人内皮型一氧化氮合成酶基因转染桡动脉的表达☆

陶登顺，王辉山，汪曾炜，朱洪玉，姜志明

课题背景：本课题为全军医药卫生科研基金（编号：01H001）的延续，桡动脉作为冠状动脉旁路移植血管材料的应用，中、近期有较好的通畅率，但是桡动脉痉挛问题尚未解决。虽然目前抗痉挛的药物有一定效果，但桡动脉痉挛发生率仍有5%～10%。采用人内皮型一氧化氮合成酶基因转染人桡动脉，探索防治移植血管痉挛的方法。

应用要点：采用桡动脉体外培养的方法进行转基因实验，仅证明基因转染后能够有效表达及抑制血管内膜的增生，探索解决桡动脉痉挛的新方法，还需要进一步通过血管张力反应实验及在体动物实验进一步探索内皮型一氧化氮合酶基因转染预防桡动脉痉挛的效果。

同行评价：本文结果发现了内皮型一氧化氮合酶经腺病毒转染后，能在体外减少动脉内膜的增厚的现象，这对解决桡动脉痉挛问题有一定理论提示，具有一定的应用价值。

陶登顺☆，男， 1969年生，黑龙江省宁安市人，汉族，2005年解放军第四军医大学毕业，博士，副主任医师，主要从事冠心病外科研究。Taodengshun@
hotmail.com

目的：桡动脉作为血管桥材料在冠状动脉旁路移植术中具有重要作用，但血管桥痉挛一直是困扰桡动脉移植的难题。实验通过腺病毒载体介导的人内皮型一氧化氮合成酶基因（AdCMVeNOS）转染人桡动脉，体外培养后检测人内皮型一氧化氮合成酶基因的表达，观察其对内膜增生的影响。
方法：①实验于2005-03/04在解放军沈阳军区总医院完成。实验用Enos-Ad由该院麻醉科张铁铮主任惠赠。桡动脉来自15例冠状动脉旁路移植手术患者剩余桡动脉。将桡动脉横切成5 mm血管环，采用随机数字表法分为3组，对照组、空载腺病毒液感染组、内皮型一氧化氮合酶基因转染组，每组8份。空载腺病毒液感染组、内皮型一氧化氮合酶基因转染组桡动脉血管环分别置于空载腺病毒液和AdCMVeNOS溶液中1 h，取出后体外培养14 d。应用多聚寡核苷酸探针和高敏感标记技术检测外源性基因内皮型一氧化氮合酶mRNA的表达；免疫组织化学染色方法检测内皮型一氧化氮合酶蛋白的表达；苏木精-伊红染色及弹性纤维染色后，应用计算机图像分析系统检测桡动脉内膜、中膜增生情况。
结果：①3组培养的桡动脉在14 d后有新内膜形成和显著的中膜增厚，内皮型一氧化氮合酶基因转染组内膜厚度及内膜/中膜厚度比值低于对照组 (P < 0.01)，空载腺病毒液感染组与对照组差异无显著性 (P > 0.05)。②培养14 d后，内皮型一氧化氮合酶基因转染组内膜和中膜可检测到内皮型一氧化氮合酶mRNA和蛋白质表达，对照组及空载腺病毒液感染组未见明显表达。
结论：腺病毒载体介导的人内皮型一氧化氮合成酶基因成功转染体外培养桡动脉中并有效表达，内皮型一氧化氮合酶基因具有防治体外培养桡动脉内膜增生的作用。
关键词：桡动脉；一氧化氮合酶；腺病毒科；组织构建

陶登顺，王辉山，汪曾炜，朱洪玉，姜志明. 人内皮型一氧化氮合成酶基因转染桡动脉的表达[J].中国组织工程研究与临床康复，2008，12(18):3461-3464 [www.zglckf.com/zglckf/ejournal/upfiles/08-18/18k-3461(ps).pdf]

Expression of transfected human endothelial nitric oxide synthase gene in radial artery

AIM: As blood vessel bridge material, radial artery plays an important role in coronary artery bypass graft (CABG), but blood vessel bridge spasm limits the application of radial artery grafting. This study measured the expression of adenoviral-mediated human endothelial nitric oxide synthase gene (AdCMVeNOS) transfected in radial artery in vivo and explored its effect on intimal hyperplasy.
METHODS: The experiment was performed at General Hospital of Shenyang Military Area Command of Chinese PLA from March to April 2005. Enos-Ad used in this study was gifted by Zhang. Radial arteries from 15 CABG patients were transected into 5 mm blood vessel rings and randomly divided into 3 groups (n=8): control group, adenoviral infection group, and eNOS gene transfection group. The radial artery rings in the latter two groups were sunk into adenoviral solution and AdCMVeNOS solution for 1 hour, respectively, and then cultured in vivo for 14 days. Expressions of eNOS mRNA were measured by in situ hybridization, and high sensitive marking technology, and expressions of eNOS protein by immunohistochemistry. Intimal and medial hyperplasy of radial artery were stained by HE and elastic fiber, and analyzed by computer graph-analyzing system.
RESULTS: ①Neointima formed and media proliferated obviously in radial artery cultured for 14 days. Intimal thickness and ratio of intimal/medial thickness was significantly lower in eNOS gene transfection group than in control group (P < 0.01), but there was no significant difference between adenoviral infection group and control group (P > 0.05). ②Expressions of eNOS mRNA and protein were found in intima and media of eNOS gene transfested radial artery after culture for 14 days. But no obvious expression was found in the other groups.
CONCLUSION: AdCMVeNOS gene is transfected into in vitro cultured radial artery successfully and expressed effectively. eNOS gene could inhibit intimal hyperplasia in cultured radial artery in vitro.

Tao DS, Wang HS, Wang ZW, Zhu HY, Jiang ZM. Expression of transfected human endothelial nitric oxide synthase gene transfection in radial artery.Zhongguo Zuzhi Gongcheng Yanjiu yu Linchuang Kangfu 2008;12(18):3461-3464(China)
[www.zglckf.com/zglckf/ejournal/upfiles/08-18/18k-3461 (ps).pdf]

近年来，桡动脉作为冠状动脉旁路移植血管材料应用越来越多，中、近期有较好的通畅率[1-7]，但是桡动脉痉挛问题尚未解决，虽然目前抗痉挛的药物有一定效果，但桡动脉痉挛发生率仍有5%~10%[8]。作者采用腺病毒载体介导的人内皮型一氧化氮合成酶基因转染人桡动脉，进行体外培养后检测人内皮型一氧化氮合酶（endothelial nitric oxide synthase, eNOS）基因的表达，并对内膜增生影响进行研究，探索防治移植血管痉挛与再狭窄的方法。

设计：分组对照观察。
单位：解放军沈阳军区总医院。
材料：人桡动脉来源于2005-03/04解放军沈阳军区总医院行冠状动脉旁路移植的冠心病患者15例，男11例，女4例，平均年龄（54.2±5.6）岁。高血压13例，糖尿病9例，陈旧性心肌梗死9例，心功能（NYHA分级）Ⅱ级8例，Ⅲ级5例，Ⅳ级2例，冠状动脉造影均为三支病变，不同疾病状态对结果没有影响。所有患者均采用带蒂不接触血管技术获取桡动脉。患者对所进行的治疗及实验均知情同意。Enos-Ad：由解放军沈阳军区总医院麻醉科张铁铮主任惠赠。
设计、实施、评估者：为第一、二、五作者，均接受过专业培训。
技术路线：
所有标本均于血管吻合前取远端剩余部分，将血管周围多余的脂肪和外周组织在无菌条件下切除，血管切成 5 mm的血管环，采用随机数字表法分为3组，每组8份，对照组、空载腺病毒液感染组、内皮型一氧化氮合酶基因转染组。空载腺病毒液感染组、内皮型一氧化氮合酶基因转染组分别置于空载腺病毒液（浓度为5×1012 pfu/L）和AdCMVeNOS溶液（浓度为5×1012 pfu/L）中1 h，进行基因转移，然后将血管环移至在体积分数为0.2的胎牛血清DMEM培养基中培养，内含青霉素（100 U/L）、链霉素（100 U/L）。用20 mmol/L羟乙基哌嗪乙硫磺酸(HEPES) 缓冲液将培养基的pH值调整在7.35~7.45，血管环在37 ℃、体积分数为0.05的CO2孵箱中孵育，每隔72 h更换1次培养液。
血管培养14 d后，血管环分别经磷酸盐缓冲液漂洗，40 g/L多聚甲醛固定。石蜡包埋，连续切片，切片厚7 μm，用多聚寡核苷酸探针和高敏感标记技术及使用敏感加强型的原位检测方法检测外源性基因mRNA的表达，应用鼠抗人内皮型一氧化氮合酶抗体，链菌素生物素-过氧化物酶标记物免疫组织化学方法检测内皮型一氧化氮合酶蛋白的定位表达（试剂盒均为武汉博士德公司产品，操作严格按说明进行）；苏木精-伊红及弹力纤维染色，日本产Luzex-F显微图像分析系统测量血管内膜、中膜厚度。
主要观察指标：①组织学检查结果。②原位杂交内皮型一氧化氮合酶mRNA检测结果。③内皮型一氧化氮合酶免疫组织化学检测结果。
统计学方法：由本文作者采用SPSS 10.0统计软件分析，实验结果服从正态分布，以x(_)±s表示，组间方差齐同，用单因素方差分析，P < 0.05为结果差异有显著性。

2.1 组织学检查结果培养的桡动脉血管环生长良好，无污染。苏木精-伊红染色可见血管内膜明显增厚，组织结构疏松，细胞核大浆多，排列紊乱。Romeis氏地依红法弹性纤维染色后计算机图像分析测量血管壁内膜及中膜厚度结果见表1。血管环体外培养14 d，对照组、空载腺病毒液感染组和内皮型一氧化氮合酶基因转染组的血管内膜和中膜均增厚，内皮型一氧化氮合酶基因转染组内膜厚度及内膜/中膜厚度比与对照组比较，差异具有显著性意义(P < 0.01)，空载腺病毒液感染组与对照组内膜厚度比较，差异无显著性意义(P > 0.05)；各组血管中膜厚度比较，差异无显著性意义(P > 0.05)。

2.2 原位杂交内皮型一氧化氮合酶mRNA检测结果对照组、空载腺病毒液感染组内膜和中膜无内皮型一氧化氮合酶mRNA的表达，内皮型一氧化氮合酶基因转染组内膜和中膜可检测到内皮型一氧化氮合酶mRNA表达，呈黄色，以内膜和中膜交界处明显。
2.3 内皮型一氧化氮合酶免疫组织化学检测结果内皮型一氧化氮合酶基因转染组移植静脉中膜和内膜可检测到大量内皮型一氧化氮合酶蛋白的表达，其余两组未见明显表达。图像分析结果见表2，在内膜层内皮型一氧化氮合酶基因转染组灰度值明显高于对照组(P < 0.01)，空载腺病毒液感染组与对照组内膜厚度比较差异无显著性 (P > 0.05)；在中膜层内皮型一氧化氮合酶基因转染组灰度值高于对照组(P < 0.05)，空载腺病毒液感染组与对照组内膜厚度比较差异无显著性 (P > 0.05)。

内源性一氧化氮是内皮细胞产生的一种内源性舒张因子，可调节血管张力，还可抑制血小板聚集，白细胞黏附及血管平滑肌细胞的迁移和增生。内源性一氧化氮的产生是在一氧化氮合酶作用下，使L-精氨酸转变为L-胍氨酸的过程中产生的。一氧化氮合酶在一氧化氮的产生过程中起到关键作用。一氧化氮合酶分为3种：内皮型一氧化氮合酶、神经源性一氧化氮合酶和诱导性一氧化氮合酶。在人的心血管系统，一氧化氮对血管舒张和对抗动脉粥样硬化起着重要的作用[9]。
冠状动脉旁路移植术中采用动脉血管材料，桡动脉因有较好的中、远期通常率，且口径适当、取材容易，近年来受到越来越多重视。但是桡动脉痉挛问题尚未解决，其机制尚未阐明[2-9]。王辉山等[10-14]研究乳内动脉桡动脉及大隐静脉内皮型一氧化氮合酶表达，发现乳内动脉内膜层及肌性中层的内皮型一氧化氮合酶有良好表达，桡动脉次之，而大隐静脉最少，推测内皮型一氧化氮合酶在乳内动脉高表达是其具有良好远期通畅率的结构基础。也有研究显示，基础条件下桡动脉的一氧化氮释放量比乳内动脉低[8,15-17]，导致桡动脉具有较高的血管张力，易发生痉挛基础状态下桡动脉的一氧化氮合酶活性低于乳内动脉，推测受到刺激时，桡动脉的一氧化氮释放量低于乳内动脉，因此导致桡动脉较乳内动脉易痉挛。为了防治桡动脉痉挛及血管内膜增生，作者通过转基因的方法，重组内皮型一氧化氮合酶基因，重建内源性一氧化氮功能，使一氧化氮在局部释放，是治疗的新策略[18-20]。
本实验应用纯化的AdCMVeNOS和空载腺病毒液分别感染人新鲜桡动脉血管环，然后转移至体积分数为0.2的胎牛血清DMEM培养基中培养，2周后取出血管环固定，用多聚寡核苷酸探针和高敏感标记技术检测外源性基因mRNA的表达，用链菌素生物素-过氧化物酶标记物免疫组织化学方法检测内皮型一氧化氮合酶蛋白的定位表达，结果证实，桡动脉中膜和内膜可检测到大量内皮型一氧化氮合酶mRNA的表达和内皮型一氧化氮合酶蛋白的表达，其余两组未见明显表达，说明内皮型一氧化氮合酶基因能够转入人新鲜桡动脉，并在血管壁中膜和内膜细胞中超表达。培养2周观察新内膜增生情况，发现未经处埋、空载腺病毒液和AdCMVeNOS分别感染处理的颈静脉移植血管都有不同程度新内膜形成和中膜增厚。对照组、空载腺病毒液感染组和内皮型一氧化氮合酶基因转染组的血管内膜和中膜均增厚，内皮型一氧化氮合酶基因转染组内膜厚度及内膜/中膜厚度比与对照组组比较差别具有显著性(P < 0.01)，空载腺病毒液感染组与对照组内膜厚度比较差别无显著性 (P > 0.05)；各组血管中膜厚度比较差别无显著性 (P > 0.05)。内皮型一氧化氮合酶基因转染组移植桡动脉内膜和中膜厚度分别减少28.60%，5.60%，内膜厚度/中膜厚度比值减少50.80%。内膜厚度/中膜厚度比值比值降低，说明血管内膜增生所受抑制更为明显。提示内皮型一氧化氮合酶基因转染可抑制血管内膜的增生，具有防治移植血管再狭窄的作用。
本实验采用桡动脉体外培养的方法进行转基因研究，仅证明基因转染后能够有效表达及抑制血管内膜的增生，需要进一步通过血管张力反应实验及在体动物实验进一步探索内皮型一氧化氮合酶基因转染预防桡动脉痉挛的效果。

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