课题背景：实验为国家自然科学基金课题“大网膜包盖促进血管再生，不同发展程度的组织工程气管原位重建的动物实验研究”的一部分。课题侧重探讨组织工程人工气管植入受体后的早期血管再生机制和不同发展程度的组织工程气管的利弊。

应用要点：实验采用大鼠剑突软骨细胞种植于新型生物材料DegraPol管状支架，在体外静态培养条件下，获得了管状的工程化组织，组织学和力学检测显示DegraPol材料与大鼠剑突软骨细胞有良好的生物相容性，同时工程化组织具备一定力学强度。

同行评价：人工生物气管研究已取得很大进展，远远超出了细胞培养的水平，已有动物模型移植成功的报道，临床也有其他种类人工气管移植成功的个案报道。本文提出了新的获取软骨细胞的方法，并获得成功，为人工生物气管的研究提供了新的方法。

暨南大学第二临床医学院深圳市人民医院，1胸外科，2检验医学部，广东省深圳市 518020

杨 林☆，男，1970年生，湖北省人，汉族，2000/2004年瑞士苏黎世大学医院胸外科，博士后，副主任医师，主要从事气管组织工程，肺移植免疫研究。Yanglin70@
yahoo.com

国家自然科学基金资助项目（30500499）*

摘要
背景：前期实验已证实人气管软骨细胞在DegraPol片状支架上保持了正常的形态和活力，同时分泌软骨特有基质成分。
目的：以大鼠剑突软骨细胞为种子细胞种植于DegraPol管状泡沫支架，观察新形成的工程化组织在体外静态培养条件下的组织和力学特点。
设计、时间及地点：单一样本观察，于2006-12/2008-02在深圳市人民医院医学研究中心完成。
材料：DegraPol管状材料为瑞士联邦理工大学聚合材料研究所提供；实验动物为2周龄体质量50~60 g的SPF级SD幼鼠。
方法：收集第3代幼鼠剑突软骨细胞接种于DegraPol管状支架，形成软骨细胞-支架复合物，体外静态培养6周。
主要观察指标：① AO/PI荧光染色观察软骨细胞在DegraPol管状泡沫支架中的存活情况，于培养3，6周取出软骨细胞-DegraPol支架复合体，MTT法测定细胞增殖情况。②培养3，6周，应力-应变机械力学方法测定最大应变和应力的变化。③培养3，6周，扫描电镜观察软骨细胞在DegraPol支架中培养后的超微结构。
结果：①AO/PI荧光染色显示软骨细胞在DegraPol支架内保持良好的活性，MTT法结果显示培养6周组A值高于培养3周组(P < 0.05)。②应力-应变机械力学测定结果显示，培养3周组应力值和应变值高于培养6周组 (P < 0.05)。③扫描电镜结果显示DegraPol支架与大鼠剑突软骨细胞有良好的生物相容性，培养6周后获得更多的软骨细胞增殖和更多的细胞外基质。
结论：DegraPol管状泡沫支架有良好的生物相容性并且软骨细胞在支架上保持正常活性，但由于工程化复合物的生物力学强度较差，培养条件和培养方式有待进一步改善。
关键词：组织工程；剑突软骨细胞；管状支架；生物相容性；生物材料

杨林，武延格，纪玲，王正.管状支架体外静态培养组织工程气管软骨[J].中国组织工程研究与临床康复，2008，12(19):3601-3604 [www.zglckf.com/zglckf/ejournal/upfiles/08-19/19k-3601(ps).pdf]

中图分类号:R318
文献标识码:A
文章编号:1673-8225
(2008)19-03601-04

收稿日期：2008-03-21修回日期：2008-04-21 (54200803210012/N·Y)

Static culture of tissue-engineered tracheal cartilage with scaffolds in vitro

Abstract

BACKGROUND:The human cartilage tracheal chondrocytes can retain their normal morphous and activity on the DegraPol scaffold, and simultaneously excrete cartilage specific matrix.
OBJECTIVE: Rat xiphoid chondrocytes were seeded and cultivated on DegraPol scaffolds, to aim directly at the histology and mechanical characteristic of tissue-engineered tracheal cartilage during the static culture in vitro.
DESIGN, TIME AND SETTING: A single sample observation was carried out in the Medical Science Research Center of Shenzhen People's Hospital (Shenzhen, Guangdong, China) from December 2006 to February 2008.
MATERIALS: DegraPol scaffolds were provided by Swiss Federal Institute of Technology (Zurich). SD rats of SPF grade and aged 2 weeks, were provided by the Experimental Animal Center of Guangdong Province (China).
METHODS: The third passage of rat xiphoid chondrocytes were seeded onto DegraPol scaffolds to develop the chondrocyte-scaffold composites, which were cultured for 6 weeks in vitro.
MAIN OUTCOME MEASURES: The survival status of chondrocytes was examined by AO/PI fluorescent stain, and MTT test was used to determine viable cells at weeks 3 and 6 when the chondrocyte-scaffold composites were took out. The stress-strain mechanical force analysis of maximal stress and maximal strain, together with the ultrastructure of the chondrocytes on DegraPol scaffold was observed under scanning electron microscope.
RESULTS: AO/PI stain showed chondrocytes possess favorable activity on DegraPol scaffolds. MTT assay showed the A values at week 3 of the culture was lower than that at week 6 (P < 0.05). The maximal strain load strength test was (1.43±0.58) mm/mm at week 3，(0.48±0.07) mm/mm at week 6. The stress-strain mechanical force analysis showed that, the maximal stress and the maximal strain were higher at week 3 of the culture compared with week 6 (P < 0.05). Scanning electron microscopy showed more cell proliferation and more extracellular matrix were found at week 6, which indicated the good histocompatibility between DegraPol scaffolds and rat xiphoid chondrocytes.
CONCLUSION: DegraPol scaffolds have favorable biocompatibility, and chondrocytes seeded on scaffolds possess normal viability. However, the biomechanical strength of engineered composites is so weak that the culture condition and style need to be improved.

Yang L, Wu YG, Ji L, Wang Z. Static culture of tissue-engineered tracheal cartilage with scaffolds in vitro.Zhongguo Zuzhi Gongcheng Yanjiu yu Linchuang Kangfu 2008;12(19):3601-3604
[www.zglckf.com/zglckf/ejournal/upfiles/08-19/19k-3601(ps).pdf]

0 引言

气管的修复与与重建经历不断探索和研究，采用了同种异体移植、自体组织移植以及人工材料替代物等方法，都存在着不足[1-3]。组织工程技术是将种子细胞与支架材料复合，细胞在支架上黏附生长，形成新的具有生命力的组织或器官[4]。组织工程软骨修复气管缺损的研究，在体外培养和体内植入等方面已取得很大进展。作者在既往的研究中已经成功地利用分离培养的人气管软骨细胞体外合成组织工程气管软骨[5]。鉴于幼鼠的剑突软骨细胞易于获取，体外培养后还可以将组织工程化的组织进行体内培养或进行原位气管移植试验，因而实验选用大鼠剑突软骨细胞进行组织工程气管软骨的培养。本实验应用组织工程学方法，将软骨细胞种植于DegraPol管状支架上形成软骨细胞-支架复合物，采用体外静态培养条件，观察新形成的工程化组织的组织学和力学特点，探索合适的气管替代物。

1 材料和方法

设计：单一样本观察。
单位：深圳市人民医院医学研究中心。
材料：实验于2006-12/2008-02在深圳市人民医院医学研究中心完成。选用2周龄体质量50~60 g的SPF级SD幼鼠，由广东省医学实验动物中心（许可证号SCXK(粤) 2003-0002）提供，实验过程中动物处置符合动物伦理学标准。

支架材料：DegraPol (3-D polyest-eruthane polymer)材料由瑞士联邦理工大学聚合材料研究所提供。采用冷沉淀技术将DegraPol材料制成泡沫管状支架[6]。支架长20 mm，内、外径分别为2.5 mm /4.0 mm，管壁厚度为0.75 mm（管壁厚度为内、外径之差），环氧乙烷消毒后，置于已灭菌的培养瓶中备用。
技术路线：
软骨细胞的分离、传代：取SD幼鼠的剑突软骨，取出后立即在无菌超净台上去除软骨膜，放入含0.2%Ⅱ型胶原酶的无血清Ham＇s F12培养液中，37 ℃消化8 h。离心后收集细胞，种植入含体积分数为0.1的胎牛血清的Ham＇s F12培养液中，在细胞培养瓶中进行传代培养，倒置显微镜观察软骨细胞生长和增殖情况，于第3代收集软骨细胞。
软骨细胞与DegraPol支架的复合：收集浓度为2.4×1010 L-1 的软骨单细胞悬液0.1 mL。将DegraPol管状支架事先晾干置于6孔培养板中，软骨单细胞悬液均匀种植于DegraPol管状支架内侧面，再向6孔培养板中每孔加入10 mL Ham's F12培养液，将含软骨细胞-DegraPol支架复合物的培养板放入37 ℃、体积分数为0.05的CO2培养箱中静态培养3周和6周，空白支架浸泡于培养液中培养3周和6周作为对照组。
软骨细胞-DegraPol支架复合体内细胞的活性检测：软骨细胞-DegraPol支架复合体体外培养3 d后做AO/PI荧光染色。染色方法如下：AO (丫啶橙) 染液、PI(碘化丙啶) 染液用Dulbeccos 平衡液配制，AO：0.67 mmol/ L，PI：0.75 mmol/L。AO 染液0.15 mL、PI 染液1 mL、Dulbeccos 平衡液9 mL混合，过滤后与软骨细胞-DegraPol支架复合体混合5 min，荧光显微镜观察。蓝色滤光片激发绿光，着色的细胞为活细胞；绿色滤光片激发红光，着色的细胞为死细胞。
细胞增殖活性测定：采用MTT法[7]。噻唑蓝可透过细胞膜进入细胞内，活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性MTT还原为难溶于水的蓝紫色的针状结晶并沉积在细胞中，用酶联免疫检测仪在570 nm波长处测定其光吸收值，可反映细胞的增殖活力。取出培养3周和6周的细胞-支架复合物，每组6个标本，无菌PBS洗3遍移入12孔板，每孔加入500μL F12和40μL MTT液溶液，37 ℃孵箱培养1 h；吸弃上清液，加入800μL含10%甲酸的异丙醇液，37 ℃ 孵箱培养5 min，振荡器混匀10 min，立即于自动酶标仪570 nm波长下测定其吸光度值。
生物力学比较: 培养3，6周的管状组织工程复合物取出后，沿长轴方向剪成三四个长条，测定长条的长、宽和厚度。采用INSTRON 4505型材料试验机将长条夹持固定于拉力牵引器两端，然后沿长轴方向进行拉伸试验，以1 mm/s的速度移动，测定长条断裂前一刻所承受的最大拉力值，所移动的最大距离与原长度的比值为应变值。实验结束后计算机根据每一次测定并输入的长、宽和厚度值计算输出每一次测定的应力、应变值，取这些长条的均数值作为每一个管状工程化复合物的生物力学强度值，每组4个标本，以空白支架作为对照组。培养3，6周的管状组织工程复合物合物培养后的超微结构。
组织形态学观察:培养3，6周的组织工程复合物制备扫描电镜标本，以2%磷酸戊二醛溶液固定，梯度异丙醇脱水干燥，喷洒金包埋后电镜观察两组软骨细胞-支架复合物培养后的超微结构。
主要观察指标：①种植于支架材料上的软骨细胞的活性、细胞增殖情况。②工程化复合物的超微结构。③软骨细胞-DegraPol支架复合体的最大应变和应力变化。
设计、实施、评估者：实验设计、实施、评估由全部作者共同完成，均受过专业训练。
统计学分析：由第一作者采用 SPSS 11.0统计软件包进行分析。数据以_x±s表示，组间比较采用独立样本t检验，P < 0.05为有差异有显著性意义。

2 结果

2.1 软骨细胞在DegraPol支架中活性检测结果 软骨细胞-DegraPol支架复合体体外培养3 d后，AO/PI染色结果显示大多数软骨细胞呈绿色，少数软骨细胞呈现红色，表明软骨细胞种植于DegraPol支架上保持正常的形态和活力，见图1。

2.2 软骨细胞在DegraPol中的增殖活性 应用MTT法测定细胞增殖率A值，培养6周组高于培养3周组，差异有显著性意义（0.36±0.07，0.18±0.02，P < 0.05）。
2.3 软骨细胞-支架复合物体外培养的力学测定结果 应力-应变机械力学测定显示，培养3周组应力值和应变值高于培养6周组 (P < 0.05)。见表1。

2.4 软骨细胞-DegraPol复合物的组织形态学观察 扫描电镜显示DegraPol与大鼠剑突软骨细胞有良好的生物兼容性。与培养3周组相比，培养6周后DegraPol支架上有更多的软骨细胞增殖和更多的细胞外基质分泌，图2。

3 讨论

组织工程软骨培养的关键环节是有理想的细胞外基质材料和适宜的体外培养环境。目前软骨组织工程常用的支架材料主要有两类：一类是合成高分子材料，如聚乳酸，PGA及其共聚物PLGA等，但是存在着亲水性差，降解产物偏酸性，并且有一定的免疫原性。另一类是天然高分子材料，如胶原。Ⅱ型胶原降解太快，作为细胞支架时往往提前塌陷而达不到生产新组织的目的[8]。因此，寻找适宜的细胞支架材料是构建工程化软骨的研究热点[9-11]。
前期实验已证实人气管软骨细胞在DegraPol片状支架上保持了正常的形态和活力，同时分泌软骨特有基质成分。结果表明DegraPol片状支架是软骨细胞较为适宜的载体材料[5]。本实验将大鼠剑突软骨细胞种植于DegraPol管状支架上，研究工程化复合物的组织学和力学特点。结果证实大多数软骨细胞在支架上保持正常活性和较好的增殖率，并且随培养时间延长，培养6周组比3周组的获得更高的细胞增殖活性和更多的细胞外基质分泌，应力-应变机械力学测定显示培养3周的工程化软骨组织的应力值和应变值明显高于空白支架组。实验结果表明将DegraPol管状泡沫支架具有良好的生物相容性并且软骨细胞在支架上保持正常活性，并且工程化复合物具备一定的机械力学特性。
同时还发现，无论应力值还是应变值，静态培养6周的工程化组织明显低于培养3周组。原因可能是生物支架材料在体外培养液中由于降解丢失的生物力学强度更多。对于组织工程化软骨培养体外培养多久，达到何种结构强度，再移植到受体体内是合适的时机，目前尚无一致的意见。因此，工程化软骨组织体外培养时间和发展程度有待于进一步探讨。
静态培养环境不同于体内生理应力环境，形成的组织工程组织力学特性与生理性组织存在一定差距[12-13]。有研究表明生物反应器培养技术可以解决静态培养条件下培养液分布不均匀所致软骨层薄厚不均一等缺陷[14]，增强组织工程化软骨生物力学强度[15]。许多学者应用生物反应器模拟体内应力环境，取得了良好的效果[16-18]。
单纯通过体外静态培养获得的组织工程软骨由于其生物力学强度太差，无法直接用于原位气管移植重建。组织工程化人工气管仍处于探索阶段，改进体外培养条件提高工程化气管软骨的力学强度，有待进一步研究。

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