胎鼠肺泡Ⅱ型细胞的原代培养及鉴定*☆

刘秀香1，杨志军2，陈洪清2，封志纯2

1南方医科大学珠江医院，广东省广州市 510282； 2解放军北京军区总医院附属八一儿童医院，北京市 100007

刘秀香☆，女，1975年生，山东省滨州市人，汉族，南方医科大学在读博士，主治医师，主要从事新生儿疾病的研究。
Liuxiuxiang99@163.com

通讯作者：封志纯，教授，解放军北京军区总医院附属八一儿童医院，北京市 100007
zhjfengzc@126.com

实验于2007-10/12在北京军区总医院附属八一儿童医院实验室完成。取孕19 d SD大鼠胎鼠肺组织进行原代培养，通过IgG包被瓶培养进行筛选纯化。分别于培养24，48，72 h 后检测细胞的活力；利用共聚焦显微镜及电镜对肺泡Ⅱ型上皮细胞进行鉴定。各时间点Ⅱ型细胞活力均在90%以上，细胞纯度在91%以上，电镜下细胞胞浆内含有丰富的板层小体，细胞表面有微绒毛；共聚焦显微镜下细胞浆中有呈绿色荧光的SP-C阳性表达。胰蛋白酶加胶原酶消化，IgG包被瓶进行筛选所得肺泡Ⅱ型细胞活力及纯度均较高，可以作为肺泡Ⅱ型细胞的原代培养的常规方法；电镜和免疫荧光均可达到鉴定目的。
关键词：肺泡Ⅱ型细胞；原代培养；鉴定；组织构建

刘秀香，杨志军，陈洪清，封志纯.胎鼠肺泡Ⅱ型细胞的原代培养及鉴定[J].中国组织工程研究与临床康复，2008，12(18):3497-3499 [www.zglckf.com/zglckf/ejournal/upfiles/08-18/18k-3497(ps).pdf]

Primary culture and identification of type Ⅱ alveolar epithelial cells from fetal rats

The experiment was performed in Bayi Children's Hospital, General Hospital of Beijing Military Area Command of Chinese PLA from October to December 2007. Lung tissues of fetal rats of SD gestation rats for 19 days were cultured primarily and purified by culture flasks coated with rat IgG. Cell viability was detected at 24, 48 and 72 hours of culture. Type Ⅱ alveolar epithelial cells (AEC Ⅱ) were identified of confocal microscopy and electron microscope. On every time point, the viability of AEC Ⅱ was above 90%, and the purity was above 91%. The cells had plenty of lamellar bodies in cytoplasm and many microvilli on cell surface; there was green fluorescence expression of SP-C in cytoplasm. The viability and purity of AEC Ⅱobtained by digestion of trypsin and collagenase and by screening with culture flasks coated with rat IgG is higher. Therefore, this method can serve as a routine method of primary culture of AEC Ⅱ. Both electron microscope and immunofluorescence can identify the cells.

Liu XX, Yang ZJ, Chen HQ, Feng ZC.Primary culture and identification of type Ⅱ alveolar epithelial cells from fetal rats.Zhongguo Zuzhi Gongcheng Yanjiu yu Linchuang Kangfu 2008;12(18):3497-3499
[www.zglckf.com/zglckf/ejournal/upfiles/08-18/18k-3497(ps).pdf]

肺泡上皮组织是肺脏的重要结构之一，主要由Ⅰ、Ⅱ型肺泡上皮细胞组成。肺泡Ⅱ型上皮细胞是合成、储存、分泌肺表面活性物质的场所，对维持肺泡稳定性、防止肺泡萎陷、保持肺的顺应性起着主要的作用。各种病因导致的肺表面活性物质缺乏均可以导致呼吸窘迫综合征的发生，对肺泡Ⅱ型上皮细胞的培养及鉴定方法进行探讨可以为肺发育及肺损伤等研究提供可靠的实验依据。

设计：观察性实验。
时间及地点：实验于2007-10/12在北京军区总医院附属八一儿童医院实验室完成。
材料：孕19 d SD大鼠，雌雄SD大鼠以 2∶1比例合笼，次日晨8：00查雌鼠阴道分泌物，镜下看到精子记为0 d。雌鼠体质量200~220 g，雄鼠体质量250~300 g，由北京军事医学科学院动物研究所提供。
主要试剂及仪器：最低必需培养基（MEM，eagle’s mininmal essential medium）、胎牛血清均为美国Hyclone公司产品；胰蛋白酶、Ⅳ型胶原酶、FITC、Texas red（美国Sigma公司）；羊抗SP-C一抗、兔抗AQP5一抗（美国Santa cruz公司）。体积分数为0.05的CO2培养箱（日本三洋公司）；倒置显微镜、激光共聚焦显微镜（日本尼康公司）；JEM-1230型透射电镜（日本电厂公司）等。
方法：
组织的取材：将SD大鼠用50 g/L 的戊巴比妥 2 mL/kg（50 mg/kg）腹腔注射麻醉，体积分数为0.75的乙醇浸泡消毒1.0~2.0 min 后，超净台内剖腹取出胎鼠，快速取出胎鼠肺组织置于冷的磷酸盐缓冲液中，尽量去除气管、支气管、血管组织，磷酸盐缓冲液冲洗至洗液清亮后将肺组织剪至1 mm× 1 mm 的小块，置于15 mL 离心管内再次用磷酸盐缓冲液反复清洗至清洗液清亮。
肺组织的消化和肺泡Ⅱ型上皮细胞的纯化：在盛有肺组织碎块的离心管内加入1 g/L 胰蛋白酶约6~8 mL（每只胎鼠约0.5 mL），吸管吹打混悬后置于孵育箱内5 min 取出，吸管充分吹打后加入1 mL 胎牛血清终止消化，1 200 r/min离心8 min 后弃去上清，加入1 g/L Ⅳ型胶原酶6~8 mL（每只胎鼠

约0.5 mL），吸管吹打混悬后置于孵育箱内15 min 取出，1 mL 胎牛血清终止消化后吸管充分吹打混匀，100目筛网过滤，1 200 r/min 离心8 min 后弃去上清，用含体积分数为0.2胎牛血清的MEM 20 mL 悬浮沉淀，接种在大鼠IgG包被的培养瓶中，40 min 后吸出含贴壁细胞的液体接种于另一大鼠IgG包被的培养瓶中，如此反复3次，最后吸出的未贴壁细胞即是肺泡Ⅱ型细胞。1 200 r/min 离心8 min 后重悬沉淀，调整细胞浓度为(2.0~5.0)× 108 L-1，接种于各种相应的培养器皿中。
细胞活力检测：在差速贴壁筛选后及培养的24，48，72 h后分别取100 μL 细胞悬液和 100 μL 4 g/L 锥虫蓝混合，计数500个细胞，据染的即为活细胞。
肺泡Ⅱ型上皮细胞的鉴定：
电镜鉴定：分别取各时间点的细胞，25 g/L 戊二醛固定24 h 后，按照电镜制作步骤进行透射电镜观察。
激光共聚焦显微镜观察：将各时间点细胞经多聚甲醛固定后磷酸盐缓冲液清洗3次，加入1∶500的羊抗SP-C一抗和兔抗AQP5一抗后，4 ℃ 冰箱过夜，第2天分别加入抗羊FITC和Texas Red标记羊抗兔IgG，室温孵育2 h 后磷酸盐缓冲液清洗，加入hochest 33342避光染色20 min，磷酸盐缓冲液清洗后20%甘油封闭，共聚焦显微镜下观察，一方面观察SP-C、AQP5的表达情况，另一方面每个培养皿选取10个视野，根据细胞核数和胞浆中SP-C阳性表达数计算肺泡Ⅱ型上皮细胞占所有细胞的百分数，肺泡Ⅱ型上皮细胞百分数（%）=SP-C阳性表达细胞数/细胞核数×100%。hochest 33342激发波长为408 nm，FITC激发波长为488 nm，Texas Red激发波长为543 nm。
主要观察指标：①肺泡Ⅱ型上皮细胞分离、纯化和培养过程及生长情况。②肺泡Ⅱ型上皮细胞电镜下形态特点。③共聚焦显微镜观察肺泡Ⅰ,Ⅱ型上皮细胞各自的特异标志物AQP5, SP-C的荧光表达。
设计、实施、评估者：实验设计为第一、四作者，干预实施为第三作者，评估为第二作者。均经过正规培训，采用盲法评估。
统计学分析：由第一作者采用SPSS 11.5软件完成统计处理。

2.1 倒置显微镜观察肺泡Ⅱ型上皮细胞的形态培养8 h 后细胞即已贴壁，倒置显微镜下观察细胞呈岛状分布，见图1，细胞核及核仁明显，胞浆内见较多颗粒。48 h 后细胞体积明显增大，并可见双核细胞，岛状分布的细胞向外周生长，相邻的岛状分布的细胞交接在一起，平铺瓶底的肺泡Ⅱ型细胞呈铺路石样，见图2。

2.2 培养细胞的活力 24，48，72 h 细胞活力分别为（92.3±1.8）%，（93.4±1.4）%，（91.5±2.3）%。
2.3 电镜观察肺泡Ⅱ型上皮细胞的形态细胞分散，细胞表面见微绒毛样突起，细胞器丰富，可见线粒体、内质网、溶酶体及较多板层小体，细胞核圆形或不规则型，见图3。

2.4 激光共聚焦显微镜观察SP-C、AQP5阳性表达可见胞浆中呈现绿色荧光的SP-C表达，未见有红色荧光，见图4。紫外激发条件下，胞核呈现蓝色。培养24，48，72 h 肺泡Ⅱ型上皮细胞阳性细胞数分别为（93.3±1.5）%，（94.2±2.4）%，（91.7±1.9）%。

肺泡Ⅱ型上皮细胞是肺上皮细胞的重要组成部分，呈小的立方形，覆盖约5%的肺泡表面，占肺泡上皮细胞的60%，占外周肺组织细胞的15%，其主要作用是合成和分泌肺表面活性物质。众多研究亦显示肺泡Ⅱ型上皮细胞在肺泡上皮损伤时可以产生超常增生，不但可以分裂形成Ⅱ型细胞，还可以转化为Ⅰ型细胞，从而被认为是Ⅰ型细胞的祖细胞[1]。正因为肺泡Ⅱ型上皮细胞对维持肺组织的正常生理功能和损伤时的组织修复具有极其重要的作用，所以观察肺泡Ⅱ型上皮细胞的体外培养可以为进一步进行肺组织细胞的研究提供实验依据。
肺泡Ⅱ型上皮细胞尚未建立细胞系，所以该细胞的培养需进行原代培养。培养过程中，肺泡Ⅱ型上皮细胞易发生代谢和形态学的改变[2]，并容易受成纤维细胞的污染，目前常用的培养纯化方法是胰蛋白酶消化加差速贴壁法，本文参考相关文献[3]报道的培养方法，并进行改良，将每次经过IgG包被筛选的悬浮细胞不需经过再次离心换液直接加入另一包被瓶继续培养，缩短了原代培养操作时间，减少了污染机会。同时，采用孕19 d 剖腹取出的胎鼠肺组织进行细胞培养，也较一些文献报道的采用成年鼠肺组织进行细胞培养的污染机会明显缩小。有研究认为纯化肺泡Ⅱ型上皮细胞，19 d 的胎鼠肺可以达到91%，21 d 的胎鼠能达到79%[4]。本实验采用孕19 d 的胎鼠进行原代培养，提高了纯化程度。不同的培养方式，如消化时间的不同可能影响细胞的纯度、活力及生存时间，这几点又是研究肺泡Ⅱ型上皮细胞功能的关键因素[5]。本实验选择合适的消化时间及纯化方式，使细胞的纯度、活力及生存时间均得到保证。此外，Reynolds等[6]观察到不同接种密度对培养的肺泡Ⅱ型上皮细胞的转分化有一定影响，研究发现接种密度为4×106 L-1 时最有利于保持它的细胞形状、板层体结构、碱性磷酸酶和γ谷胺酰转肽酶活性，所以本实验采用了此接种密度。
肺泡Ⅱ型上皮细胞的鉴定主要靠其自身的形态及其特异性表达标志物，肺泡Ⅱ型上皮细胞特异表达的物质较多，如SP-C，SP-A，SP-B，SP-D，AKP，APN等，完全分化的肺泡Ⅱ型上皮细胞最有特征的表型是表达表面活性蛋白，特别是SP-C，它是仅在肺泡Ⅱ型上皮细胞表达的惟一活性蛋白，故可以用它来鉴定肺泡Ⅱ型上皮细胞[7]。AQP5是水通道蛋白中的一类亚型，在肺组织特异表达于肺泡Ⅰ型上皮细胞的细胞膜，所以可以用它的阳性表达来鉴定肺泡Ⅰ型上皮细胞，本实验中共聚焦显微镜的观察结果显示筛选后所得细胞胞浆中表达SP-C，且显示Ⅱ型上皮细胞比例占90%以上，这些细胞无AQP5的阳性红色荧光表达。电镜下观察肺泡Ⅱ型上皮细胞呈圆形或立方形，细胞器丰富，胞质内含吞饮小泡，含特征性板层小体及大量微绒毛[8]。研究结果与之相符，证实是肺泡Ⅱ型上皮细胞。在众多鉴定方法中，电镜被认为是“金标准”，但不同的生长时期细胞内的板层小体可能不同，且电镜制作程序较复杂，对于各种免疫荧光技术，例如激光共聚焦显微镜亦可达到鉴定肺泡Ⅱ型上皮细胞的目的，且有操作简单易行的优点，可以根据实验情况和拥有条件进行选择，达到有效鉴定的目的。

1 Adamson IY，Bowden DH. The type 2 cell as progenitor of alveolar epithelial regeneration. A cytodynamic study in mice after exposure to oxygen. Lab Invest 1974;30(1):35-42
2 Luo ZQ, Sun XH, Qin XQ. Shengli Xuebao 1999;51（3）:24
罗自强，孙秀泓，秦晓群. C-fos基因在内皮素-1促肺泡Ⅱ型细胞表面活性物质合成中的作用[J].生理学报，1999，51（3）：24
3 Zhu HP, Chang LW, Li WB, et al. Huazhong Keji Daxue Xuebao 2004；32(6):596-600
祝华平，常立文，李文斌，等.胎鼠肺细胞的纯化及原代培养[J].华中科技大学学报，2004，32(6)：596-600
4 Batenburg JJ, Otto-Verberne CJ, Ten Have-Opbroek AA, et al. Isolation of alveolar type Ⅱ cells from fetal rat lung by differential adherence in monolayer culture. Biochim Biophys Acta 1988;960(3):441-453
5 Lealie CC, McCormick-Shannon K, Mason RJ, et al. Proliferation of rat alveolar epithelial cells in low density primary culture. Am J Respir Cell Mol Biol 1993;9 (1):64-72
6 Reynolds LJ, McElroy M, Richards RJ. Density and substrata are important in lung type Ⅱ cell transdifferentiation in vitro. Int J Biochem Cell Biol 1999;31(9):951-960
7 Mason RJ, Kalina M, Nielsen LD, et al. Surfactant protein C expression in urethane-induced murine pulmonary tumors. Am J Pathol 2000;156(1):175-182
8 Chen J, Chen Z, Narasaraju T, et al. Isolation of highly pure alveolar epithelial type I and type Ⅱ cells from rat lungs. Lab Invest 2004;84(6):727-735