膀胱逼尿肌细胞与Cajal间质细胞结构和功能联系的实验研究*☆

丁砺蠡，方强，封建立，宋波

课题背景：近年来发现，膀胱组织中存在着在与在胃肠道发挥起搏功能类似的Cajal间质细胞，该细胞具有起搏细胞的基本电活动特点，所以认为该细胞极可能就是膀胱的起搏细胞，它在生理情况下受神经调控，而某些病理条件下则可能导致膀胱功能的异常。但当前对膀胱Cajal间质细胞起搏的研究处于起步阶段，关于起搏机制的研究尚有许多未知领域有待探索。

应用要点：膀胱逼尿肌细胞与Cajal间质细胞在结构和功能上的联系可以从一个方面证明Cajal间质细胞是否具有起搏细胞地位。实验利用超微形态学和细胞水平的信号通讯研究，设计了一种新的研究模式，可以应用于对起搏细胞的进一步研究中。结果显示逼尿肌细胞与Cajal间质细胞之间存在结构上的联系，Cajal间质细胞可以将兴奋信号传递给周围的逼尿肌细胞。

偏倚或不足：细胞间信号通讯的研究仅限于培养细胞水平，难以完全模拟在体水平的细胞通讯。

解放军第三军医大学西南医院全军泌尿外科研究所，重庆市 400038

丁砺蠡☆，男，1978年生，安徽省怀宁县人，汉族，解放军第三军医大学在读博士，主治医师，主要从事膀胱功能障碍方面的研究。
dingdan7719@yahoo.com.cn

通讯作者：宋波，博士，教授，博士研究生导师，解放军第三军医大学西南医院全军泌尿外科研究所，重庆市 400038 Bo_song@sina.com

全国自然科学基金资助项目（30672093）“膀胱起搏细胞及起搏点部位研究”*

摘要

背景：膀胱运动的效应细胞是逼尿肌细胞，而膀胱Cajal间质细胞如能在膀胱运动中作为起搏细胞而存在，必须能对逼尿肌细胞进行调控。因此，二者在结构和功能上的联系可以从一个方面证明Cajal间质细胞是否具有起搏细胞地位。
目的：观察膀胱逼尿肌细胞与Cajal间质细胞结构和功能上的联系，分析膀胱Cajal细胞在逼尿肌细胞兴奋调控中的作用。
设计、时间及地点：观察对比实验，于2007-04/10在解放军第三军医大学基础部中心实验室完成。
材料：选用SD大鼠用于取膀胱逼尿肌新鲜组织块。
方法：应用透射电镜观察Cajal间质细胞和逼尿肌细胞之间的超微结构联系；利用荧光漂白技术模拟信号从Cajal间质细胞传递到逼尿肌细胞的过程，观察Cajal间质细胞与逼尿肌细胞之间的信号交流情况。
主要观察指标：Cajal间质细胞和逼尿肌细胞之间的超微结构联系及荧光强度变化。
结果：①Cajal间质细胞和逼尿肌细胞之间有缝隙连接。②对单个Cajal间质细胞相邻的逼尿肌细胞进行荧光漂白后，发现逼尿肌细胞内的荧光强度明显恢复，同时Cajal间质细胞的荧光强度逐渐减弱。说明Cajal间质细胞与逼尿肌细胞之间有信号通讯通路。
结论：逼尿肌细胞与Cajal间质细胞之间存在结构上的联系，Cajal间质细胞可以将兴奋信号传递给周围的逼尿肌细胞。
关键词：间质细胞；膀胱逼尿肌；荧光素；化学，分析

丁砺蠡，方强，封建立，宋波.膀胱逼尿肌细胞与Cajal间质细胞结构和功能联系的实验研究[J].中国组织工程研究与临床康复，2008，12(18):3449-3452 [www.zglckf.com/zglckf/ejournal/upfiles/08-18/18k-3449(ps).pdf]

Structural and functional correlation between detrusor smooth muscle cells and interstitial cells of Cajal in the bladder

BACKGROUND: Detrusor smooth muscle cells are effector cells in the bladder movement. If interstitial cells of Cajal (ICC) in the bladder can serve as pacemaker cells, ICC should be regulated. Thus, their correlation in relation to structure and function can verify whether ICC can serve as pacemaker cells.
OBJECTIVE: To investigate the structural and functional relationship between detrusor smooth muscle cells and ICC in the bladder, and to analyze the effect of ICC in regulating the excitability of detrusor smooth muscle cells.
DESIGN, TIME AND SETTING: The control observation experiment was performed at the Central Laboratory, Basic College, Third Military Medical University of Chinese PLA from April to October 2007.
MATERIALS: Sprague-Dawley (SD) rats were used to collect fresh tissue blocks of detrusor smooth muscle cells in the bladder.
METHODS: Ultrastructural connection between detrusor smooth muscle cells and ICC in the bladder was detected with a transmission electron microscope. Signal transmission from ICC to detrusor smooth muscle cells in the bladder was simulated by fluorescent bleach technique. Signal exchange was observed between ICC and detrusor myocytes.
MAIN OUTCOME MEASURES: Ultrastructure connection and fluorescence intensity between ICC and detrusor smooth muscle cells.
RESULTS: Gap junction was confirmed between ICC and detrusor smooth muscle cells. After fluorescent bleach on target detrusor smooth muscle cells, fluorescence intensity in detrusor smooth muscle cells was significantly recovered. In the meantime, fluorescence intensity in the ICC neighboring to the target detrusor smooth muscle cells was decreased. This indicates a signal transmission from ICC to detrusor smooth muscle cells.
CONCLUSION: There is a structural connection between ICC and detrusor smooth muscle cells. Excitability signals may be transferred from ICC to detrusor smooth muscle cells.

Ding LL, Fang Q, Feng JL, Song B.Structural and functional correlation between detrusor smooth muscle cells and interstitial cells of Cajal in the bladder.Zhongguo Zuzhi Gongcheng Yanjiu yu Linchuang Kangfu 2008;12(18):3449-3452
[www.zglckf.com/zglckf/ejournal/upfiles/08-18/18k-3449(ps).pdf]

离体膀胱组织在张力作用下可产生不能被神经阻滞剂所去除的自发收缩[1]，既往研究发现，膀胱肌层内存在大量的Cajal细胞（ICC细胞），该细胞具有自发性电位，ICC细胞被阻断后逼尿肌细胞的收缩受到明显抑制[2]。这类特殊的间质细胞在胃肠道发动基本电节律和慢波，被认为是胃肠道运动的起搏细胞[3]，这提示ICC细胞可能也是膀胱运动的起搏细胞。那么广泛存在的ICC细胞与逼尿肌系统之间会存在怎样的结构功能关系来共同完成膀胱兴奋收缩的过程，是一个亟待研究的方向。本实验拟从两方面入手，首先分析逼尿肌细胞与ICC细胞在超微结构上的联系，其次利用荧光漂白技术模拟信号从ICC细胞传递到逼尿肌细胞的过程，说明ICC细胞与逼尿肌细胞之间可能存在信号交流，从而阐明膀胱运动的生理。

设计：观察对比实验。
时间及地点：本实验于2007-04/10在解放军第三军医大学基础部中心实验室完成。
材料：选用清洁级SD大鼠40只，体质量180~250 g，雌雄不限，由解放军第三军医大学实验动物中心提供（许可证号：SCXK（渝）20020002）。无菌条件下取膀胱供细胞培养使用。对动物处置方法符合动物伦理学要求。
主要试剂：6-碳氧荧光素醋酸盐(Molecular Probe Inc．MW460.4)。6-碳氧荧光素醋酸盐很容易通过细胞膜，并在细胞内被多种非特异性酯酶分解成代谢产物6-碳氧荧光素，带电荷的6-碳氧荧光素不能通过细胞膜，但很容易通过缝隙联结在细胞之间扩散。6-碳氧荧光素激发光波长为490 nm，发射光波长为518 nm，6-碳氧荧光素醋酸盐溶于二甲亚砜中配成1 mg/mL储备液，-20 ℃贮存。负载时用PBS液稀释成10 mg/L的应用液。DMEM、胎牛血清(Gibco公司)，分装后于-70 ℃保存备用。
主要仪器：激光扫描共聚焦显徽成像仪（Leica TCSNT，德国）具备荧光漂白技术要求的所有硬件设备，包括Ar-laser488nm、发射(阻挡)滤片513 nm、DSP（The digitalsignal processor）和AOTFs（The aeousto-optic tunable filters）。AOTFs不仅提供激光强度的准确控制，而且可以以针点(Pin-point)精度，保证激光束在特定位点的准确开(关)。因此，在荧光漂白技术分析中可以准确控制感兴趣区域(Regions of interest，ROI)细胞的荧光漂白程度，而相邻区域细胞不产生任何程度的荧光淬灭。在Image Browser窗口，由Leica TCS image Examiner(ROI mean功能)完成ROI（或选择的漂白细胞）和相邻未漂白细胞，在不同时间序列扫描中的荧光强度均值，并得出相应的时间-荧光强度变化趋势图。该仪器还可以对活细胞的荧光强度实时定量检测，包括：5 W的氩离子激光器，可以激发紫外光和可见光；声光调制器AOM，用于控制激光的脉冲强度和时间；OLYMPUS倒置显微镜；X-Y轴扫描载物台；Z轴步进马达控制器；冷电耦合器件(cCCD)摄取荧光图成像；光电倍增管PMT用于检测荧光信号；专用的计算机用于处理数据；SONY监视器用于显示图像。
方法：
透射电镜观察：大鼠麻醉后经左心室灌注电镜固定液(10 g/L多聚甲醛、25 g/L戊二醛)，膀胱组织冠状切片，于电镜固定液中固定24 h，按常规方法锇酸固定染色，在CEM1200EX(日本)型透射电镜下观察。
细胞培养：膀胱逼尿肌新鲜组织块来源正常大鼠膀胱，在无菌条件下手术切取膀胱，用灭菌生理盐水冲洗膀胱血迹后，剔除浆膜和黏膜组织，剪成0.5 mm×0.5 mm×0.5 mm大小，在4 ℃条件下胶原酶Ⅳ型消化12 h，用含体积分数为0.15的胎牛血清的DMEM培养液，于体积分数为0.05的CO2、37 ℃条件下常规培养。
荧光漂白实验：取出细胞40%~50%贴壁生长的圆形盖玻片，先用PBS液清洗2次，再加入10 mg/L的6-碳氧荧光素醋酸盐0.3~0.5 mL，37 ℃，体积分数为0.05的CO2孵箱中孵育20~25 min，取出后用PBS液洗去6-碳氧荧光素醋酸盐，然后再加少量PBS，置于共聚焦显微镜下观测。
镜下首先寻找细胞数量比较合适，有单独存在的ICC细胞和逼尿肌细胞的区域，这样在研究ICC细胞和逼尿肌细胞之间的信号通讯时可以避免其他细胞的影响，结果更为真实可靠。其次选择3种细胞：第1种是需要荧光漂白的目标逼尿肌细胞，观察它被高强度激光漂白后荧光是否有恢复，第2种是与漂白逼尿肌相
邻且有接触的ICC细胞，观察在目标逼尿肌细胞的荧光减弱了之后，它的荧光强度是否有变化。因为它不经过荧光漂白，且只可能与目标逼尿肌细胞有信号交通，所以ICC细胞荧光强度的减少可以提示细胞间信号通讯的存在。第3种是孤立细胞，它与其他细胞分离，根本不与任何细胞有任何的连接，作为对照。为了保证细胞活力，所有实验必须在40 min内结束。
调试仪器参数，选择好检测细胞，以高强度激光对目标逼尿肌细胞进行漂白，每间隔5 s检测收集1次荧光强度变化的数据，共收集240 s，在电脑上自动生成荧光强度-时间拟合曲线。
主要观察指标：①Cajal间质细胞和逼尿肌细胞之间的超微结构联系。②Cajal间质细胞和相邻逼尿肌细胞之间的荧光强度变化。
设计、实施、评估者：实验设计、评估为本文全部作者，实施为第一作者，均经过正规培训。
统计学分析：统计学处理者为第一作者，荧光强度结果均以x(_)±s表示，应用SPSS 12.0统计软件进行t检验。

如图1所示，透射电镜下观察，逼尿肌细胞和ICC细胞组织结构清晰，二者的细胞膜之间相邻，且形成了缝隙连接的结构，说明在结构上逼尿肌细胞和ICC细胞之间存在着直接的联系，这也是细胞间信号可能得以传递的基础。
2.2 细胞培养及鉴定结果
2.2.1 细胞光镜下形态培养细胞置于倒置显微镜下观察，培养24 h后细胞已开始贴附在瓶底，呈条梭状或短棒状，三四天后可以看到混合细胞表现出明显不同的形态：逼尿肌细胞表现为梭形或不规则形，而ICC细胞的形态为核大，胞浆少，细长且常具有多个突起。
2.2.2 细胞的免疫荧光鉴定结果 c-Kit免疫荧光染色鉴定，荧光显微镜下可见红色荧光着色的细长梭状细胞。逼尿肌细胞用α-actin免疫细胞化学法鉴定，呈分叶状或扁平状。
2.3 荧光漂白恢复实验结果混合培养的细胞都被荧光标记，通过细胞形态可以分辨出典型的ICC细胞和逼尿肌细胞。在视野中找到单个ICC细胞和单个逼尿肌相邻且有接触的区域，用激光漂白逼尿肌细胞，记录该细胞和相邻的ICC细胞漂白后0，10，20 s的荧光强度变化，选择孤立细胞作为背景对照。实验发现逼尿肌细胞在漂白的瞬间荧光迅速减弱，随着时间推移，荧光逐渐有明显恢复；相邻的ICC细胞的荧光强度在激光漂白逼尿肌细胞瞬间基本保持，而随着时间推移，在逼尿肌细胞荧光逐渐恢复的同时，ICC细胞的荧光强度却逐渐减弱，孤立细胞在整个荧光漂白恢复过程中荧光强度几乎不变。这说明荧光染料通过细胞间的连接从ICC细胞传递给了逼尿肌细胞。
240 s后对各组细胞荧光强度的变化进行分析，取 1 min平均值，结果发现，与孤立细胞相比，ICC细胞的平均荧光强度恢复率显著降低[（5.00±0.31）%，（-25.72±0.19）%（P < 0.01）]，而逼尿肌细胞的平均荧光强度恢复率显著增高（32.88±0.29）%（P < 0.01）。
2.4 可能影响结果的因素分析细胞间信号通讯的研究仅限于培养细胞水平，难以完全模拟在体水平的细胞通讯。

目前，膀胱ICC细胞被认为可能参与了膀胱运动（尤其是不稳定膀胱）的起搏，关于ICC细胞启动膀胱逼尿肌细胞兴奋的机制，仍有很多认识的空白，是本领域研究的新热点。所以，膀胱逼尿肌细胞与ICC细胞之间结构与功能间的关系，具有很大的探索价值。
既往对消化道ICC细胞的研究表明，ICC细胞在肌层分为多群[4-6]，细胞之间形成网络，ICC细胞网络与逼尿肌细胞之间存在广泛的缝隙连接，兴奋信号通过缝隙连接得到迅速传播[7-12]，这也是消化道ICC细胞得以发挥其起搏细胞功能的结构和功能基础。
细胞间电信号通讯的重要结构基础[13-15]是缝隙连接。缝隙连接又称电突触，是位于细胞膜上的蛋白通道结构，其基本结构由六聚体蛋白亚单位及缝隙连接蛋白相互嵌合而成，为相邻细胞缝隙连接通讯提供低阻力通道，从而实现细胞间的信息和能量交换传递[5]。两种细胞之间存在缝隙连接的说明它们之间有信号通讯的能力。如果膀胱ICC细胞的兴奋信号能够得以迅速传递给
逼尿肌细胞并起搏整个膀胱运动的话，必须有1个这样的电信号传导通路。既往形态学实验发现膀胱ICC细胞与逼尿肌细胞之间细胞相互缠绕[16-19]，说明二者之间形态学上可能存在细胞间通讯的结构基础—缝隙连接。
研究细胞之间信号通讯的方法多种多样，荧光漂白技术是成熟、可靠、易行的一种。荧光漂白技术用于分析多种生物膜系统的分子迁移研究，它是将待测细胞从表面用荧光物标记，可以根据被漂白细胞内荧光强度恢复程度对细胞间缝隙连接进行评估。由于光漂白过程是不可逆的，荧光恢复过程可完全准确地反映荧光标记物的运动。还可以用计算机精确控制淬灭激光脉冲强度的时间，对细胞内荧光强度进行定时定量监测。并且所用的荧光染料6-碳氧荧光素醋酸盐对细胞无毒性，并有较强的膜通透性，它本身不发荧光，进入细胞后被多种非特异性酯酶分解成代谢产物6-碳氧荧光素，带电荷的水解产物可被488 nm的激光激发出黄绿色荧光，且无膜通透性，因此荧光物质进入细胞后无法通过细胞膜出来，即只有通过细胞间缝隙连接通道才能相互交换。因此，可以用荧光漂白技术来研究细胞之间是否有缝隙连接存在，并且可以细胞间的信号通讯进行直观的观察[20]。
本实验首先通过透射电镜从超微结构上发现了逼尿肌细胞与ICC细胞之间具有缝隙连接，其次，建立了ICC细胞与逼尿肌细胞混合培养的细胞实验平台，在此基础上的荧光漂白实验，发现荧光染料从ICC细胞传递给了相邻的逼尿肌细胞，这又从功能上说明ICC细胞与逼尿肌细胞之间是可以发生细胞间信号通讯的。正是因为有这样的结构和功能基础，ICC细胞的兴奋可以通过缝隙连接把信号迅速有效地传递给逼尿肌细胞，进而引起膀胱组织的兴奋收缩活动。

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