超高压脱细胞技术制备组织工程带瓣血管支架*☆○

殷猛1,刘锦纷1,藤里俊哉○2,凑谷谦司○2,中谷武嗣○2

1上海交通大学医学院上海儿童医学中心胸外科,上海市 200127； 2日本国立循环器病中心研究所再生医学部、脏器移植部，日本大阪府吹田市

殷猛☆，男，1972年生，黑龙江省哈尔滨市人，汉族，2006年上海交通大学医学院毕业，博士，主治医师，主要从事组织工程方法治疗胸外科疾病的研究。
yinmeng2001@
yahoo.com.cn

摘要
背景：研究表明同种瓣膜移植术后发生的退行性变性与其留存的细胞成分激发宿主免疫反应有显著的相关性。
目的：采用超高压结合核酸酶洗涤方法处理猪带瓣膜血管，观察瓣膜脱细胞的效果及猪内源性反转录病毒的去除情况。
设计、时间及地点：对比观察实验，于2004-04/2005-04在日本国立心血管病中心研究所完成。
材料：实验选用月龄1~3个月的健康雄性迷你猪幼猪，体质量3~5 kg。
方法：无菌条件下取出猪带瓣肺动脉血管，分为3组：对照组：无任何处理。表面活性剂组：将带瓣管道用Triton X-100溶液浸渍、搅拌24 h后洗净。超高压处理组：用超高压设备以981 MPa超高静水压（4 ℃）将供体来源细胞压碎，结合核酸酶的消化作用，磷酸盐缓冲液的搅拌洗涤，脱去细胞残片形成带瓣膜血管支架。
主要观察指标：光镜下观察支架形态结构，透射电镜下观察支架细胞成分去除和支架纤维保留情况，扫描电镜观察支架表面的超微结构。观察两种方法处理瓣膜的弹性率差异。检测猪内源性反转录病毒前病毒DNA。定量检测超高压脱细胞前后带瓣管道中DNA含量的变化。
结果：①超高压处理组瓣叶及瓣根组织表面及内部细胞完全消失，保留了细胞外基质，DNA含量显著降低。表面活性剂组瓣根组织深部的细胞无法渗透、除去。②超高压处理组瓣膜弹性率几乎不变，瓣膜功能保持较好。表面活性剂组瓣膜弹性率增加。③超高压处理组猪内源性反转录病毒被成功灭活，无法测出。表面活性剂组无法将猪内源性反转录病毒灭活。
结论：采用超高压脱细胞方法可基本除去支架内细胞成分，可将内源性反转录病毒成功灭活，保持了细胞外基质结构和功能的完整性，脱细胞效果优于表面活性剂方法。
关键词：同种带瓣血管；支架；脱细胞；猪内源性反转录病毒；超高压；生物材料

殷猛，刘锦纷，藤里俊哉，凑谷谦司，中谷武嗣.超高压脱细胞技术制备组织工程带瓣血管支架[J].中国组织工程研究与临床康复，2008，12(19):3605-3608 [www.zglckf.com/zglckf/ejournal/upfiles/08-19/19k-3605(ps).pdf]

Tissue-engineered blood vessel scaffolds with valves prepared by hyperpressure acellular technique

BACKGROUND:Retrograde degeneration after homogenic valvotransplantation is significantly correlated to host immune response activated by remaining cell components.
OBJECTIVE: Porcine vessels with valve were managed by ultrahigh pressure combined with nuclease to observe the acellular valve effect and porcine endogenous retrovirus removal
DESIGN, TIME AND SETTING: The control observation experiment was performed at the National Cardiovascular Center of Japan from April 2004 to April 2005.
MATERIALS: 1-3 months old healthy male minipig weighing 3-5 kg were used in this study.
METHODS: Pulmonary arterial vessels were sterilely isolated from minipig and divided into three groups. Pulmonary arterial vessels in the control group were intact. Pulmonary arterial vessels in the surface-active agent group were immersed in Triton X-100 solution, stirred and cleaned 24 hours later. Pulmonary arterial vessels in the hyperpressure group treated by cold isostatic pressing (CIP) at 4 ℃ under 981 MPa for disruption of donor-derived cells. The cell debris was then washed out in phosphate buffer saline (PBS) and nuclease.
MAIN OUTCOME MEASURES: Vessel stent morphous was observed under a light microscope. Cell component removal and stent fiber reservation were recorded with a transmission electron microscope. Stent ultrastructure was checked with a scanning electron microscope. Differences in elastic rate of valve were measured by two methods. Provirus DNA of endogenous retrovirus was detected. DNA content in vessels was examined before and after hyperpressure.
RESULTS: Cells on surface and inner valve leaflet and valve root disappeared in the hyperpressure group, but extracellular matrix was remaining. DNA content was significantly degraded in the treated tissue. Cells in deep valve leaflet could not be removed in the surface-active agent group. Elastic rate and function of the valve nearly did not change in the hyperpressure group. Elastic rate of the valve increased in the surface-active agent group. Porcine endogeneous retrovirus was inactivated and could not be detected in the hyperpressure group. Porcine endogeneous retrovirus was measured in the surface-active agent group.
CONCLUSION: Cells in the stent can be removed and endogeneous retrovirus is inactivated by hyperpressure acellular method. This makes the structure and function of extracellular matrix integrated. The outcome of acellular method is better than that of surface-active agent.

Yin M, Liu JF, Fujisato T, Minatoya K, Nakatani T.Tissue-engineered blood vessel scaffolds with valves prepared by hyperpressure acellular technique.Zhongguo Zuzhi Gongcheng Yanjiu yu Linchuang Kangfu 2008;12(19):3605-3608
[www.zglckf.com/zglckf/ejournal/upfiles/08-19/19k-3605(ps).pdf]

1962年，Ross医师首次将天然同种生物瓣膜应用于主动脉瓣置换术。1966年，Ross又第一次将人同种带瓣血管（Homograft）应用于右室流出道重建术中[1]。同种心脏瓣膜及其带瓣管道具有优良的血流动力学效果、抗感染性良好[2]。在抗血栓性方面，优于机械瓣，在耐久性方面又优于异种生物瓣。广泛地应用于瓣膜置换术及复杂先天性心脏病纠治手术中，取得了良好的临床效果。但Homograft的供体来源有限，满足不了临床需要。其次部分患者(特别是低年龄患者)术后较早即出现瓣膜退行性变性（瓣叶增厚、毁损、钙化、纤维化）以及导管部分内膜增厚、狭窄、钙化，需要再次更换带瓣管道，增加了患者痛苦和国民经济负担，这些都限制了带瓣管道的临床应用。研究发现，同种瓣膜组织中的细胞成分表达较强的抗原性，尤其内皮细胞，经液氮保存后，残留的内皮细胞仍能完整地表达人类白细胞抗原。移植于体内可激发免疫反应，且与瓣膜退行性变性有显著的相关性[3]。细胞外基质结构和功能的完整性则是同种组织瓣长期耐久性的决定因素。本实验通过采用一种新的更安全的抗原去除技术——超高压脱细胞方法将幼猪带瓣血管上的抗原成分去除，但仍保留其组织结构，制成脱细胞带瓣血管支架。出于对移植物安全性的考虑，本实验对超高压方法对病原微生物杀灭效果也进行了评估。希望通过实验能避免带瓣血管移植术后狭窄钙化的发生，保持耐久性和生长性，提供一种更加安全的生物瓣膜支架材料。

设计：对比观察实验。
时间及地点：实验于2004-04/2005-04在日本国立心血管病中心研究所完成。
材料：选用健康雄性迷你猪幼猪，月龄1~3个月，体质量3~5 kg，由日本九州鹿儿岛Japan Farm 食用猪养殖场提供。实验过程中对动物的处置符合动物伦理学标准。主要试剂：Triton-X 100（美国AMRESCO公司）；RNase I、DNase I、D-Hank液、磷酸盐缓冲液、EBM液（美国Sigma公司）；MiliQ水（日本日立公司）；乙二胺四乙酸（美国AMRESCO公司）；抗生素（日本明治生命制药会社）。仪器：Hoechst 33258荧光探针（日本同仁化学研究所），超高压设备KOBELCO（神户制钢所）；光学显微镜（NIKON ECLIPSS TE200）；光学数码显微镜（NIKON DIGITAL CAMERA DXM1200）；聚合酶链反应仪（GENEAMP PCR SYSTEM 9700）；生物拉力实验机（日本 RTC-1150A）；生理监护仪（日本光电BSM-5192）；手术台（日本夏目制作所）；双蒸水蒸馏器（日本日立公司）； SP101离心泵（泰尔茂，日本）。
技术路线：
带瓣血管脱细胞处理：在麻醉、无菌条件下取出幼猪带瓣肺动脉管道，用D-Hank液和MiliQ水洗净后分为3组：对照组：无任何处理，带瓣管道将置入4 ℃含有磷酸盐缓冲液的密封容器内（内有抗生素），保存备用。表面活性剂组：将带瓣管道放入含有20 mg/L RNase A、200 mg/L DNase I和0.02%乙二胺四乙酸二钠的1%Triton X-100溶液中，浸渍/搅拌24 h (37 ℃，体积分数为0.05的CO2环境内)。用磷酸盐缓冲液洗净2周后置入4 ℃含有磷酸盐缓冲液的密封容器内（内有抗生素），保存备用。超高压处理组：将带瓣管道放入特制塑料袋中，袋中浸满MiliQ水。将塑料袋置入超高压机器中，压力981 MPa，4 ℃，加压10 min后，无菌条件下将内层特制塑料袋中的血管取出，置入含有20 mg/L RNase A, 200 mg/L DNase I和0.02%乙二胺四乙酸二钠的EBM溶液中，冲洗1周（37 ℃，体积分数0.05 CO2环境内搅拌），然后在体积分数0.8的乙醇中浸洗3 d，然后用磷酸盐缓冲液洗净1 d。置入4 ℃含有磷酸盐缓冲液的密封容器内（内有抗生素），保存备用。
组织学观察：将带瓣管道用40 g/L中性甲醛溶液固定48 h，依次乙醇脱水、二甲苯透明后，常规石蜡包埋，切片5 μmol/L，行苏木精-伊红染色，100倍光镜下观察胶原纤维染成淡红色，细胞核染成蓝色。
超微结构观察：①透射电镜：将带瓣管道用磷酸盐缓冲液冲洗干净后，40 g/L戊二醛固定，磷酸盐缓冲液冲洗，10 g/L饿酸固定，磷酸盐缓冲液冲洗，乙醇、丙酮逐级脱水，Epon 812环氧树酯浸泡、包埋，LKB超薄切片机切片，铀染色20 min，铅染色10 min，日本JEMl00cx型透射电镜观察细胞成分去除和支架纤维保留情况。②扫描电镜：将带瓣管道用磷酸盐缓冲液冲洗干净后，3%戊二醛同定，磷酸盐缓冲液冲洗，l%锇酸固定，磷酸盐缓冲液冲洗，乙醇及丙酮逐级脱水，醋酸异戊脂置换，临界点干燥，铂、钯合金离子喷涂，JBM5200型扫描电镜观察支架的超微结构。
瓣膜的生物力学特性：应用生物拉力实验机比较超高压脱细胞瓣膜与表面活性剂处理瓣膜在弹性率方面的差异。
内源性反转录病毒的检测:以内源性反转录病毒

gag基因（日本国立心血管病中心研究所再生医学部）为靶序列，选用特定的引物序列，用聚合酶链反应方法检测带瓣管道中猪内源性反转录病毒前病毒DNA。
DNA含量测定:利用Hoechst 33258荧光探针，定量检测超高压脱细胞前后带瓣管道中DNA含量的变化。
主要观察指标：瓣膜的组织学和超微结构表现，瓣膜的弹性率，内源性反转录病毒灭活情况，带瓣管道中DNA含量变化。
设计、实施、评估者：设计为第一作者，实施为全部作者，评估为第三作者，评估者经过正规培训。
统计学方法: 由第一作者采用SPSS 8.0进行数据处理，数据以_x±s表示，两样本均数比较采用组间或配对比较t检验，显著性标准为P < 0.05。

对照组：
瓣叶纤维层、海绵层、心内膜层三层结构完整，表面和中间仍保留原有的细胞分布，内皮细胞覆盖在瓣叶上下两层表面，其间为肌纤维母细胞，细胞无自溶现象，纤维结构里波浪状，无损伤，见图1a。
瓣根组织内保留原有的细胞分布，结构完整，见图1b。

表面活性剂组和超高压处理组：
两组瓣叶组织表面及中间细胞均完全消失，脱细胞效果好。纤维波浪状结构保存完好，纤维层、海绵层、心内膜层三层结构去除细胞后，按纤维网状可以辨认，见图1c，d。
但两组瓣根组织差异较大。表面活性剂组瓣根组织深部的细胞无法渗透、除去，超高压处理组瓣根组织内的细胞均被除去，见图1e，f。

2.2 超微结构表现透射电镜见超高压处理组带瓣管道细胞成分均已消失。但保留有胶原纤维和弹性纤维。胶原纤维排列整齐，纤维横纹清晰，无溶解和断裂现象。扫描电镜见超高压处理组带瓣管道细胞已被完全脱去，只剩细胞外基质。脱细胞瓣叶表面粗大的胶原纤维束结构保存完好，表面无细胞覆盖。
2.3 瓣膜的弹性率表面活性剂组瓣膜弹性率增加，意味着变硬，承受负荷后变形也少，顺应性差。超高压处理组瓣膜弹性率几乎不变，意味着瓣膜功能保持较好，顺应性好，见图2。
2.4 内源性反转录病毒灭活超高压处理组经过超高压处理，内源性反转录病毒被成功灭活，无法测出。而表面活性剂组则无法将内源性反转录病毒灭活，见图3。
2.5 DNA含量超高压处理组超高压脱细胞处理前，带瓣管道中DNA含量为（31.9±3.7）mg/L；超高压脱细胞处理后，DNA含量为(1.2±0.1) mg/L；DNA含量较超高压脱细胞处理前显著降低（t=23.4，P < 0.01）,提示超高压脱细胞方法已将细胞核及内容物大部分除去。

先天性心脏病手术中需要大量带瓣膜血管替代物。1966年，Ross第一次将人同种带瓣血管（Homograft）应用于先心病右室流出道重建术中[1]。从此Homograft的应用甚为普遍。但其使用中也发现许多问题：瓣膜、血管逐渐失功、狭窄、钙化、退行性变性、难以消除难控性医源性疾病传播等。个别低龄患者使用不到1年就发生以导管部分钙化为特征的瓣膜退行性变性，严重影响瓣膜血管功能。而且今天社会上艾滋病、非典型肺炎的出现不得不考虑移植物安全问题，将移植物上的病原微生物杀灭是其临床应用安全性的基础和前提。
研究发现，同种瓣膜组织中的细胞成分表达较强的抗原性，尤其内皮细胞，经液氮保存后，残留的内皮细胞仍能完整地表达人类白细胞抗原。移植于体内可激发免疫反应，且与瓣膜退行性变性有显著的相关性[3]，是带瓣膜血管失功、钙化的主要原因之一。细胞外基质结构和功能的完整性则是同种组织瓣长期耐久性的决定因素。
采用组织工程学技术去除同种带瓣管道中的抗原成分是解决该问题的方法之一。目前常用的脱细胞方法多联合应用表面活性剂、胰酶、核酸酶等脱去生物瓣膜支架中的细胞成分。由于洗净液对组织的渗透性较低，对于一定厚度的组织，除去其内部的细胞很困难。而且高浓度的胰酶可引起支架结构的破坏，而低浓度胰酶又不能去除瓣根、动脉壁深部的细胞成分，脱细胞效果并不理想，无法彻底地将供体细胞全部去除。洗净需要数周以上的时间，可能会改变生物力学性状并可能增加感染机会。表面活性剂本身系化学物质，对人体也有毒性，洗净后仍会有一定浓度的残留，对患者的健康造成危害。
本实验采用超高压脱细胞方法来进行猪同种带瓣血管的脱细胞化。超高压处理是液体介质短时间内等同压缩过程(静水压,等方压)，能使生物体高分子立体结构中氢键、疏水键、离子键等非共价键发生变化，从而使蛋白质变性、酶失活，细胞膜破裂、菌体内成分泄漏、生命活动停止。利用超高压将猪心瓣膜血管内的供体来源细胞压碎，结合低浓度核酸酶消化、然后用缓冲液冲洗的脱细胞方法，可以达到脱细胞效果好、同时杀灭病原微生物的目的。本实验中组织学、超微结构、生物力学、分子生物学、免疫组织化学结果证实超高压脱细胞方法能简便、高效、低毒地将供体来源细胞去除干净，优于表面活性剂组的脱细胞效果。而瓣膜功能和顺应性方面保持良好也优于表面活性剂方法。细胞外基质结构和功能的完整性也得以保全。
本实验采用幼猪带瓣血管进行研究。移植生物来源的组织和器官均有感染病原微生物（如猪内源性反转录病毒）的风险，猪内源性反转录病毒在体外可以感染人的多种细胞[4-5]。在移植前能否将带瓣膜血管中的病毒、细菌完全清除是保证其临床应用安全的前提条件。能将芽孢灭活的981 MPa超高压力对病毒包膜有强大的破坏作用，它使毒株的蛋白外漏，导致反转录酶失活，从而失去传染性[6-7]。本实验证实超高压方法可以安全方便地将猪带瓣血管中的内源性反转录病毒灭活，而表面活性剂方法无法将其灭活。在移植物安全方面，超高压脱细胞方法与表面活性剂方法相比，也显出其巨大优势。
结论：本实验证明采用超高压脱细胞方法可基本除去支架内细胞成分，可以将病原微生物杀灭（将内源性反转录病毒成功灭活）。超高压脱细胞方法给组织工程学的研究提供了新思路。

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4 Leyh RG, Wilhelmi M, Walles T, et al. Acellularized porcine heart valve scaffolds for heart valve tissue engineering and the risk of cross-species transmission of porcine endogenous retrovirus.J Thorac Cardiovasc Surg 2003;126(4):1000-1004
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