羟基磷灰石/聚乳酸-三亚甲基碳酸酯软腭植入材料的生物相容性与安全性*☆

汪建1，付晓燕1，熊敏1，张余2

解放军广州军区广州总医院，1耳鼻咽候科，2骨科，广东省广州市 510010

汪建☆，男，1960年生，四川省成都市人，汉族，1998年华西医科大学毕业，博士，教授，主任医师，主要从事鼾症、鼻内窥镜手术的研究。
iamxiaoyanfu@
yahoo.com.cn

广东省自然科学基金资助项目（5000131）课题名称：软腭植入材料的生物医学材料研究*

摘要
背景：软腭植入材料目前多采用聚对苯二甲酸乙二醇酯，由于其价格昂贵，且有轻度排斥反应，远期的生物学效应也尚不肯定，限制了其临床应用。
目的：与聚对苯二甲酸乙二醇酯对照，评价羟基磷灰石/聚乳酸-三亚甲基碳酸酯复合材料软腭植入材料的生物相容性与安全性。
设计、时间及地点：随机分组设计、动物对照实验，于2006-10/2007-05在解放军广州军区总医院医学实验科生物人工骨实验室及广州医学院实验动物中心完成。
材料：羟基磷灰石为解放军广州军区总医院医学实验科生物人工骨实验室研制，聚乳酸-三亚甲基碳酸酯为济南岱罡生物科技有限公司产品，聚对苯二甲酸乙二醇酯（长1 cm，直径2 mm）为广州军区总医院耳鼻喉科提供。利用有机溶剂注模法研制羟基磷灰石/聚乳酸-三亚甲基碳酸酯复合材料。
方法：选择SD大鼠60只，分别将聚对苯二甲酸乙二醇酯、羟基磷灰石/聚乳酸-三亚甲基碳酸酯复合材料植入20只大鼠背部左、右肌肉内；分别将羟基磷灰石颗粒、聚乳酸-三亚甲基碳酸酯植入20只大鼠背部左、右肌肉内；其余20只大鼠进行同样的手术，但不植入任何材料作为对照。
主要观察指标：术后分别于14，30，60，90 d取材料及周围组织和鼠心、肝、肾标本，进行大体标本观察和组织学检查。
结果：60只大鼠均进入结果分析。羟基磷灰石、聚乳酸-三亚甲基碳酸酯材料界面的炎性反应较重，聚乳酸-三亚甲基碳酸酯可在体内缓慢降解；聚对苯二甲酸乙二醇酯、羟基磷灰石/聚乳酸-三亚甲基碳酸酯复合材料界面无明显炎症反应，与周围组织结合紧密，组织可长入材料的微孔内，两者在观察时间内无明显降解吸收。4种材料均对局部组织及全身重要器官(心、肝、肾)无严重损害。
结论：羟基磷灰石/聚乳酸-三亚甲基碳酸酯复合材料的生物相容性和安全性与聚对苯二甲酸乙二醇酯相当，优于羟基磷灰石、聚乳酸-三亚甲基碳酸酯材料。
关键词：软腭植入；羟基磷灰石；聚乳酸-三亚甲基碳酸酯；鼾症；生物材料

汪建，付晓燕，熊敏，张余.羟基磷灰石/聚乳酸-三亚甲基碳酸酯软腭植入材料的生物相容性与安全性[J].中国组织工程研究与临床康复，2008，12(19):3609-3612 [www.zglckf.com/zglckf/ejournal/upfiles/08-19/19k-3609(ps).pdf]

中图分类号: R318
文献标识码: B
文章编号: 1673-8225
(2008)19-03609-04

Biocompatibility and safety of hydroxyapatite and poly (d,l-lactide-co-trimethylene carbonate) complex palatal implant material

BACKGROUND:Currently commonly used palatal implant material is polyethylene terephthalate (PET), but its clinical application is restricted due to its high price, mild rejection reaction and uncertain long-term biological effect.
OBJECTIVE: To evaluate the biocompatibility and safety of hydroxyapatite and poly (d,l-lactide-co-trimethylene carbonate)complex (HA-P) palatal implant material versus PET.
DESIGN, TIME AND SETTING: The randomized controlled animal experiment was performed between October 2006 and May 2007 at Biological and Artificial Bone Laboratory, Department of Medical Experiment, General Hospital of Guangzhou Military Area Command of Chinese PLA and Experimental Animal Center of Guangzhou Medical University, Guangzhou, Guangdong Province，China.
MATERIALS: Hydroxyapatite (HA) was obtained from Biological and Artificial Bone Laboratory, Department of Medical Experiment, General Hospital of Guangzhou Military Area Command of Chinese PLA (China). Poly (d,l-lactide-co-trimethylene carbonate) (DL-TMC) was produced by Jinan Daigang Biotechnology Co. Ltd. (China). PET, 1 cm in length and 2 mm in diameter, was provided by Department of Otolaryngology, General Hospital of Guangzhou Military Area Command of Chinese PLA (China). HA-P was made using organic solvent injection mould.
METHODS：Sixty Sprague-Dawley rats were selected for the experiment. Twenty rats were implanted PET and HA-P into left and right back muscles, respectively. Twenty rats were implanted HA and DL-TMC into left and right back muscles, respectively. Another twenty rats left were performed the same operation but implanted nothing as control.
MAIN OUTCOME MEASURES: At 14, 30, 60, 90 days postoperation, implanted materials, surrounding tissues, rat heart, liver and kidney specimens were observed through gross specimen observation and histological examination.
RESULTS：All 60 rats were involved in result analysis. Inflammatory reactions of HA and DL-TMC were relatively severe and DL-TMC could degrade in vivo slowly. There was no significant inflammatory reaction of PET and HA-P. They combined closely with surrounding tissue and tissue could grow into moicropores of material. PET and HA-P had no significant degradation during observation period. HA, PET, HA-P and DL-TMC were not harmful to local tissue and systemic organs.
CONCLUSION：The biocompatibility and safety of HA-P was similar to PET, but better than HA and DL-TMC.

Wang J, Fu XY, Xiong M, Zhang Y.Biocompatibility and safety of hydroxyapatite and poly (d,l-lactide-co-trimethylene carbonate) complex palatal implant material.Zhongguo Zuzhi Gongcheng Yanjiu yu Linchuang Kangfu 2008;12(19):3609-3612
[www.zglckf.com/zglckf/ejournal/upfiles/08-19/19k-3609(ps).pdf]

鼾症治疗方法主要有保守治疗和手术治疗。近年来采用微创手术治疗阻塞性睡眠呼吸暂停综合征已在临床上得到广泛应用[1]。Walker等[2]于2002年提出了又一种新的微创介入治疗方法——Pillar支架植入术，该系统在微创条件下将异体材料植入软腭，在不改变原有形态的前提下达到加强软腭和减少其扑动的作用，并诱导机体产生排异反应，使局部纤维化、瘢痕化，包裹植入体。为了研制理想的软腭系统植入材料，本实验室选择近年来国内外研究比较活跃的两种材料——羟基磷灰石和聚乳酸-三亚甲基碳酸酯，利用有机溶剂注模法研制出了一种新型的软腭系统植入材料，在已对其细胞和全身急性毒性、溶血性、致敏性和热源性质进行评价的基础上[3-4]，本文通过体内植入试验对其生物相容性进行了进一步的探讨。

设计：随机分组设计、动物对照实验。
时间及地点：实验于2006-10/2007-05在解放军广州军区总医院医学实验科生物人工骨实验室及广州医学院实验动物中心完成。
材料：清洁级SD大白鼠60只，雌雄不限，体质量180~220 g，由广州中医药大学实验动物中心提供（动物合格证号：0020381）。

实验过程：
羟基磷灰石、聚乳酸-三亚甲基碳酸酯复合材料的制备：m(羟基磷灰石)∶ m(聚乳酸-三亚甲基碳酸酯)=1∶1，其中羟基磷灰石经研磨过筛后选择孔径为0.5 mm的小颗粒，高温高压消毒处理;聚乳酸-三亚甲基碳酸酯37 ℃环氧乙烷消毒灭菌12 h。按配方将称量好的聚乳酸-三亚甲基碳酸酯加入到三氯甲烷中，密封静置12 h，配成浓度为20%的溶液。聚乳酸-三亚甲基碳酸酯完全溶解后，将定量的羟基磷灰石颗粒加入到溶液中，充分搅拌，直至肉眼见羟基磷灰石颗粒均匀分散于聚乳酸-三亚甲基碳酸酯溶液中，此时混合物呈凝胶状[5]。将此混合物倾注于本实验自行设计的直径2 mm，长10 cm的圆柱形模具中，置于37 ℃恒温真空干燥箱中任三氯甲烷挥发24 h，混合物自行固化。将复合材料取出，切割成长1 cm，直径2 mm。以上操作均在超净工作台完成。
动物分组：SD大鼠脊柱两侧剪毛，常规麻醉。在大鼠脊柱两侧约1 cm处等距离作长约1 cm切口，用组织钳钝性分离皮下组织和筋膜，按肌纤维方向分离椎旁肌肉组织，分别将聚对苯二甲酸乙二醇酯、羟基磷灰石/聚乳酸-三亚甲基碳酸酯复合材料植入20只大鼠背部左、右肌肉内；分别将羟基磷灰石颗粒、聚乳酸-三亚甲基碳酸酯植入20只大鼠背部左、右肌肉内；20只大鼠进行同样的手术，但不植入任何材料作为对照。术毕缝合肌筋膜和皮肤切口。乙醇溶液擦拭后包扎。术后用乙醇溶液消毒切口处，1 d/次，5 d拆线[6]。术后全部动物分笼喂养。
主要观察指标：每组分别于术后14，30，60，90 d麻醉状态下处死大鼠，每组随机选取，5只/次，切取材料及周围组织和鼠心、肝、肾标本，进行大体标本观察（包括形状、质地和颜色等），经40 g/L甲醛溶液固定和苏木精-伊红染色后进行组织学检查，包括周围组织受损情况、炎症反应及组织修复等。
设计、实施、评估者：均为第一、二、三作者，全部经系统培训，未实行盲法评估。

2.1 实验动物数量分析实验共选取SD大鼠60只，所有实验动物术后均成活，进食良好，活动正常，全部纳入结果分析。
2.2 材料与周围组织及大鼠心、肝、肾大体标本观察
术前：聚对苯二甲酸乙二醇酯，外形呈圆柱状，白色，质地中等硬度且富有弹性，表面可见编织样多孔结构。复合材料，外形呈圆柱状，黄白色，质地均匀且柔韧而有弹性，肉眼见外表尚光滑，羟基磷灰石颗粒均匀的嵌在复合材料中。羟基磷灰石，外形呈颗粒状，乳白色，质硬而脆，表面可见均匀的空隙。聚乳酸-三亚甲基碳酸酯，外形呈圆柱状，乳白色略带淡黄，质地柔韧。
术后14 d：材料外观形态和体积与植入前无明显变化，其周围组织有点状充血，聚乳酸-三亚甲基碳酸酯较其他3种材料充血明显，材料周围有纤维状物增生，但未见成纤维囊包裹。
术后30 d：材料周围可见一层薄而半透明的结缔组织被膜包裹，材料与周围组织黏连，易剥离，周围组织充血反应较前减轻，少量瘢痕形成。
术后60 d：材料外层包裹的纤维膜逐渐增厚，周围组织充血反应减轻，瘢痕组织增多。聚乳酸-三亚甲基碳酸酯体积较前缩小，复合材料表面稍粗糙不平。
术后90 d：材料被致密纤维囊包裹，聚对苯二甲酸乙二醇酯、复合材料和羟基磷灰石与组织紧密结合，纤维组织已长入材料内，不易分离；聚乳酸-三亚甲基碳酸酯体积较前又缩小，材料仍完整，边角变圆钝。
各个观察时间局部均无化脓及溃烂现象。各组大鼠心、肝、肾外形正常，表面颜色正常。
2.3 材料与周围组织及大鼠心、肝、肾组织学观察术后14 d：复合材料、聚对苯二甲酸乙二醇酯、羟基磷灰石、聚乳酸-三亚甲基碳酸酯4种材料周围可见较多的炎性细胞浸润，以中性粒细胞和淋巴细胞为主，并可见少量巨噬细胞，纤维母细胞增生，并分泌胶原纤维，但聚乳酸-三亚甲基碳酸酯较前三者充血明显，肌纤维水肿，间隙增宽；血管扩张、充血。
术后30 d：复合材料、聚对苯二甲酸乙二醇酯、羟基磷灰石、聚乳酸-三亚甲基碳酸酯4种材料周围组织局部呈慢性炎症反应状态，炎性细胞数量减少，巨噬细胞较14 d时增多，可见较多量成纤维细胞。血管增生、扩张，呈充血状态。纤维组织增生，浸润的白细胞以淋巴细胞为主，复合材料周围可见纤维母细胞、纤维细胞与胶原纤维。聚对苯二甲酸乙二醇酯周围可见致密纤维囊腔的形成。羟基磷灰石可见纤维组织包绕材料周围，并长入其孔洞内。聚乳酸-三亚甲基碳酸酯周围血管内大量红细胞集聚，见图1。

术后60 d：复合材料、聚对苯二甲酸乙二醇酯、羟基磷灰石周围组织炎性细胞数量进一步减少，以淋巴细胞为主，胶原纤维致密；聚乳酸-三亚甲基碳酸酯周围仍见充血状态，见图2。

术后90 d：材料周围组织炎症反应呈典型慢性期改变，以纤维组织增生和组织修复为主。局部组织见大量成纤维细胞增生。周围仅见极少量的淋巴细胞。复合材料周围可见明显的纤维组织增生；聚对苯二甲酸乙二醇酯可见稳定纤维囊的形成；羟基磷灰石可见纤维组织增生，组织长入材料中，聚乳酸-三亚甲基碳酸酯周围仍见充血，见图3。对照组可见瘢痕组织生长。

各观察时间点的切片未见组织变性、坏死和异常增生。各组大鼠心、肝、肾组织细胞形态基本正常，无明显肿胀变性和坏死。

20%打鼾患者是由于上腭和其他因素造成，如悬雍垂、舌、扁桃腺或鼻道阻塞[7]。本实验基于目前已广泛应用临床的Pillar支架植入术的原理，即改变软腭结构和其对气流的反应。3个埋入软腭的小植入物使软腭轻微变得坚硬，引起上腭运动的临界气流速度随之增加，打鼾得以纠正；也利用了机体对植入物的反应，植入物周围的组织会比原来变得坚硬，进一步使软腭硬度增加，更有效治疗打鼾[8]。本实验新研制的复合材料，羟基磷灰石颗粒均匀的嵌在复合材料中。因羟基磷灰石高孔隙率和三维多孔结构，随着聚乳酸-三亚甲基碳酸酯的缓慢降解，植入物周围组织逐渐长入羟基磷灰石微孔中，使周围组织硬度增加[9]；同时复合材料植入体内，引起周围组织的排异反应，呈慢性炎症反应，瘢痕组织形成，进一步使软腭组织硬度增加，更有效的治疗打鼾。
炎症反应是机体对局部创伤的防御性应答[10]。本试验用“植入试验”的方法测试材料对织以及全身重要器官的影响[11]。结果表明聚乳酸-三亚甲基碳酸酯植入14~30 d，周围组织呈明显充血状态，可能是其降解产物乳酸呈酸性，引起局部组织pH值下降,同时其不能被组织及时代谢、运送而引起炎性反应；同时也可能为手术区组织被切割，出血、细胞碎裂、坏死后释放炎症介质所引起的反应。羟基磷灰石植入14~30 d，周围组织有明显的炎性反应，材料有碎裂现象，可能是材料在组织中因水解释放而引起的。复合材料、聚对苯二甲酸乙二醇酯具有良好的生物相容性[12]，植入14 d炎性细胞浸润，主要为淋巴细胞和浆细胞,并有较多血管组织生成。术后30 d组织形成,由于复合材料和聚对苯二甲酸乙二醇酯材料细密孔隙，所以纤维组织可长入小孔内,同时有新生血管长入，异物反应极轻。复合材料中的羟基磷灰石中的少量碳酸钙成分是一种弱碱性物质，理论上可以中和聚乳酸的酸性产物，从而避免或者减轻该产物积聚所导致的无菌性炎症，提高材料的安全性。大体观察见材料与受区周围组织紧密结合而无明显界面,非常稳定,具有良好的生物相容性[13]。所以复合材料与聚对苯二甲酸乙二醇酯组织学变化很相近，可以替代目前国外昂贵材料聚对苯二甲酸乙二醇酯。聚对苯二甲酸乙二醇酯植入30 d，材料周形成“围墙”样的囊状包裹[14-15]。
本实验组织学观察表明，炎症反应总的来说比较局限，未向周围扩散，属局部反应，4种材料周围组织己处于明显修复状态，有大量肉芽组织及瘢痕组织形成，大量巨噬细胞聚集局部吞噬异物[16]，其自身修复过程正常[17]。
植入材料置入体内后，心、肝、肾的形态和功能受到损害，会给机体带来不可估量的损失[18]。这是可降解吸收性生物材料应用于临床前必须考虑和解决的[19-20]。本实验的结果显示，以上脏器无明显损害，只是有不同程度的血管扩张充血反应，为炎症反应的结果。
当前所采用的植入材料聚对苯二甲酸乙二醇酯价格昂贵，且有轻度排斥反应，远期的生物学效应也尚不肯定。本实验基于治疗鼾症的原理上，研制出一种新的生物相容性良好的复合材料，将有望应用于临床，取代聚对苯二甲酸乙二醇酯，既在一定程度上减轻患者的经济负担，又能有效的减轻打鼾。实验将进一步将该材料应用于鼾症的毕戈犬，进一步证实该材料的临床应用性。

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