对动物处置方法符合动物伦理学要求。
设计、实施、评估者：设计、实施、评估均为本文作者，均经过正规培训。
方法：
实验动物分组和排除标准：将40只新西兰兔按随机数字表法分为对照组和膀胱无细胞基质移植物组，每组20只，凡包茎，阴茎发育不良或者注射生理盐水后阴茎弯曲者均予以排除。
膀胱无细胞基质移植物制备方法：选用10只新西兰兔用于膀胱无细胞移植物的制备。①取出兔的膀胱，内外翻转，刮除黏膜层，反复漂洗，在50 mL磷酸盐缓冲液(PBS，pH 7.0， 10 mmol/L)和1 g/L叠氮钠的混合液中搅拌五六小时，使细胞溶解，以去除基底膜和逼尿肌。②用PBS漂洗，在50 mL 1 mol/L NaCl溶液(含脱氧核糖核酸酶2 000 kU)中搅拌6~8 h，使细胞彻底溶解，细胞组分完全释放。③在50 mL含40 g/L脱氧胆酸钠和1 g/L叠氮钠的混合液中搅拌五六小时，使细胞膜脂质双层和细胞内的膜脂质溶解。④重复第3步骤制成膀胱无细胞基质移植物，用大量双蒸水反复漂洗，置入含青霉素(1×105 IU/L)和链霉素(100 mg/L)两种抗生素的PBS溶液中，4 ℃冰箱内保存，然后批量冻干、封装、环氧乙烷消毒，保存备用。
阴茎重建手术：仰卧固定新西兰兔，剔除术区毛发，络合碘消毒，铺巾，50 g/L水合氯醛腹腔内注射，阴茎根部扎止血带，头皮针经龟头穿刺进入阴茎海绵体，快速注射生理盐水证实在勃起状态下无弯曲，切开阴茎背侧中线皮肤逐层分离致白膜，于背侧尖刀完整切除白膜10 mm×5 mm。对照组将切除的白膜5/0无损伤血管线原位缝合；膀胱无细胞基质移植物组11 mm×6 mm大小膀胱无细胞基质移植物覆盖缺损并缝合（防止材料收缩），术后兔子分笼饲养并观察。
阴茎弯曲度观察：分别在术后2，6，12和24周快速推注生理盐水，每个时间点5只，观察阴茎有无弯曲。
不同时间点术区大体和镜下观察：分别在术后2，6，12和24周，每个时间点5只，耳缘静脉注射空气处死动物，分离阴茎白膜，切移植部位修剪，以体积分数为0.1的甲醛固定，石蜡包埋，切片，行苏木精-伊红、Masson和Sirius染色。
诱导型一氧化氮合成酶和转化生长因子
β1蛋白表达：按免疫组化染色的SABC法进行，实验中与BPS代替一抗作阴性对照。
图像采集：普通切片用Nickon spotcoolCCD采集图像，Stirus染色用日本NIKON公司偏振光显微镜eclipse ME600型ACT-1图像采集系统采图。
分析胶原纤维的面积：行天狼星红染色，图像经灰度变换将阳性染色与背景分开进行自动测量，每张切片随机选择5个不重叠视野每视野（×50）观测Ⅰ型和Ⅲ型胶原纤维阳性面积的相对值，取平均值作为每张切片各型纤维的阳性面积。
主要观察指标：重建术后阴茎弯曲情况、白膜胶原纤维的构成及诱导型一氧化氮合成酶、转化生长因子β1的表达。
统计学方法：由第一作者采用SPSS 10.0统计软件进行数据处理，数据以x(_)±s表示，进行t检验，P < 0.05为差异有显著性意义。

2.1 实验动物数量分析对照组和膀胱无细胞基质移植物组共40只动物全部进入结果分析。
2.2 大体标本观察结果膀胱无细胞基质移植物呈纯白色，膜状，半透明。术后2周时，两组移植部位瘢痕明显；6，12周瘢痕逐渐变小，白膜和海绵体的结构清晰；24周时修复部位白膜完整边界光滑均匀，与正常白膜不能区分，术后各时间点两组无明显差别。
2.3 组织学观察结果
2.3.1 苏木精-伊红染色和Masson 3色染色结果术后2周时两组修复部位结构欠清，炎性细胞浸润明显，膀胱无细胞基质移植物组移植部位可见膀胱无细胞基质移植物内细胞生长，见图1；Masson 3色染色显示术区白膜纤维纤细，排列欠规律，见图2。6周时白膜恢复完整性，膀胱无细胞基质移植物不能辨别，两组间无差异；24周时，移植部位白膜完整均匀，纤维恢复内环外纵排列，和正常白膜不能区别，见图3。

如表1所示，术后2周时，Ⅰ型和Ⅲ型胶原纤维共同存在，比例相当，见图4，以后Ⅰ型胶原纤维逐渐增加，而Ⅲ型胶原纤维逐渐减少，到24周以Ⅰ型胶原纤维为主，Ⅲ型胶原纤维已不明显，见图5。同组同种纤维成分，在不同时间点比较差异明显(P < 0.05)；而在同时间点同种纤维成分，两组间无明显差异(P > 0.05)。
2.4 免疫组化观察结果诱导型一氧化氮合成酶和转化生长因子β1在细胞中的表达呈棕黄色颗粒样分布于细胞胞浆。在术后2周时表达最强，见图6；6周时只有少数纤维细胞和血管内皮细胞有表达，12，24周仅有极少的血管内皮细胞表达诱导型

2.5 阴茎弯曲观察结果术后6周时弯曲发生率最高，对照组2例，膀胱无细胞基质移植物组1例；12周时对照组1例，膀胱无细胞基质移植物组1例；24周时对照组发生弯曲1例，膀胱无细胞基质移植物组无弯曲发生。
2.6 可能影响结果的因素分析膀胱无细胞外基质修复阴茎白膜的实验尚属首次，本实验样本量偏小，可能对实验结果有一定影响。

尿道下裂、先天性阴茎发育不良等阴茎病变常并发阴茎痛性勃起，导致性交障碍。阴茎弯曲矫正须增大或重建病变处白膜，可选用材料包括自体组织（如真皮、睾丸鞘膜、阔筋膜、和大隐静脉）[1-4]、异体组织（如人和动物心包[5-7]）以及人工合成材料[8]。自体修复材料的取材会造成另一部位损伤，而且修复材料随时间推移会出现疤痕收缩，从而导致阴茎弯曲复发；尸体组织和人工材料均有明显瘢痕收缩、硬结形成等不足。随着近年来组织工程学的发展，有学者考虑用细胞外基质作为阴茎白膜的修复重建材料，如猪小肠黏膜下层等。
膀胱无细胞基质移植物是自膀胱解剖出其黏膜下层经脱细胞后获得的无细胞而富含胶元的生物材料，电镜下可见其表面呈空隙样结构，和人工合成的多聚物相比，膀胱无细胞基质移植物中含有一些利于细胞生长的细胞因子，其提供的环境和纤维排列构架利于细胞生长和分化、组织形成。膀胱无细胞基质移植物已经成功用于替代动物膀胱、尿道和修复尿道下裂[9-16]，国内外未见膀胱无细胞基质移植物重建阴茎白膜的报道。
Piechota等[16]对仓鼠、兔和狗进行膀胱无细胞基质移植物异种移植，未出现免疫排斥反应，认为膀胱无细胞基质移植物是无免疫原性的细胞外基质，有良好的组织相容性[17]，Kaibafzadeh等[18]研究发现膀胱无细胞基质移植物能使种植细胞很好生长，膀胱无细胞基质移植物移植后可见术区血管内皮生长因子高表达，从而促进膀胱功能的恢复[19]。Fu等[20]将尿道上皮细胞种植在膀胱无细胞基质移植物上重建尿道，术后效果良好。本实验发现术后2周时，膀胱无细胞基质移植物组和对照组术区均有轻度瘢痕形成，炎症细胞稍多，此后，瘢痕逐渐消退，24周时移植部位白膜结构和正常白膜不能区分；炎性标志因子诱导型一氧化氮合成酶和促纤维化因子转化生长因子β1亦在2周时表达最强，此后表达不明显，两组没有明显差异，表明膀胱无细胞基质移植物重建白膜修复过程和白膜自体材料修复相似，仅表现创伤的修复过程，膀胱无细胞基质移植物修复阴茎白膜没有刺激组织出现明显的炎症反应和纤维化，具有良好组织相容性。
本实验还发现，在白膜修复过程中，两组纤维成分变化也极为相似，早期由Ⅰ型和Ⅲ型胶原纤维组成，比例相当，随着时间推移，组织开始增生和塑形，纤细的Ⅲ型纤维逐渐被粗大Ⅰ型胶原纤维所代替，纤维的排列方向也和功能相适应，呈内环外纵排列。上述纤维的组成和排列特点可能与白膜在阴茎勃起状态下所承受的压力相适应。
国外研究结果显示，膀胱无细胞基质移植物替代大鼠膀胱术后10 d可见到移植物内有细胞长入，20周时，黏膜和膀胱逼尿肌和正常膀胱壁一样，而且血管化程度很高，并有神经生长[11]，Urakanmi等[21]应用膀胱无细胞基质移植物行大鼠膀胱扩大，发现术后8周组织学检测，BAMF完全被正常膀胱组织替代。本实验中，在2周时，部分标本上可见膀胱无细胞基质移植物存在，并有炎性细胞和纤维母细胞生长，12周后膀胱无细胞基质移植物被纤维组织替代，表明膀胱无细胞基质移植物重建阴茎白膜，在12周内基本降解，主要起到细胞支架的作用，术区白膜形成可能由周围的细胞爬行、增殖分化所致，与重建膀胱报道相似。
作者已往研究表明，膀胱无细胞基质移植物电镜观察纤维排列呈网状结构，能承受多向应力，最大应力（8.87±1.51）mPa，最大应变为38.60±34.83。本实验认为，膀胱无细胞基质移植物网状结构特点重建阴茎白膜可能会有下列优势：一是为细胞的增殖、生长提供了较好三维支架；第二，网状结构适合承受多方向的应力，海绵体在勃起状态，应力是多轴的，实验中无移植物破裂发生。本实验为小动物模型、样本量小，该方面还有待进一步的研究。
通过海绵体注水实验观察，随着时间延长，阴茎弯曲的发生率逐渐降低；实验组和对照组没有显著区别，可能在修复初期，肉芽组织长入海绵体形成较大纤维瘢痕，导致海绵体充盈不全，加之白膜瘢痕的存在，白膜局部伸展受限，阴茎勃起状态白膜伸展的不对称性而造成弯曲的发生。随着阴茎白膜和海绵体内瘢痕的吸收，白膜和海绵体的顺应性恢复，阴茎弯曲发生率减少。
尽管以往没有膀胱无细胞基质移植物重建阴茎白膜的研究，本实验通过与对照组比较，膀胱无细胞基质移植物重建阴茎白膜后，没有刺激组织出现明显的免疫反应，也没有出现局部明显纤维化；其网状的结构特点不但形成了很好的细胞生长支架，也可能对承受白膜勃起状态下多轴应力有其独特的优势，作者认为，膀胱无细胞基质移植物是一种有研究前景的阴茎白膜修复重建材料。

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