急性排斥期大鼠角膜移植物肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体及死亡受体4表达变化与环孢素A的干预*☆

袁伟，陆晓和，张永强，余洪华，宫玉波

课题背景：文章是2004年广东省自然科学基金课题FasL基因转染抑制高危角膜移植排斥反应的部分研究内容。该基金课题主要研究了FasL基因转染对普通角膜移植及高危角膜移植排斥反应的抑制作用及对相关细胞因子和蛋白表达的影响；在此基础上还对角膜移植动物进行了免疫抑制剂单独应用及联合FasL基因进行转染，以探寻移植术后免疫排斥反应的防治方案并分析其作用途径。

应用要点：实验检测急性排斥期大鼠角膜移植物肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体及其受体死亡受体4的表达变化，分析其与角膜移植急性免疫排斥反应的关系；并观察了免疫抑制剂环孢素A抑制角膜移植免疫排斥反应的效果，及其对角膜移植物肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体及死亡受体4表达的影响。结果发现肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体及死亡受体4与角膜移植免疫排斥反应有密切关系；环孢素A可通过调节肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体及死亡受体4蛋白的表达发挥免疫抑制作用，为临床角膜移植排斥反应的防治提供了新的思路和策略。

偏倚或不足：目前角膜移植术后排斥反应研究是世界范围内比较热门的课题，文章针对性观察肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体及其受体死亡受体4在角膜移植术后排斥过程中的表达变化，为研究角膜移植术后排斥反应机制提供了新的思路，具有一定创新性。

袁伟☆，女，1979年生，山东省青岛市人，汉族，南方医科大学在读博士，主治医师，主要从事角膜移植排斥免疫研究。
banana1619@163.com

通讯作者：陆晓和，博士，主任医师，南方医科大学珠江医院眼科，广东省广州市 510282
luxh63@163.com

广东省自然科学基金（04020438）“FasL基因转染抑制高危角膜移植排斥反应的实验研究”

目的：研究提示，肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体及其死亡受体4可能参与角膜移植免疫排斥反应。观察免疫抑制剂环孢素A对急性排斥期角膜移植物肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体及其受体死亡受体4表达的影响。
方法：实验于2007-07/10在南方医科大学珠江医院中心实验室完成，对动物处置方法符合动物伦理学要求。选用Wistar大鼠18只为供体，SD大鼠36只为受体，钻取供体双眼角膜植片，于受体右眼行穿透性角膜移植术；另取5只Wistar大鼠做正常对照。按随机数字表法将受体大鼠分为2组（n=18），即生理盐水组及环孢素A组，术后药物滴眼，2次/d，1滴/次，连用2周。应用免疫组织化学法检测急性排斥期角膜植片肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体及死亡受体4表达情况。
结果：36只受体大鼠全部进入结果分析。①肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体及死亡受体4在正常角膜均有表达，主要分布于上皮层，在基质层及内皮层有少量表达。②环孢素A组和生理盐水组大鼠角膜植片各层肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体及死亡受体4表达均增高，生理盐水组增高尤为明显。
结论：肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体及死亡受体4的表达参与角膜移植免疫排斥反应的发生，环孢素A可通过下调其表达抑制角膜移植免疫排斥反应。
关键词：角膜移植；环孢菌素；肿瘤坏死因子；脱噬作用；配体；受体

袁伟，陆晓和，张永强，余洪华，宫玉波.急性排斥期大鼠角膜移植物肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体及死亡受体4表达变化与环孢素A的干预[J].中国组织工程研究与临床康复，2008，12(18):3453-3456
[www.zglckf.com/zglckf/ejournal/upfiles/08-18/18k-3453(ps).pdf]

中图分类号: R617
文献标识码: A
文章编号: 1673-8225
(2008)18-03453-04

Cyclosporin A effects on expressions of tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand and death receptor 4 in rat corneal allografts during acute rejection phase

AIM: Tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand (TRAIL) and death receptor 4 (DR4) participate the immunological rejection in corneal transplantation. The study aimed to investigate the influence of cyclosporin A on expression of TRAIL and its DR4 in corneal allografts.
METHODS: Experiments were performed at the Central Laboratory of Zhujiang Hospital, Southern Medical University from July to October 2007. The protocol was in accordance with animal ethical standards. Eighteen Wistar rats were selected as donors, whereas thirty-six SD rats were selected as receptors. Corneas of both eyes were obtained by drilling from donors, and penetrating right eye corneal transplantation was performed. Another five Wistar rats were selected as controls. Receptor rats were randomly divided into saline group (n=18) and cyclosporin A group (n=18). Drugs were dropped into eyes after the surgery, twice a day, once one drop for 2 weeks. Immunohistochemistry was used to detect the expression of TRAIL and DR4 in corneal allografts during allograft rejection.
RESULTS: A total of 36 rats were included in the final analysis. ①TRAIL and DR4 were detected on normal cornea, mainly on the epithelium, with modest staining in the stroma and endothelium. ②Expressions of TRAIL and DR4 were increased in the cyclosporin A group and the saline group, especially in the saline group.
CONCLUSION: TRAIL and its receptor DR4 may be related to the immunologic process of corneal graft rejection, and cyclosporin A suppresses postoperative immunologic rejection in keratoplasty.

Yuan W, Lu XH, Zhang YQ, Yu HH, Gong YB.Cyclosporin A effects on expressions of tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand and death receptor 4 in rat corneal allografts during acute rejection phase.Zhongguo Zuzhi Gongcheng Yanjiu yu Linchuang Kangfu 2008;12(18):3453-3456(China)
[www.zglckf.com/zglckf/ejournal/upfiles/08-18/18k-3453(ps).pdf]

目前，穿透性角膜移植被公认为是治疗角膜盲、恢复视力的惟一有效办法，但是术后的免疫排斥反应仍是导致手术失败的主要原因。有研究提示，肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体及其死亡受体4可能参与角膜移植免疫排斥反应[1]。本实验通过建立大鼠穿透性角膜移植模型，观察肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体及死亡受体4在角膜移植物的表达以及免疫抑制剂环孢素A对其的影响，旨在探讨肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体及死亡受体4在角膜移植免疫排斥反应中的作用及意义，分析环孢素A抑制角膜移植免疫排斥反应的作用途径。

设计：随机对照动物实验。
单位：南方医科大学珠江医院眼科。
材料：实验于2007-07/10在南方医科大学珠江医院中心实验室（SPF级）完成。选用健康清洁级Wistar大鼠18只为供体，SD大鼠36只为受体；另取5只健康清洁级Wistar大鼠做正常对照。雌雄兼用，体质量200~250 g，由南方医科大学实验动物中心提供（许可证号：0030625）。对动物处置方法符合动物伦理学要求。
试剂和仪器：抗肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体单克隆抗体及即用型免疫组织化学染色试剂盒均购自武汉博士德生物工程有限公司；抗死亡受体4单克隆抗体购自ABcam公司；10 g/L环孢素A滴眼液，中山大学中山眼科中心配制。眼科手术显微镜（美国Leica-M841型）。
设计、实施、评估者：实验设计、评估为第一、三作者，实施干预为全部作者。
方法：
实验分组：按随机数字表法将36只受体鼠分为2组，即生理盐水组及环孢素A组，每组18只。
手术方法：参照Williams和Coster方法[2]建立大鼠同种异体角膜移植模型。术前20 min以 5 g/L托品酰胺滴眼液散瞳，腹腔注射100 g/L水合氯醛4 mg/kg麻醉。术前常规无菌操作，在手术显微镜下进行。钻取供体双眼角膜直径为3.5 mm的植片，置于Optisol角膜保存液中备用。于受者右眼行穿透性角膜移植术。做上下眼睑牵引线，用直径3.0 mm环钻钻取中央区角膜，将植片置于植床，以10/0尼龙丝线间断缝合8针，线结暴露不包埋。手术作部分改进，以黏弹剂Healon代替平衡盐液，维持前房。术毕散瞳，结膜下注射庆大霉素2 000 U，缝合睑缘。术后不拆线。
术后用药及临床观察：术后受者术眼结膜下注射庆大霉素2 000 U，隔日1次，共3次。生理盐水组术后滴生理盐水；环孢素A组滴环孢素A滴眼液。均从术后第1天起用药，2次/d， 1滴/次，连续使用2周。自术后第1天起在裂隙灯显微镜下观察术眼角膜水肿、混浊及新生血管情况，1次/d；参照Larkin等[3]的评分标准，记录每日排斥反应指数，当排斥反应指数≥5或植片混浊1项达到3时，即认为排斥反应发生。由于手术因素造成感染、前房出血、前房消失

或术后5 d内发生严重的角膜植片水肿、混浊及破坏，不列为统计范围，并及时补充实验动物。
取材及免疫组化切片制备：急性排斥期（术后第10 天）每组按随机数字表法取6只大鼠，麻醉后立即摘除术眼，取其完整角膜，并置于40 g/L多聚甲醛溶液固定、脱水，常规石蜡包埋，切片行免疫组织化学染色。
以试剂盒中未染色的已知阳性对照片与被测标本同时染色作阳性对照，以磷酸盐缓冲液取代一抗作阴性对照，两种标记物均以细胞膜呈棕黄色染色者为阳性细胞。光镜下观察肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体及死亡受体4在大鼠角膜植片的表达部位及强度。每张切片分伤口周围（伤口边缘0.5 mm内）植片及植片中央两个区域进行观察。高倍镜下（×200）对切片中染色阳性细胞进行两人计数及评分，计算每200倍视野下阳性细胞数。阳性细胞评分标准：0为未见阳性细胞，1为1~10个阳性细胞，2为11~20个阳性细胞，3为21~30个阳性细胞，4为﹥30个阳性细胞。
主要观察指标：各组大鼠角膜植片肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体及死亡受体4蛋白阳性细胞评分。
统计学方法：由第一、三作者应用SPSS 10.0软件包进行统计学处理，数据以x(_)±s表示，统计学方法为方差分析，P﹤0.05为差异有显著性意义。

2.1 实验动物数量分析 36只受体大鼠全部进入结果分析，无脱失。
2.2 各组大鼠角膜植片存活时间（各组用于取标本的6只大鼠不在生存时间统计范围之内）环孢素A组大鼠角膜植片平均存活时间长于生理盐水组[(12.917±1.379)，(10.333±1.231) d，P < 0.01]，环孢素A可明显延长角膜植片存活时间。
2.3 免疫组织化学染色结果见表1。

如表1所示，肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体及死亡受体4在正常大鼠角膜组织均有表达，主要分布于上皮层，基质层及内皮层有少量表达。与正常角膜相比，急性排斥期环孢素A组和生理盐水组大鼠角膜植片各层肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体及死亡受体4表达均增高（P < 0.01）；两治疗组角膜植片肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体及死亡受体4表达差异显著（P < 0.01），生理盐水组肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体及死亡受体4表达增高尤为明显。肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体及死亡受体4阳性表达主要集中在植片伤口附近的上皮层及浅层基质。
2.4 可能影响结果的因素分析高倍镜下对切片中染色阳性细胞进行两人计数及评分，计算每200倍视野下阳性细胞数，人为计数可能不十分精确。

肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体是肿瘤坏死因子家族的一个新成员[4-8]，死亡受体4是肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体的受体之一，其胞内区包含有能够传递凋亡信号的死亡结构域[9-10]，在体外肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体与死亡受体结合能迅速诱导多种组织来源的转化细胞株及肿瘤细胞株凋亡。有研究证实肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体参与了机体的免疫调节[1，11-13]。Wang等[13]通过实验发现，CD4＋T细胞和角膜内皮细胞表达肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体，并且肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体可以诱导眼内肿瘤细胞凋亡，这种凋亡可以被抗肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体抗体阻断；Lee等[14]的实验指出，肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体蛋白及肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体mRNA表达于眼的许多组织，包括角膜及视网膜等，肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体对监视、杀灭眼内肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体敏感的肿瘤细胞有重要作用。以上结果皆提示眼组织如角膜等有肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体表达，并且肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体在该组织中对转化细胞有监视及杀灭作用。本实验发现肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体及死亡受体4蛋白在正常大鼠角膜有表达，主要表达于角膜上皮层、基质层及内皮层少量表达。推测正常大鼠角膜上皮层肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体及死亡受体4的表达可以阻止结膜的转化细胞进入角膜组织；角膜内皮细胞对维持角膜的完整及透明性有重要作用，而肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体及死亡受体4在内皮层的表达可保护不能再生的内皮细胞免受转化细胞的损害。
近年来肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体及死亡受体4与移植免疫排斥反应的关系日益引起学者的关注。有实验发现[15]，携带有肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体基因的异体组织(腺瘤细胞)移植后可以明显抑制或减轻免疫排斥反应，提示肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体蛋白可能对移植免疫排斥反应有抑制作用。Song等[16]的实验发现移植排斥肾脏中肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体、死亡受体4及死亡受体5的表达水平较之正常肾脏组织明显升高；肾脏移植患者血清肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体水平明显高于正常人。提示肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体及其受体死亡受体4和死亡受体5有可能参与肾脏移植排斥反应的发生。郭萍等[1]的小鼠角膜移植实验发现，抗肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体抗体转染组发生角膜移植免疫排斥反应的时间较正常对照组显著延长，术后早期炎性反应的强度轻，推测肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体可能参与并抑制了角膜移植免疫排斥反应的发生。本实验建立同种异体大鼠角膜移植模型，检测术后不同时间点大鼠角膜植片肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体蛋白及其受体死亡受体4蛋白的表达情况，免疫组化染色结果显示，大鼠角膜移植术后不同时间点植片各层肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体蛋白及死亡受体4蛋白表达均较正常角膜组织的表达增高，上皮层增高更为明显，阳性表达主要集中在植片伤口周围。该结果提示肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体及其受体死亡受体4可能参与了角膜移植免疫排斥反应的发生。有学者认为肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体蛋白发挥免疫抑制作用的可能途径是作用于T淋巴细胞的细胞周期，阻断细胞从G1期到S期转化，抑制DNA合成，从而抑制T淋巴细胞的增殖与活化[16]。另有研究提示，肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体蛋白可能通过促进免疫排斥反应中效应细胞的凋亡，参与T淋巴细胞的凋亡调节，使角膜植片存活时间延长，发挥抑制排斥免疫反应的作用[1]。角膜移植术后的免疫排斥反应主要是以活化T淋巴细胞介导的细胞免疫反应，肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体及其受体死亡受体4有可能通过这些途径参与角膜移植免疫排斥反应，其具体机制尚需进一步探讨。
环孢素A是一种常用的免疫抑制剂，由真菌中分离为中性环状多肽混合物。临床主要用于抑制肾脏、肝脏、心脏的移植排斥反应，眼科则用于抑制角膜移植的排斥反应和自身免疫性眼病，尤其在抗角膜移植免疫排斥方面效果良好[17-20]。其作用机制认为[21]，它可干扰淋巴细胞亚群，主要是干扰辅助T细胞，识别特殊抗原，使白细胞介素1、白细胞介素2和淋巴细胞生长因子的分泌受阻止，阻止淋巴细胞活化和增殖，抑制细胞性免疫。本实验表明环孢素A可通过调节肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体及死亡受体4的表达，延长植片存活时间，发挥免疫抑制作用。分析其可能原因是通过抑制白细胞介素2的分泌，间接减少了肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体及死亡受体4的表达。但是其具体机制复杂，尚待进一步探讨。
综上所述，肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体及其受体死亡受体4参与了角膜移植免疫排斥反应，在免疫调节和免疫赦免过程中发挥重要作用，但其具体机制复杂，受多种细胞因子的调节，如白细胞介素、γ-干扰素等。对肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体及其受体作用机制的不断深入研究，将有助于进一步阐明角膜移植免疫排斥反应的具体机制，为角膜移植免疫排斥反应的防治提供新策略。

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